一种利用氘带内标物检测食品中爱德万甜的方法与流程

1.本发明属于食品检测领域，涉及一种检测方法，尤其涉及一种利用氘带内标物检测食品中爱德万甜的方法。


背景技术：

2.爱德万甜(advantame，n-〔n-〔3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基-l-a-天冬氨酰〕-l-苯丙氨酸-1-甲酯〕)是一种超高倍甜味剂，是阿斯巴甜的衍生产品。爱德万甜有和阿斯巴甜相似的感官味道，但其甜度相当于阿斯巴甜的100倍，蔗糖20000倍甜度，而其苦味和酸味感非常轻微。因此，爱德万甜可替代糖类(蔗糖、葡萄糖、果糖等)，用于替换现有的应用于食品工业中的高倍甜味剂，是一种多用途、低能量的新型甜味剂。
3.现如今，国内外针对爱德万甜的相关检测主要有液相色谱法和液相色谱串联质谱法，针对毒理学相关研究使用较多，也有针对食品中爱德万甜标准检测方法的文献报道，但是都采取外标法定量。
4.gb2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中爱德万甜限量涉及烘焙食品、调味料、糖果等多种食品，液相色谱-串联质谱的检测中，基质效应(matrix effect，me)的存在会影响电喷雾离子源的离子化效率，导致被分析物的信号强度有不同程度的增强或减弱，从而影响分析结果的准确性。针对冷冻饮品、烘焙食品和复合调味料中进行了基质效应考察，为评价基质效应，将不同基质样品按预定的前处理方法进行提取、净化和定容后获得空白基质提取液后，分别使用该提取液和定容液将爱德万甜标准储备液配制成1μg/l、5μg/l、20 μg/l、50μg/l、100μg/l、250μg/l的系列标准工作液，在相同条件下进行检测，分别绘制有机溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线，采用基质匹配标准曲线斜率和有机溶剂标准曲线斜率之比(k)来评价基质效应：若k值介于0.9～1.1之间，基质效应不明显，k大于1.1时为基质增强效应，小于0.9则是基质抑制效应。结果表明，不同基质间爱德万甜的基质效应差异较大，具体结果见图1。基质效应不同，如果采用外标法不能够准确定量，如果采用基质曲线，因为每个厂家的配方不一样，特别是烘焙食品和调味料，导致基质不完全一样，也不能准确定量。
5.氘带内标法很好地解决了质谱检测器中基质的影响，以满足不同复杂基质的检测要求，定量准确。
6.在国内外检测标准和文献中，未见利用氘带内标检测食品中爱德万甜的方法。因此，准确检测食品中爱德万甜的含量，有必要建立利用氘带内标检测食品中爱德万甜的方法。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种利用氘带内标检测食品中爱德万甜的方法，该方法具有准确、高效的优点。
8.本发明采用的技术方案为：
9.一种利用氘带内标物检测食品中爱德万甜的方法，检测步骤如下：
10.(1)配制标准溶液
11.①
爱德万甜标准储备液：称取爱德万甜标准物质10mg(精确至0.01mg)，于10ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到1mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存，保存期为6 个月。所述的爱德万甜作为外标物。
12.②
爱德万甜标准中间溶液：将爱德万甜标准储备液1.00ml置于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为10μg/ml的标准中间溶液(1)，4℃下避光保存，保存期为1个月。将爱德万甜标准储备液100μl置于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为 1μg/ml的标准中间溶液(2)，4℃下避光保存，保存期为1个月。
13.③
爱德万甜-d3标准储备溶液：将1mg爱德万甜-d3标准物质用1ml甲醇溶解，得到1 mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存，保存期为6个月。所述的爱德万甜-d3作为氘带内标物。
14.④
爱德万甜-d3标准中间溶液：将爱德万甜-d3标准储备液1.00ml置于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为10μg/ml的标准中间溶液，4℃下避光保存，保存期为 1个月。
15.⑤
标准工作溶液:分别移取爱德万甜标准中间溶液(2)10μl、100μl、500μl、1ml、 2ml、5ml，和爱德万甜-d3标准中间溶液10μl(内标作为基准)，置于10ml容量瓶中乙腈定容，分别得浓度为1.0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml爱德万甜系列标准工作溶液，每个标准工作溶液还有爱德万甜-d3 10ng/ml。
16.(2)样品的前处理方法
17.准确称取样品2g(精确至0.01g)，置于50ml具塞离心管中，加入200μl浓度为10μg/ml 的爱德万甜-d3标准中间溶液，加入3ml水，涡旋振荡30s，加入2g nacl后，加入20ml乙腈，以12000r/min离心3min，取2ml乙腈层于离心管中，加入50mg c
18
，涡旋1min，以12000r/min 离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪分析。
18.(3)液相色谱-串联质谱分析参考条件
19.①
色谱参考条件
20.a)色谱柱：c
18
柱，4.6mm
×
50mm，2.7μm；
21.b)流动相：a：水，b：乙腈，梯度洗脱；
22.c)流速：0.35ml/min；
23.d)柱温：30℃；
24.e)进样量：2μl；
25.梯度洗脱程序见表1。
26.表1梯度洗脱程序
27.时间/min流动相a/％流动相b/％09370.59376653575958595
8.193710937
28.②
质谱参考条件离子源：电喷雾离子源(esi)；
29.检测方式：多反应监测(mrm)；
30.扫描方式：正离子模式；
31.离子化电压(is)：5500v；
32.雾化气(gas1)：50psi；
33.辅助气(gas2)：50psi；
34.气帘气压力(cur)：35psi；
35.雾化温度(tem)：500℃。
36.其他质谱参数见表2。
37.表2化合物定性、定量离子和质谱分析参数
[0038][0039]
*
定量离子对。
[0040]
(5)定性判定
[0041]
5.1)按照高效液相色谱-串联质谱条件测定步骤(1)
⑤
得到的爱德万甜系列标准工作溶液, 得到系列标准溶液中爱德万甜的色谱保留时间及定量离子对和定性离子对色谱峰，以定量离子对丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录标准工作溶液中爱德万甜的相对离子丰度。
[0042]
5.2)再按照高效液相色谱-串联质谱条件测定样品，得到样品中爱德万甜相应的色谱峰。其中，测定样品过程中高效液相色谱-串联质谱条件与5.1)相同。
[0043]
样品中应呈现爱德万甜定量离子对和定性离子对的色谱峰，色谱峰保留时间与标准溶液中爱德万甜色谱峰保留时间一致(变化范围在
±
2.5％之内)；并且相对离子丰度与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表3规定范围，则可以判定样品中存在爱德万甜。
[0044]
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0045]
相对丰度(％)最大允许偏差(％)k＞50％
±
2050％≥k＞20％
±
2520％≥k＞10％
±
30k≤10％
±
50
[0046]
(6)定量测定
[0047]
测定步骤(1)
⑤
得到的爱德万甜系列标准工作溶液中爱德万甜和爱德万甜-d3的
含量及相应的色谱峰面积，以爱德万甜和爱德万甜-d3浓度比为横坐标(x轴)，以爱德万甜和爱德万甜-d3峰面积比为纵坐标(y轴)，得氘带内标法标准曲线，如表4所示。样品溶液中爱德万甜的含量，从内标法标准曲线中确定。
[0048]
样品中爱德万甜含量，按公式(1)进行计算。
[0049][0050]
式中：x表示样品中爱德万甜的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；c表示从内标法标准曲线中读出的样品溶液中爱德万甜的浓度，ng/ml；v表示样品提取液体积，ml；m表示样品的质量，g。
[0051]
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。
[0052]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本方法具有准确、高效、快速的优点。
附图说明
[0053]
图1为现有技术中不同基质间爱德万甜的基质效应；
[0054]
图2为不含爱德万甜冷冻饮品空白样品mrm色谱图；其中，(a)为爱德万甜定量离子， (b)为爱德万甜定性离子，(c)为爱德万甜-d3子离子；
[0055]
图3为不含爱德万甜烘焙食品空白样品mrm色谱图；其中，(a)为爱德万甜定量离子， (b)为爱德万甜定性离子，(c)为爱德万甜-d3子离子；
[0056]
图4为不含爱德万甜调味料空白样品mrm色谱图；其中，(a)为爱德万甜定量离子，(b) 为爱德万甜定性离子，(c)为爱德万甜-d3子离子；
[0057]
图5为爱德万甜1ng/ml标液的mrm色谱图；其中，(a)为爱德万甜定量离子，(b)为爱德万甜定性离子，(c)为爱德万甜-d3子离子；
[0058]
图6为爱德万甜氘带内标法标准曲线示意图。
[0059]
图7为爱德万甜外标法标准曲线示意图。
具体实施方式
[0060]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0061]
实施例1冷冻饮品中爱德万甜的测定——氘带内标法
[0062]
(1)样品前处理
[0063]
准确称取样品2g(精确至0.01g)，置于50ml具塞离心管中，加入200μl浓度为10μg/ml 的爱德万甜-d3标准中间溶液，加入3ml水，涡旋振荡30s，加入2g nacl后，加入20ml乙腈，以12000r/min离心3min，取2ml乙腈层于离心管中，加入50mg c
18
，涡旋1min，以12000r/min 离心5min，取上清液，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0064]
(2)标准溶液及空白溶液的配制
[0065]
①
爱德万甜标准储备液：称取爱德万甜标准物质10mg(精确至0.01mg)，于10ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到1mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存，保存期为6 个月。
[0066]
②
爱德万甜标准中间溶液：吸取爱德万甜标准储备液1.00ml于100ml容量瓶中，用
甲醇稀释到刻度配制成浓度为10μg/ml的标准中间溶液(1)，4℃下避光保存，保存期为1个月。吸取爱德万甜标准储备液100μl于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为 1μg/ml的标准中间溶液(2)，4℃下避光保存，保存期为1个月。
[0067]
③
爱德万甜-d3标准储备溶液：将1mg爱德万甜-d3标准物质用1ml甲醇溶解，得到1 mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存，保存期为6个月。
[0068]
④
爱德万甜-d3标准中间溶液：吸取爱德万甜-d3标准储备液1.00ml于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为10μg/ml的标准中间溶液，4℃下避光保存，保存期为1个月。
[0069]
⑤
标准工作溶液:分别移取爱德万甜标准中间溶液(2)10μl、100μl、500μl、1ml、 2ml、5ml，爱德万甜-d3标准中间溶液10μl，于10ml容量瓶中乙腈定容，得浓度为1.0ng/ml、 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml爱德万甜系列标准工作溶液，每个标准工作溶液还有爱德万甜-d3 10ng/ml。
[0070]
(3)液相色谱-质谱/质谱法(hplc-ms/ms)测定
[0071]
将爱德万甜系列标准工作溶液和样品溶液分别注入hplc-ms/ms进行测定，建立校正曲线，内标法定量。
[0072]
①
色谱条件为：
[0073]
a)色谱柱：c
18
柱，4.6mm
×
50mm，2.7μm；
[0074]
b)流动相：a：水，b：乙腈，梯度洗脱；
[0075]
c)流速：0.35ml/min；
[0076]
d)柱温：30℃；
[0077]
e)进样量：2μl；
[0078]
梯度洗脱程序见表4。
[0079]
表4梯度洗脱程序
[0080]
时间/min流动相a/％流动相b/％09370.593766535759585958.193710937
[0081]
②
质谱参考条件
[0082]
离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0083]
检测方式：多反应监测(mrm)；
[0084]
扫描方式：正离子模式；
[0085]
离子化电压(is)：5500v；
[0086]
雾化气(gas1)：50psi；
[0087]
辅助气(gas2)：50psi；
[0088]
气帘气压力(cur)：35psi；
[0089]
雾化温度(tem)：500℃。
[0090]
其他质谱参数见表5。
[0091]
表5化合物定性、定量离子和质谱分析参数
[0092][0093]
*
定量离子对。
[0094]
得到的氘带内标法校正曲线如表6、图6所示。
[0095]
表6爱德万甜氘带内标法校正曲线
[0096][0097]
(4)加标回收率和重复性
[0098]
在不含爱德万甜的冷冻饮品中分别加入10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg三个水平的爱德万甜标准溶液室温静置30min后按上述步骤进行含量测定。每个添加水平平行测定6次。将测定结果与理论添加浓度进行比较，得到平均回收率及相对标准偏差，结果见表7。
[0099]
表7爱德万甜在冷冻饮品中的回收率及精密度(n＝6)
[0100][0101]
表7表明，三个加标水平爱德万甜的平均回收率范围为94.0％～102.5％，相对标准偏差范围为6.6％～8.7％，表明本实施例方法回收率与重复性均符合要求。
[0102]
(5)灵敏度
[0103]
以实际添加样品的最低检测限为检出限，本实施例中，爱德万甜在酒中的检出限为10 μg/kg。
[0104]
实施例2烘焙食品中爱德万甜的测定——氘带内标法
[0105]
(1)取待测烘焙食品样品，前处理方法、标准溶液的配制方法以及测定方法与实施例1 一致。得到的氘带内标法校正曲线如表6、图6所示。
[0106]
(2)加标回收率和重复性
[0107]
在不含爱德万甜的烘焙食品中分别加入10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg三个水平的爱德万甜标准溶液室温静置30min后按上述步骤进行含量测定。每个添加水平平行测定6次。将测定结果与理论添加浓度进行比较，得到平均回收率及相对标准偏差，结果见表8。
[0108]
表8爱德万甜在烘焙食品中的回收率及精密度(n＝6)
[0109][0110]
表8表明，三个加标水平爱德万甜的平均回收率范围为92.1％～105.4％，相对标准偏差范围为5.4％～8.7％，表明本实施例方法回收率与重复性均符合要求。
[0111]
(3)灵敏度
[0112]
以实际添加样品的最低检测限为检出限，本实施例中，爱德万甜在烘焙食品中的检出限为10μg/kg。
[0113]
实施例3调味料中爱德万甜的测定——氘带内标法
[0114]
(1)取待测调味料样品，前处理方法、标准溶液的配制方法以及测定方法与实施例1一致。得到的氘带内标法校正曲线如表6、图6所示。
[0115]
(2)加标回收率和重复性
[0116]
在不含爱德万甜的调味料中分别加入10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg三个水平的爱德万甜标准溶液室温静置30min后按上述步骤进行含量测定。每个添加水平平行测定6次。将测定结果与理论添加浓度进行比较，得到平均回收率及相对标准偏差，结果见表9。
[0117]
表9爱德万甜在调味料中的回收率及精密度(n＝6)
[0118][0119]
表10表明，三个加标水平爱德万甜的平均回收率范围为94.6％～104.2％，相对标准偏差范围为6.7％～9.1％，表明本实施例方法回收率与重复性均符合要求。
[0120]
(3)灵敏度
[0121]
以实际添加样品的最低检测限为检出限，本实施例中，爱德万甜在调味料中的检出限为10μg/kg。
[0122]
对比例1冷冻饮品中爱德万甜的测定——外标法
[0123]
(1)样品前处理
[0124]
除不进行“加入200μl浓度为10μg/ml的爱德万甜-d3标准中间溶液”，其他均与实施例1一致。
[0125]
标准溶液的配制方法以及测定方法与得到的内标法校正曲线如表6、图6所示。
[0126]
(2)标准溶液及空白溶液的配制
[0127]
①
爱德万甜标准储备液：称取爱德万甜标准物质10mg(精确至0.01mg)，于10ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，得到1mg/ml的标准储备液。4℃下避光保存，保存期为6 个月。
[0128]
②
爱德万甜标准中间溶液：吸取爱德万甜标准储备液1.00ml于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为10μg/ml的标准中间溶液(1)，4℃下避光保存，保存期为1个月。吸取爱德万甜标准储备液100μl于100ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度配制成浓度为 1μ
g/ml的标准中间溶液(2)，4℃下避光保存，保存期为1个月。
[0129]
(3)液相色谱-质谱/质谱法(hplc-ms/ms)测定
[0130]
将爱德万甜系列标准工作溶液和样品溶液分别注入hplc-ms/ms进行测定，建立校正曲线，外标法定量。
[0131]
色谱条件、质谱参考条件均与实施例1一致。
[0132]
其他质谱参数见表10。
[0133]
表10爱德万甜定性、定量离子和质谱分析参数
[0134][0135]
得到的外标法校正曲线如表11、图7所示。
[0136]
表11爱德万甜外标法校正曲线
[0137][0138]
(4)加标回收率和重复性
[0139]
在不含爱德万甜的冷冻饮品中分别加入10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg三个水平的爱德万甜标准溶液室温静置30min后按上述步骤进行含量测定。每个添加水平平行测定6次。将测定结果与理论添加浓度进行比较，得到平均回收率及相对标准偏差，结果见表12。
[0140]
表12爱德万甜在冷冻饮品中的回收率及精密度(n＝6)
[0141][0142]
表12表明，外标法测定三个加标水平爱德万甜的平均回收率范围为67.0％～80.2％，相对标准偏差范围为5.7％～9.3％，表明外标法测定爱德万甜回收率远低于氘带内标法测定的回收率94.0％～102.5％，氘带内标法更适用于基质复杂的样品中爱德万甜的测定。
[0143]
附录a化合物相关信息
[0144]
表a.1化合物中文名称、英文名称、cas号、分子式、相对分子质量
[0145]
序号中文名称英文名称cas号分子式分子量1爱德万甜advantame714229-20-6c
24h30
n2o7·
h2o476.522爱德万甜-d3advantame-d3 c
24h27
d3n2o7461.53
[0146]
附录a说明：爱德万甜和爱德万甜-d3的cas号、分子式、相对分子质量。
[0147]
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还
可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。