一种多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜C的制备方法及其应用

一种多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜c的制备方法及其应用
技术领域：
：1.本发明涉及医药领域，特别是一种多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜c的制备方法及其应用。
背景技术：
：：2.恶性肿瘤已经成为当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症带来的经济负担和对社会发展的不良影响日益突显。目前临床上广泛使用的合成的抗癌药物普遍存在着毒副作用如脱发、贫血和胃肠不适等现象。因此加强抗癌治疗的研究，延长患者的生存期，改善患者的生活质量是药学工作者的当务之急。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，从中草药中寻找高效低毒的抗肿瘤活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗肿瘤药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。3.亚乎奴为防己科植物锡生藤属植物锡生藤(cissampelospareiral.var.hirsuta)的干燥全株，是傣族习用药材。在我国主要分布在广西、贵州、云南等地。消肿止痛，止血，生肌。具有消肿止痛、止血、生肌等功效。本发明首次从锡生藤属植物中发现了多氧齐墩果烷型三萜类化合物，且齐墩果烷型三萜类具有重要而广泛的生物活性，如心脏保护、肝保护、胃保护、抗炎、抗病毒、抗菌、抗寄生虫、止痛、促进伤口愈合、抗癌等。本发明所涉及的多氧齐墩果烷型三萜类化合物制备方法及其生物活性，迄今为止未见有公开报道。技术实现要素：4.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜c的制备方法及其应用，可有效解决从亚乎奴中制备多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜c，实现在制备抗肿瘤药物中的应用问题。5.本发明解决的技术方案是，一种多氧齐墩果烷型三萜类化合物亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)的制备方法，该化合物是从亚乎奴药材中分离得到，分子结构式为：[0006][0007]制备方法是：以亚乎奴药材30.2–50.7kg为原料，加入2–5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为92–95℃，每次提取时间为1–1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于4.8–9l的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、正丁醇萃取3次，每次4.8–9l，时间为3–5小时，回收溶剂，得石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位；将二氯甲烷萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:1、100:3、100:5、100:10、100:30、100:50、1:1、1:2的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用6.7–9.3l洗脱液，流速为10–15ml/min，每670–930ml体积为一流份，收集90个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比10:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–30、流份31–50、流份51–60、流份61–70、流份71–90，得到组份fr.1、组份fr.2、组份fr.3、组份fr.4、组份fr.5；组份fr.4经mci柱色谱，甲醇-水以体积比10:90、30:70、40:60、70:30、80:20梯度洗脱，每一梯度用300–500ml洗脱液，流速为20–35ml/h，每一洗脱梯度为一流份，收集5个亚组份fr.4-1、fr.4-2、fr.4-3、fr.4-4、fr.4-5；亚组份fr.4-3经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为10:1、8:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用30ml–55ml洗脱液，流速为3–5ml/min，每30–55ml体积为一流份，收集7个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用gf254薄层板，分别以体积比5:3的石油醚-丙酮和体积比20:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1-2、流份3、流份4、流份5、流份6–7，得到组份fr.4-3-1、组份fr.4-3-2、组份fr.4-3-3、组份fr.4-3-4、组份fr.4-3-5；将组份fr.4-3-3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为50:50的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为ymc-packods-a，流速为6ml/min，收集保留时间为57min的色谱峰，回收溶剂，得亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)。[0008]本发明方法制备的亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)具有抗癌活性，实现在制备抗癌药物中的应用。[0009]本发明原料丰富，制备方法易操作，可有效从亚乎奴制备亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)，该化合物具有抗癌活性，可有效用于制备抗癌药物，开拓了亚乎奴的新用途，有显著的经济和社会效益。4、组份fr.4-3-5；将组份fr.4-3-3经制备型高效液相色谱纯化，以体积比为50:50的乙腈-水混合溶剂系统洗脱，色谱柱为ymc-packods-a，流速为6ml/min，收集保留时间为57min的色谱峰，回收溶剂，得亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)。[0030]本发明实施例1-4所述方法制备的化合物经ir、核磁共振光谱(1h-nmr、13c-nmr、dept、hsqc、hmbc、h-hcosy、noesy)及高分辨率质谱(hr-esi-ms)等光谱学技术鉴定，均为相同结构的亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)，有关图谱见图2-8所示，实验表明，本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物对人非小细胞肺癌细胞a549、人肝癌细胞smmc-721、人乳腺癌细胞mcf-7、人结肠癌细胞sw480具有细胞毒活性，可有效用于制备抗癌药物，有关资料如下：[0031]一、化合物的结构鉴定[0032]白色不定形粉末，易溶于二氯甲烷。(c0.01,meoh)。hr-esi-ms给出准分子离子峰m/z:[m na] 509.3242(计算值为509.3243)，确定其分子式为c30h46o5，不饱和度为8；红外光谱显示存在内酯羰基(1770cm-1)、羟基(3371cm-1)。1hnmr谱(table1)给出一个氧代亚甲基氢信号δ3.85(1h,d,j＝11.1hz,h-28)、3.40(1h,d,j＝11.1hz,h-28),三个氧代次甲基氢信号δ3.16(1h,dd,j＝11.2,4.1hz,h-3)、4.21(1h,dd,j＝11.8,3.6hz,h-16)、4.90(1h,d,j＝5.3hz,h-22)，六个季碳甲基氢信号δ0.98(9h,s,me-23,me-25,me-26),0.79(3h,s,me-24),1.17(6h,s,me-27,me-30)，以及1个烯氢信号δ5.44(1h,s,h-12)，提示该化合物具有olean-12-ene五环三萜骨架。13c-nmr(见table1)和dept谱共给出30个碳原子,包括6个甲基、9个亚甲基[包括一个氧代的δ64.2(c-28)]、7个次甲基[包括三个氧代的δ79.6(c-3)、67.8(c-16)、80.1(c-22)，一个烯碳δ126.7(c-12)]、8个季碳[包括一个烯碳δ140.8(c-13)]。以上数据表明，该化合物为多氧取代齐墩果烷型三萜类化合物。根据hmbc谱中h-3(δ3.16)与c-2(δ27.9)、c-4(δ39.9)、c-24(δ16.4)，h-16(δ4.21)与c-15(δ35.3)、c-17(δ44.2)、c-28(δ64.2)，h-22(δ4.90)与c-17(δ44.2)、c-21(δ35.7)、c-28(δ64.2)的远程相关，三个羟基分别连接在c-3(δ79.6)、c-16(δ67.8)以及c-22(δ80.1)位。根据高分辨质谱推测结构中存在8个不饱和度，五个环、一个双键、一个羰基，共计占去7个不饱和度，结合剩下的一个不饱和度，推测结构中还存在一个环。由h-22(δ4.90)与c-29羰基的(δ185.2)的hmbc远程相关，结合红外光谱中给出的内酯羰基碳信号1770cm-1，提示c-22位上的羟基与c-29位上的羧基形成了内酯。因此，该化合物的结构确定为3β,16β,22α,28-tetrahydroxyolean-12‑ꢀene-22α,29-lactone,命名为亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)：[0033][0034]table1.nmr(500mhz,cd3od)assignmentsforcissatriterpenoidc.[0035]no.δhδcno.δhδc11.66,m；1.01,m39.9164.21,dd(11.8,3.6)67.821.65,m；1.58,m27.91744.233.16,dd(11.2,4.1)79.6182.60,dd(11.4,10.0)40.9439.9191.85,m；1.61,m40.550.79,d(11.4)56.72040.661.60,m；1.46,m19.4212.45,d(12.2)；2.05,dd(11.9,5.1)35.771.57,m；1.43,m34.3224.90,d(5.3)80.1840.6230.98,s28.791.54,m48.1240.79,s16.41038.1250.98,s16.2111.92,m24.6260.98,s17.5125.44,brs126.7271.17,s25.613140.8283.85,d(11.1)；3.40,d(11.1)64.21445.129185.2151.90,m；1.35,m35.3301.17,s21.2[0036]二、细胞毒活性试验[0037]1.实验材料[0038]人肝癌细胞smmc-7721由中国医学科学院药物研究所提供。人肺癌细胞a549、人乳腺癌细胞mcf-7、人结直肠癌sw-480，购自attc。[0039]2.mts法[0040]对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μl(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％co2温箱中培养。次日，给药组设5个剂量组(5μm、10μm、20μm、30μm、50μm)，每组至少设3个平行孔，置37℃、5％co2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加20μl(1mg/ml)mts溶液(培养基配置)，37℃孵育4小时。用酶标仪，在检测波长492nm条件下测定光密度值(od)。ic50值通过reed-muench方法计算。[0041]实验结果[0042]通过mts法采用人肺癌细胞a549、人肝癌细胞smmc-7721、人乳腺癌细胞mcf-7、人结直肠癌sw-480对亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)进行细胞毒活性测试，结果表明，ic50值分别为17.55、34.74、19.77、30.39μm。[0043]本发明通过反复大量的实验证实，多氧齐墩果烷型三萜类化合物由于母核及其所连接取代基的位置、数目、种类的不同，其细胞毒活性会存在很大的差异，本发明方法制备出的亚乎奴三萜c(cissatriterpenoidc)对人肺癌细胞a549、人肝癌细胞smmc-7721、人乳腺癌细胞mcf-7、人结直肠癌sw-480具有细胞毒活性，具有制备临床上抗癌药物的前景，开拓了亚乎奴的药用价值，并为制备抗癌药物提供了技术支持，特别是实现制备抗人肺癌细胞a549、人肝癌细胞smmc-7721、人乳腺癌细胞mcf-7、人结直肠癌sw-480药物中的应用，是制备抗癌药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。当前第1页12当前第1页12