一种可注射的原位交联联合递释水凝胶的制作方法

1.本发明属于植入体感染治疗的技术领域，特别涉及一种可注射的原位交联联合递释水凝胶。


背景技术：

2.植入体是全部或部分长期(30天以上)埋入体内的假体。通常需要配合进行广泛的清创、多次手术和长期系统的抗生素治疗。
3.如专利申请200680006126.3公开了用于通过在和待制备的植入体相一致的铸造模具中精密铸造钛合金而由该钛合金制备医疗植入体的方法。本发明提供采用β-钛合金、热等静压、固溶退火以及随后淬火。本发明还涉及采用精密铸造方法通过钛合金制备的相应医疗植入体。钛合金是β-钛合金，平均晶粒尺寸是至少0.3mm。本发明使得可以采用精密铸造方法由β-钛合金经济的制备对象。本发明由此使得可以将β-钛合金的有利性质，尤其是其优异的机械性质，和精密铸造方法提供的制备对象的优点结合起来。本发明使得可以由β-钛合金制备出通过传统锻造方法不可能(从经济上考虑)制备的形状复杂的植入体，比如髋关节假体的股骨部分(1)。
4.目前植入体手术的缺点是：1.创口大；2.花费高；3.效果不理想。
5.因此，亟需一种能够局部释放抗菌药物并且根除体内成熟的生物膜的替代策略来有效治疗术后感染。


技术实现要素：

6.为了克服上述问题，本发明提供一种可注射的原位交联联合递释水凝胶，该水凝胶能够局部释放抗菌药物并且根除体内成熟的生物膜的替代策略来有效治疗术后感染。
7.基于此，本发明是这样实现的：一种可注射的原位交联联合递释水凝胶，其特征在于该水凝胶是通过以下方法制得：步骤一，使用猪明胶和甲基丙烯酸酐合成甲基丙烯酰基明胶；将 10% (w/v) 的猪皮明胶溶于的50℃的磷酸盐缓冲溶液dpbs直到明胶完全溶解。在保持原有反应器温度和搅拌速度的同时，将马来酸酐ma加入明胶溶液中，在这个实验阶段，ma 的加入量从 0.25% 到 20% (v/v) 不等。
8.此外，甲基丙烯酸酐酯化的反应时间范围为在 50℃ 和 300 rpm 下，24 小时。
9.然后用额外的温 dpbs 稀释后（5 倍猪皮明胶溶液体积）在 40℃ 下连续搅拌 15 分钟以停止反应，得到甲基丙烯酰基明胶。
10.甲基丙烯酰基明胶gelma在 3500 rpm 下离心 3 分钟，回收上清液并用蒸馏水在 40 ℃ 下透析 4-5 天，使用12-14 kda 透析管，用于去除盐和生成的甲基丙烯酸。然后，使用蠕动泵（masterflex）连续用流速为 5 ml/min 的蒸馏水代替透析水。在此阶段，ph 为监测，当蒸馏水的 ph 值保持不变时，纯化过程停止。在透析阶段结束时，一些 gelma 批次被
调整到最终ph值为7.4，使用2mnahco3。将溶液冻干5天，生成白色多孔物质，然后储存在-80℃直至进一步产生泡沫。
11.步骤二，将抗生素与10%w/v甲基丙烯酰基明胶混合制备水相，水相中，控制溶液中抗生素的浓度为100ug/ml；步骤三，用含5%w/v表面活性剂span80的石蜡油制备油相；步骤四，水相和油相均注入精确控制的水油流量比0.3-0.4(油相100μl/min，水相30~40μl/min)形成乳液液滴；步骤五，用紫外光(64mw/cm2360-480nm)照射乳液液滴1分钟进行交联；步骤六，交联后，4000rpm/min离心5分钟后收集交联装载抗生素的微凝胶；步骤七，将可溶性淀粉在37℃的蒸馏水中完全溶解，用硫酸将ph调整至3.0来制备4.8%(wt)可溶性淀粉溶液；步骤八，以1：2(w/w)的比例加入naio4，将所得反应溶液置于冰浴中5小时；然后，用蒸馏水透析反应溶液4天，冻干后得到纯氧化淀粉；步骤九，将负载万古霉素的微凝胶加入到明胶溶液中，然后将溶葡球菌酶加入到氧化淀粉溶液中，使配制成最终的溶液中，万古霉素的浓度为100ug/ml，形成负载有万古霉素的微凝胶；将负载万古霉素的微凝胶加入到明胶溶液中（明胶溶液和微凝胶的加入比例为：9:1，即0.9g明胶溶液加入0.1g载药的微凝胶），然后将溶葡球菌酶加入到氧化淀粉溶液中（使配制成最终的溶液中，溶葡球菌酶浓度为10ug/ml）；将氧化淀粉溶液（2.5、5和10%wt）与明胶（20%wt）溶液以1：1（w/w）的比例在37c下混合1小时；在混合液中加入转谷氨酰胺酶，得到混合物，混合物中转谷氨酰胺酶的浓度为100ug-200ug/ml；步骤十，将混合物转移到预制的模具中，并以之前记录的凝胶时间进行原位交联，制备联合递释水凝胶。
12.本发明设计并制备了一种联合运输水凝胶/微凝胶来治疗植入体感染，该水凝胶在体外和体外中系统验证了制备的联合运输水凝胶/微凝胶的广谱抗菌活性、生物膜分散能力和控制释放的模式；此外，由于其生产工艺简单，合成成分可食用，所以本发明的水凝胶/微凝胶在临床中具有显著的治疗潜力及广泛的应用前景。
具体实施方式
13.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
14.本发明所用原料为：猪明胶（a型，300次【bloom】，94%）。
15.溶葡球菌酶来自：葡萄球菌。
16.曲鲁酰胺酶来自：豚鼠肝脏。
17.万古霉素氢氯化物和ii型胶原酶购自：西格玛-奥尔德里奇(美国密苏里州圣路易
斯）。
18.可溶性淀粉来自：【zhiyuan】化学有限公司（中国天津）。
19.4%多聚甲醛溶液购自：ems（中国武汉）。
20.大鼠crpelisa试剂盒、il-6大鼠elisa试剂盒、活/死活力/细胞毒性试剂盒、cck-8细胞活力试剂、alexafluor594-法烷苷和4
‘
、6-二氨基-2-苯林多(dapi)购自：赛默费雪科学公司(沃尔瑟姆，马塞诸塞州，美国)。
21.大鼠pctelisa试剂盒来自：aviva系统生物公司(圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。
22.胎牛血清(fbs)、杜尔贝克改良的eagle培养基、磷酸盐缓冲盐(pbs)、抗生素（青霉素/链霉素）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-edta)和mh琼脂平板均来自：碧云天（中国海门）。
23.大鼠间充质干细胞来自塞业生物（中国江苏）。
24.s.金黄色葡萄球菌(atcc25923)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(atcc43300)和大肠杆菌(atcc252922)来自：美国模式培养物保藏所(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。本发明的可注射的原位交联联合递释水凝胶的制备方法如下：1. 使用猪明胶和甲基丙烯酸酐合成甲基丙烯酰基明胶；将 10% (w/v) 的猪皮明胶溶于的50℃的磷酸盐缓冲溶液dpbs直到明胶完全溶解。在保持原有反应器温度和搅拌速度的同时，将马来酸酐ma加入明胶溶液中，在这个实验阶段，ma 的加入量从 0.25% 到 20% (v/v) 不等。
25.此外，甲基丙烯酸酐酯化的反应时间范围为在 50℃ 和 300 rpm 下，24 小时。
26.然后用额外的温 dpbs 稀释后（5 倍猪皮明胶溶液体积）在 40℃ 下连续搅拌 15 分钟以停止反应，得到甲基丙烯酰基明胶。
27.甲基丙烯酰基明胶gelma在 3500 rpm 下离心 3 分钟，回收上清液并用蒸馏水在 40 ℃ 下透析 4-5 天，使用12-14 kda 透析管，用于去除盐和生成的甲基丙烯酸。然后，使用蠕动泵（masterflex）连续用流速为 5 ml/min 的蒸馏水代替透析水。在此阶段，ph 为监测，当蒸馏水的 ph 值保持不变时，纯化过程停止。在透析阶段结束时，一些 gelma 批次被调整到最终 ph 值为 7.4，使用 2m nahco3。将溶液冻干 5 天，生成白色多孔物质，然后储存在
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80℃ 直至进一步产生泡沫。
28.2. 将抗生素与10%w/v甲基丙烯酰基明胶混合制备水相，水相中，溶液中抗生素的浓度为100ug/ml；3. 用含5%w/v表面活性剂span80的石蜡油制备油相；4. 水相和油相均注入精确控制的水油流量比0.3-0.4(油相100μl/min，水相30~40μl/min)形成乳液液滴；5. 用紫外光(64mw/cm2360-480nm)照射乳液液滴1分钟进行交联；6. 4000rpm/min离心5分钟后收集交联装载抗生素的微凝胶；7. 将可溶性淀粉在37℃的蒸馏水中完全溶解，用硫酸将ph调整至3.0来制备4.8%(wt)可溶性淀粉溶液；8. 以1：2(w/w)的比例加入naio4，将所得反应溶液置于冰浴中5小时;9. 用蒸馏水透析反应溶液4天，冻干后得到纯氧化淀粉；10.将万古霉素加入到微凝胶中（万古霉素加入，使配制成最终的溶液中，万古霉
素的浓度为100ug/ml），形成负载有万古霉素的微凝胶；将负载万古霉素的微凝胶加入到明胶溶液中（明胶溶液和微凝胶的加入比例为：9:1，即0.9g明胶溶液加入0.1g载药的微凝胶），然后将溶葡球菌酶加入到氧化淀粉溶液中（使配制成最终的溶液中，溶葡球菌酶浓度为10ug/ml）；11.将氧化淀粉溶液（2.5、5和10%wt）与明胶（20%wt）溶液以1：1（w/w）的比例在37c下混合1小时；12.在混合液中加入转谷氨酰胺酶（最终的溶液中转谷氨酰胺酶的浓度为100ug-200ug/ml），得到混合物；13.将混合物转移到预制的pdms（聚二甲基硅氧烷）模具中(直径8.0mm，厚度2.0mm)，并以之前记录的凝胶时间进行原位交联，制备联合运输水凝胶。
29.本发明使用猪明胶和甲基丙烯酸酐合成甲基丙烯酰基明胶，能够有效地控制甲基丙烯酰基明胶的成本，利用甲基丙烯酰基明胶混合制备的水相和石蜡油制备的油相制备微胶囊，微胶囊作为负载，氧化淀粉与明胶基于席夫碱反应，氧化淀粉可以在 20-37 ℃下在几分钟内与明胶交联，反应速度快。
30.本发明的优点是：1、创口小；2、能直接在原位交联发挥作用；3、通过体外和体外实验系统验证了制备的联合运输水凝胶/微凝胶的广谱抗菌活性、生物膜分散能力和控制释放的模式。
31.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。