一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶及其制备方法
技术领域
1.本技术涉及hpv病毒抗体的领域，更具体地说，它涉及一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶及其制备方法。
背景技术：
2.hpv病毒一般指人乳头瘤病毒，是一种乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒a属的球形dna病毒。研究表明：hpv病毒能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，从而有可能引起寻常疣、尖锐湿疣、宫颈癌、肛门癌等疾病。近年来由于宫颈癌等发病率的增加，hpv病毒的防治越来越引起人们的关注。
3.卵黄免疫球蛋白（lgy），顾名思义是一种存在于鸟类、爬行动物和两栖类卵黄之中的抗体。卵黄免疫球蛋白与哺乳动物的lgg和lge具有同源性，在功能上具有等价性；并且卵黄免疫球蛋白还具有性能稳定，活性保持良好、产量高、成本低以及特异性强的优点。
4.因此，如何将卵黄免疫球蛋白应用于hpv病毒的防治已经成为了研究的热点。
技术实现要素：
5.为了获得一种具有有效抗hpv病毒能力的卵黄免疫球蛋白凝胶，本技术提供一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶及其制备方法。
6.第一方面，提供了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，采用如下的技术方案：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，由包括以下质量百分比的原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白
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0.100-2.000%褐藻酸盐
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0.100-2.000%碱法明胶
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0.100-2.000%卡波姆
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0.100-1.000%中和剂
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0.200-2.000%防腐剂
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0.100-2.000%聚乙二醇
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0.100-2.000%甘油
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1.00-10.00%纯化水
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余量。
7.通过采用上述技术方案，抗hpv卵黄免疫球蛋白为凝胶的核心成分，起到抗hpv病毒的作用。褐藻酸盐作为一种天然高分子材料，具有丰富的亲水基团，可在水中形成网络状的凝胶结构，并将抗hpv卵黄免疫球蛋白包裹于其中，起到组织载体的作用；由于褐藻酸盐为阴离子载体可减少传统阳离子载体的细胞毒性及免疫原性等问题。碱法明胶是一种等电点在ph 4.8-5.0的大分子亲水胶体，在人体内显负电性；而带负电的碱法明胶可以与病毒衣壳蛋白正电荷区域结合，从而对hpv病毒的组装起到阻止的作用，进而减少了hpv病毒侵入粘膜基底层的宿主细胞，阻断了hpv病毒的感染；并且碱法明胶同时具有良好的凝胶能力，其与褐藻酸盐相配合，通过两者分子链的缠绕，能够形成更加稳定的凝胶结构，从而使
包裹在凝胶内的抗hpv卵黄免疫球蛋白更好地发挥作用。另外，由于褐藻酸盐也显负电性，故其与碱法明胶相配合，有利于提高对病毒衣壳蛋白正电荷区域的结合度，从而有利于提高对hpv病毒感染的阻止作用。因此，通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，保证了抗hpv卵黄免疫球蛋白功效的发挥；且该凝胶本身也具有阻止hpv病毒组装的作用，从而进一步提高了卵黄免疫球蛋白凝胶的抗hpv病毒功效。
8.卡波姆不仅可以与褐藻酸盐和明胶相互作用，促进凝胶的形成；也能够覆盖于受损组织，起到隔离、阻断感染，修复粘膜损伤，促进愈合的作用。
9.在一个具体的可实施方案中，所述抗hpv卵黄免疫球蛋白由以下方法制成：取hpv抗原与佐剂混合后施用于蛋鸡，使其产生免疫球蛋白；取所述蛋鸡所产鸡蛋的卵黄液，分离出抗hpv卵黄免疫球蛋白；提纯、纯化所述抗hpv卵黄免疫球蛋白；冷冻干燥所述抗hpv卵黄免疫球蛋白，得到抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉。
10.通过采用上述技术方案，通过对蛋鸡施用hpv抗原使其产生免疫球蛋白，之后分离、提纯、纯化抗hpv卵黄免疫球蛋白，最后冷冻干燥；性能理想的抗hpv卵黄免疫球蛋白被制得。
11.在一个具体的可实施方案中，分离所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：将鸡蛋的卵黄液采用缓冲液稀释后与硫酸葡聚糖混合，待得到分层体系后取上层液。
12.在一个具体的可实施方案中，提纯所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：取无机盐溶液，与抗hpv卵黄免疫球蛋白进行盐析沉淀，收集沉淀物。
13.在一个具体的可实施方案中，纯化所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：将抗hpv卵黄免疫球蛋白上样到金属亲和柱中；先采用磷酸盐缓冲液洗柱，之后采用含乙酸盐和盐酸盐的混合缓冲液洗柱；合并洗脱液、干燥。
14.在一个具体的可实施方案中，所述中和剂为氨丁三醇或三乙醇胺。
15.在一个具体的可实施方案中，所述防腐剂为苯氧乙醇、尼泊金甲酯、spectrastat phl中的一种。
16.第二方面，提供了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，采用如下的技术方案：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，包括：取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水，混合均匀得到混合液；乳化混合液而得到抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶。
17.通过采用上述技术方案，抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶被顺利制成。
18.在一个具体的可实施方案中，所述乳化的方法为：对所述混合液加压使其通过膜孔径小于10μm的膜。
19.通过采用上述技术方案，采用微孔膜乳化的方式，有利于得到更加稳定、均一的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，从而能够更好的发挥抗hpv卵黄免疫球蛋白的功效。
20.综上所述，本技术至少具有以下有益技术效果之一：1、本技术所得卵黄免疫球蛋白凝胶对hpv病毒具有较高的效价，显示出有效的抗
hpv病毒的能力。
21.2、本技术通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的卵黄免疫球蛋白凝胶，有利于抗hpv卵黄免疫球蛋白更好的发挥作用；且凝胶本身具有阻止hpv病毒组装的作用，从而能够进一步提高卵黄免疫球蛋白凝胶的抗hpv病毒功效。
22.3、本技术采用微孔膜乳化的方式，相比于采用传统的搅拌乳化方式，有利于得到更加稳定、均一的卵黄免疫球蛋白凝胶，从而能够保证抗hpv卵黄免疫球蛋白更好地发挥功效。
具体实施方式
23.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
24.本技术的主要技术内容为：获取一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下质量百分比的原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白
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0.100-2.000%褐藻酸盐
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0.100-2.000%碱法明胶
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0.100-2.000%卡波姆
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0.100-1.000%中和剂
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0.200-2.000%防腐剂
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0.100-2.000%聚乙二醇
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0.100-2.000%甘油
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1.00-10.00%纯化水
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余量。
25.其中：在本技术中，抗hpv卵黄免疫球蛋白具体为抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉，通过以下五个步骤获得：1、取hpv抗原与佐剂混合后施用于蛋鸡上进行免疫，间隔7-21天后按上述方案再次进行免疫，重复若干次，使蛋鸡体内产生免疫球蛋白。
26.在本技术中，hpv抗原购自美国santa公司，且hpv抗原可为hpv6型抗原、hpv11型抗原、hpv16型抗原、hpv18型抗原、hpv31型抗原、hpv33型抗原、hpv35型抗原、hpv45型抗原、hpv52型抗原、hpv58型抗原、hpv65型抗原、hpv81型抗原、广谱hpv抗原（即上述各型抗原等质量比混合产物）、hpv16型-hpv18型混合抗原（等质量比混合）、hpv6型-hpv11型混合抗原（等质量比混合）或hpv52型-hpv58型-hpv31型-hpv33型-hpv35型-hpv45型抗原混合抗原（等质量比混合）；其中，优选为广谱hpv抗原。同时，hpv抗原的剂量为0.001-1.00mg，优选为0.025mg。
27.佐剂是一类可增强或改变机体对抗原的免疫应答的非特异性免疫增强剂。在本技术中，佐剂可为r71佐剂、弗式佐剂或铝盐佐剂。
28.蛋鸡在本技术中可为无特定病原（spf）蛋鸡也可为普通商用蛋鸡；鸡的种类可为白来亨鸡或星杂白鸡；其中优选为spf白来亨蛋鸡。
29.将抗原和佐剂施用于蛋鸡的方法在本技术中具体可为皮下给药、皮内给药、肌肉注射、静脉注射、点眼、滴鼻、喷雾、口服或基因枪注射；其中优选皮下给药。
30.在本技术中，免疫间隔时间为7-21天，其中优选为16天；免疫次数为2-5次，其中优
选为3次。
31.2、收集免疫后的蛋鸡的鸡蛋，并提取鸡蛋的卵黄液；之后将卵黄液中不水溶的脂肪及脂蛋白去除而分离出抗hpv卵黄免疫球蛋白。
32.在本技术中，分离抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法可为有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、天然胶法、中链脂肪酸法、去污剂分离法、水稀释法或超临界气体提取法；其中，优选为有机物沉淀法，其具体过程为：将卵黄液用缓冲溶液稀释后与硫酸葡聚糖混合，待分层后，取上层液，即为抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液。
33.3、对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行提纯。本技术中，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行提纯的方法可为超滤法、无机物沉淀法或有机溶剂沉淀法；其中，优选为无机物沉淀法，其具体过程为：采用无机盐溶液与抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液混合而发生盐析沉淀；之后收集沉淀物，得到提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白。上述无机盐溶液在本技术中可为硫酸钠、硫酸铵或氯化镁；其中，优选为硫酸铵。同时，为了能够沉淀充分，优选采用不同浓度的无机盐溶液对抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液进行多次盐析。
34.4、对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行纯化。本技术中，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行纯化的方法可为凝胶过滤层析法、离子交换层析法、亲硫层析法或固相金属离子亲和层析法；其中优选为固相金属离子亲和层析法，其具体过程为：将经提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白上样到金属亲和柱中；先后用磷酸盐缓冲液、含乙酸盐和盐酸盐的混合缓冲液洗柱；合并洗脱液，烘干至含水量小于75 %而得到纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
35.5、先将纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白进行预冻；再抽真空，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行真空冷冻干燥而得到抗hpv卵黄免疫球蛋白液冻干粉。本技术中，预冻的温度为-50
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25℃，预冻的时间为1-4h，真空冷冻干燥时的压力为60-90pa，真空冷冻干燥的时间为20-40h；其中，优选预冻的温度为-40℃，预冻的时间为4h，真空冷冻干燥时的压力为80pa，真空冷冻干燥的时间为30h。
36.抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的其他组成中：褐藻酸盐为天然多糖碳水化合物，是一种天然高分子材料，具有丰富的亲水基团，可在水中形成网络状的凝胶结构，并将抗hpv卵黄免疫球蛋白包裹于其中；从而，褐藻酸盐起到了构成核心成分的组织载体的作用；同时，褐藻酸盐为阴离子载体可减少传统阳离子载体的细胞毒性及免疫原性等问题。碱法明胶是一种等电点在ph 4.8-5.0的大分子亲水胶体；当体系的ph高于其等电点时，碱法明胶显负电性；带负电的碱法明胶可以与病毒衣壳蛋白正电荷区域结合，从而能够阻止hpv病毒的组装，减少了hpv病毒侵入粘膜基底层的宿主细胞，进而起到阻断hpv病毒感染的作用。同时，由于褐藻酸盐也带有负电，故其与碱法明胶相配合，能够提高对病毒衣壳蛋白正电荷区域的吸引和结合，从而提高了阻止hpv病毒组装的作用；而碱法明胶作为一种亲水胶体，本身也具有构成凝胶的能力；故其与褐藻酸盐相配合，通过两者分子链的缠绕，而形成了更加稳定的凝胶结构。因此，通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，且该凝胶本身也具有阻止hpv病毒组装的能力，从而进一步提高了卵黄免疫球蛋白凝胶抗hpv病毒的功效。
37.在本技术中，褐藻酸盐可以为褐藻酸钙或褐藻酸钠，其中，优选为褐藻酸钠；同时，褐藻酸钠1wt%粘度为150-1000cps（25℃，ndj-1,4#转子）范围内的任意值，其中，优选为400-800cps。
38.在本技术中，碱法明胶可为120冻力明胶、160冻力明胶、180冻力明胶、200冻力明胶、220冻力明胶或240冻力明胶；其中，优选为180冻力明胶。
39.卡波姆（carbopol）是由烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚等与丙烯酸聚合得到的丙烯酸交联树脂，是一种性质稳定、无刺激、无致敏性医用高分子材料。在本技术中，卡波姆能够覆盖于受损组织，可起到隔离、阻断感染，修复粘膜损伤，促进愈合的作用；同时被中和后的卡波姆还可作为凝胶基质，起到辅助凝胶的作用。本技术中的卡波姆可以为卡波姆934、卡波姆940或卡波姆941；其中，优选为卡波姆934。
40.中和剂用于调节体系的酸碱度，并有助于提高体系的凝胶性。本技术中的中和剂可以为有机中和剂或无机中和剂；有机中和剂，如氨丁三醇、三乙醇胺等；无机中和剂，如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钾等；进一步的，本技术的中和剂优选为氨丁三醇或三乙醇胺。
41.防腐剂用于提高凝胶体系的抗菌性和稳定性；在本技术中，防腐剂可以为苯氧乙醇、尼泊金甲酯或spectrastat phl。
42.聚乙二醇在凝胶体系中起到润滑、保湿、粘结的作用。本技术中的聚乙二醇可以为peg2000、peg4000或peg6000；其中，优选为peg4000。
43.上述抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法如下：s1、按上述配方取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水，并将这些组成混合均匀而得到混合液；控制纯化水的温度为30-50℃，优选为40℃。
44.s2、将混合液进行乳化而得到抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶。
45.在本技术中，乳化的方式可为机械搅拌乳化或微孔膜乳化；其中，优选为微孔膜乳化，该方法通过加压使混合液通过微孔膜的方式得到凝胶；采用该方法得到的凝胶颗粒的粒径更细也更均匀，凝胶结构更加稳定。上述方法中，微孔膜的孔径在本技术中小于10μm即可，其中，优选为5μm；加压的压力在本技术中为0.1-0.3mpa，其中，优选为0.2mpa。
46.实施例1：蛋鸡的hpv免疫1、取hpv6型抗原、hpv11型抗原、hpv16型抗原、hpv18型抗原、hpv31型抗原、hpv33型抗原、hpv35型抗原、hpv45型抗原、hpv52型抗原、hpv58型抗原、hpv65型抗原、hpv81型抗原（均购自美国santa公司），等质量比混合成广谱hpv抗原。
47.2、取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行初次免疫。
48.3、隔16天后，再次取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml，将两者混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行二次免疫。
49.4、再隔16天后，第三次取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml，将两者混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行三次免疫。
50.通过上述多次免疫，蛋鸡体内产生了数量可观的能抵抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白。
51.实施例2：抗hpv卵黄免疫球蛋白的分离1、收集实施例1所得蛋鸡的鸡蛋，用清水清洗鸡蛋表面后浸泡在新洁尔灭中2min；之后取出擦干，再用75%酒精擦拭一遍后自然晾干；之后在无菌条件下，用蛋黄分离器去除鸡蛋的卵白；之后刺破卵黄膜，收集卵黄液。
52.2、将100ml的卵黄液用500ml的pbs缓冲液稀释，得到卵黄稀释液。
53.3、向卵黄稀释液中加入21g硫酸葡聚糖（分子量为5w），常温下以100rpm转速搅拌2h而得到分层体系；取分层体系的上层液，即为抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液，而卵黄中不水溶的脂肪及脂蛋白则存在分层体系的下方而被去除；通过上述方法，抗hpv卵黄免疫球蛋白被从卵黄中分离了出来。
54.实施例3：抗hpv卵黄免疫球蛋白的提纯1、将实施例2所得的抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液100ml和浓度为10wt%的硫酸铵溶液100ml混合，以100rpm转速搅拌8h；收集沉淀物及上层液。
55.2、将步骤1所得上层液与等体积的浓度为36wt%的硫酸铵溶液混合，以100rpm转速搅拌8h；收集沉淀物。
56.3、合并两次沉淀物，得到提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
57.实施例4：抗hpv卵黄免疫球蛋白的纯化1、取ida－sepharose 6b 50ml装填到金属亲和层析柱中；本实施方案中，层析柱柱长与柱径比例为5:1，柱床体积为500ml。之后先后采用1500ml的纯化水、2000ml的浓度为0.75g/l的cuso4·
5h2o 溶液以及2500ml的磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）进行洗柱。
58.2、取磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）100ml稀释实施例3所得的提纯抗hpv卵黄免疫球蛋白20mg。之后将稀释液在5000rpm的转速下离心2min获得澄清的抗hpv卵黄免疫球蛋白液。
59.3、将抗hpv卵黄免疫球蛋白液上样到金属亲和柱。
60.4、先采用2000ml的磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）洗柱；之后采用2000ml的洗脱缓冲液（每升含乙酸钠100 mmol、含氯化钠0.5 mol）洗柱，合并洗脱液，之后干燥至含水量为70%后得到纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
61.实施例5：抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉的制备1、取实施例4所得抗hpv卵黄免疫球蛋白放入冷冻设备中，调节温度为-40℃进行预冻，控制预冻时间为4h。
62.2、保持温度，对冷冻设备抽真空，使抗hpv卵黄免疫球蛋白所处环境的气压为80pa；之后真空冷冻干燥30h，得到卵黄免疫球蛋白液冻干粉。
63.实施例6本实施例公开了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.01g、碱法明胶0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
64.其中：在本实施方案中，抗hpv卵黄免疫球蛋白为由实施例5所得的卵黄免疫球蛋白液冻干粉；褐藻酸盐为1wt%粘度为600cps（25℃，ndj-1,4#转子）的褐藻酸钠；碱法明胶为180冻力明胶；卡波姆为卡波姆934；中和剂为三乙醇胺；防腐剂为尼泊金甲酯；聚乙二醇为peg4000。
65.本实施例还公开了上述抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：s1、按上述配方取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水。加热纯化水至40℃；保持水温，将褐藻酸盐、碱法明胶、抗
hpv卵黄免疫球蛋白、卡波姆、中和剂、甘油、聚乙二醇、防腐剂依次加入纯化水中；边加边以120rpm的搅拌速度进行搅拌，直至上述组成混合均匀而得到混合液。
66.s2、将混合液通入膜乳化器(fm0210/500m，中科森辉微球技术(苏州)有限公司)中，加0.2mpa压力使混合液通过膜孔径为5μm的膜管。反复过膜三次，得到凝胶产品。
67.实施例7本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
68.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.05g、褐藻酸盐0.08g、碱法明胶0.06g、卡波姆0.08g、中和剂0.16g、防腐剂0.04g、聚乙二醇0.05g、甘油0.7g以及水8.78g。
69.实施例8本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
70.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.12g、褐藻酸盐0.12g、碱法明胶0.1g、卡波姆0.05g、中和剂0.12g、防腐剂0.09g、聚乙二醇0.1g、甘油0.5g以及水8.8g。
71.实施例9本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
72.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.17g、褐藻酸盐0.16g、碱法明胶0.15g、卡波姆0.03g、中和剂0.08g、防腐剂0.15g、聚乙二醇0.14g、甘油0.3g以及水8.82g。
73.实施例10本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
74.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.2g、褐藻酸盐0.2g、碱法明胶0.2g、卡波姆0.01g、中和剂0.02g、防腐剂0.2g、聚乙二醇0.2g、甘油0.1g以及水8.87g。
75.实施例11本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法中乳化方式不同。
76.具体为：s2、将混合液用桨式搅拌机，以600rpm的搅拌速度搅拌4.5h，即得到凝胶产品。在搅拌过程中使用真空泵将原料中的气泡排出。
77.实施例12本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：中和剂为氨丁三醇。
78.实施例13本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：防腐剂为苯氧乙醇。
79.实施例14本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：防腐剂为spectrastat phl。
80.对比例1本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入褐藻酸盐，并以水补充。
81.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、碱法明胶0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.66g。
82.对比例2本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入碱法明胶，并以水补充。
83.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.66g。
84.对比例3本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入褐藻酸盐，并以碱法明胶补充。
85.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、碱法明胶0.02g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
86.对比例4本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入碱法明胶，并以褐藻酸盐补充。
87.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.02g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
88.性能检测取实施例6-14和对比例1-4所得的凝胶，采用elisa-间接法进行检测，检测凝胶对hpv病毒的效价；检测结果列于表1中。
89.表1 实施例6-14和对比例1-4所得卵黄免疫球蛋白凝胶的效价项目效价实施例61:2048实施例71:4096实施例81:4096实施例91:4096实施例101:2048实施例111:2048实施例121:4096实施例131:4096实施例141:4096对比例11:512对比例21:512对比例31:1024对比例41:1024
参见表1，由实施例6-14的检测结果可知：本技术各实施例所得卵黄免疫球蛋白凝胶对hpv病毒均具有较高的效价，显示出有效的抗hpv病毒的能力。
90.由实施例1和对比例1的检测结果可以发现：当原料中不加入褐藻酸钠时，所得凝胶的抗hpv效价明显降低，即抗hpv病毒的能力明显降低；这是由于：褐藻酸钠作为抗hpv卵黄免疫球蛋白的主要载体，不加入褐藻酸钠会导致凝胶的结构稳定性变差，从而影响了抗hpv卵黄免疫球蛋白发挥作用。
91.由实施例1和对比例2的检测结果可以发现：当原料中不加入碱法明胶时，所得凝胶的抗hpv效价降低显著；这是由于：碱法明胶通过与病毒衣壳蛋白正电荷区域的吸引和结合，阻止了hpv病毒的组装，从而提高了所得凝胶的抗hpv能力；相反，如不加入碱法明胶，则阻止hpv病毒组装的能力大大下降，导致所得凝胶的抗hpv病毒能力大大降低。
92.由实施例1和对比例3-4的检测结果可以发现：褐藻酸钠和碱法明胶具有良好的协同效应，两者相互配合不仅大大提高了卵黄免疫球蛋白凝胶的稳定性，从而有利于抗hpv卵黄免疫球蛋白功效的发挥；同时也提高了所得凝胶本身对hpv病毒组装的阻止能力，从而能够进一步提高所得凝胶的抗hpv病毒的功效。
93.分析实施例9和实施例11的检测结果可以得到：相比于采用传统的搅拌方式，实施例9采用微孔膜乳化的方式，由于可以得到更加稳定的卵黄免疫球蛋白凝胶，从而更好的发挥了抗hpv卵黄免疫球蛋白的功效，故所得凝胶对于hpv病毒的抵抗能力提高。
94.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。
技术领域
1.本技术涉及hpv病毒抗体的领域，更具体地说，它涉及一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶及其制备方法。
背景技术：
2.hpv病毒一般指人乳头瘤病毒，是一种乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒a属的球形dna病毒。研究表明：hpv病毒能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，从而有可能引起寻常疣、尖锐湿疣、宫颈癌、肛门癌等疾病。近年来由于宫颈癌等发病率的增加，hpv病毒的防治越来越引起人们的关注。
3.卵黄免疫球蛋白（lgy），顾名思义是一种存在于鸟类、爬行动物和两栖类卵黄之中的抗体。卵黄免疫球蛋白与哺乳动物的lgg和lge具有同源性，在功能上具有等价性；并且卵黄免疫球蛋白还具有性能稳定，活性保持良好、产量高、成本低以及特异性强的优点。
4.因此，如何将卵黄免疫球蛋白应用于hpv病毒的防治已经成为了研究的热点。
技术实现要素：
5.为了获得一种具有有效抗hpv病毒能力的卵黄免疫球蛋白凝胶，本技术提供一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶及其制备方法。
6.第一方面，提供了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，采用如下的技术方案：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，由包括以下质量百分比的原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白
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0.100-2.000%褐藻酸盐
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0.100-2.000%碱法明胶
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0.100-2.000%卡波姆
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0.100-1.000%中和剂
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0.200-2.000%防腐剂
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0.100-2.000%聚乙二醇
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0.100-2.000%甘油
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1.00-10.00%纯化水
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余量。
7.通过采用上述技术方案，抗hpv卵黄免疫球蛋白为凝胶的核心成分，起到抗hpv病毒的作用。褐藻酸盐作为一种天然高分子材料，具有丰富的亲水基团，可在水中形成网络状的凝胶结构，并将抗hpv卵黄免疫球蛋白包裹于其中，起到组织载体的作用；由于褐藻酸盐为阴离子载体可减少传统阳离子载体的细胞毒性及免疫原性等问题。碱法明胶是一种等电点在ph 4.8-5.0的大分子亲水胶体，在人体内显负电性；而带负电的碱法明胶可以与病毒衣壳蛋白正电荷区域结合，从而对hpv病毒的组装起到阻止的作用，进而减少了hpv病毒侵入粘膜基底层的宿主细胞，阻断了hpv病毒的感染；并且碱法明胶同时具有良好的凝胶能力，其与褐藻酸盐相配合，通过两者分子链的缠绕，能够形成更加稳定的凝胶结构，从而使
包裹在凝胶内的抗hpv卵黄免疫球蛋白更好地发挥作用。另外，由于褐藻酸盐也显负电性，故其与碱法明胶相配合，有利于提高对病毒衣壳蛋白正电荷区域的结合度，从而有利于提高对hpv病毒感染的阻止作用。因此，通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，保证了抗hpv卵黄免疫球蛋白功效的发挥；且该凝胶本身也具有阻止hpv病毒组装的作用，从而进一步提高了卵黄免疫球蛋白凝胶的抗hpv病毒功效。
8.卡波姆不仅可以与褐藻酸盐和明胶相互作用，促进凝胶的形成；也能够覆盖于受损组织，起到隔离、阻断感染，修复粘膜损伤，促进愈合的作用。
9.在一个具体的可实施方案中，所述抗hpv卵黄免疫球蛋白由以下方法制成：取hpv抗原与佐剂混合后施用于蛋鸡，使其产生免疫球蛋白；取所述蛋鸡所产鸡蛋的卵黄液，分离出抗hpv卵黄免疫球蛋白；提纯、纯化所述抗hpv卵黄免疫球蛋白；冷冻干燥所述抗hpv卵黄免疫球蛋白，得到抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉。
10.通过采用上述技术方案，通过对蛋鸡施用hpv抗原使其产生免疫球蛋白，之后分离、提纯、纯化抗hpv卵黄免疫球蛋白，最后冷冻干燥；性能理想的抗hpv卵黄免疫球蛋白被制得。
11.在一个具体的可实施方案中，分离所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：将鸡蛋的卵黄液采用缓冲液稀释后与硫酸葡聚糖混合，待得到分层体系后取上层液。
12.在一个具体的可实施方案中，提纯所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：取无机盐溶液，与抗hpv卵黄免疫球蛋白进行盐析沉淀，收集沉淀物。
13.在一个具体的可实施方案中，纯化所述抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法为：将抗hpv卵黄免疫球蛋白上样到金属亲和柱中；先采用磷酸盐缓冲液洗柱，之后采用含乙酸盐和盐酸盐的混合缓冲液洗柱；合并洗脱液、干燥。
14.在一个具体的可实施方案中，所述中和剂为氨丁三醇或三乙醇胺。
15.在一个具体的可实施方案中，所述防腐剂为苯氧乙醇、尼泊金甲酯、spectrastat phl中的一种。
16.第二方面，提供了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，采用如下的技术方案：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，包括：取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水，混合均匀得到混合液；乳化混合液而得到抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶。
17.通过采用上述技术方案，抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶被顺利制成。
18.在一个具体的可实施方案中，所述乳化的方法为：对所述混合液加压使其通过膜孔径小于10μm的膜。
19.通过采用上述技术方案，采用微孔膜乳化的方式，有利于得到更加稳定、均一的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，从而能够更好的发挥抗hpv卵黄免疫球蛋白的功效。
20.综上所述，本技术至少具有以下有益技术效果之一：1、本技术所得卵黄免疫球蛋白凝胶对hpv病毒具有较高的效价，显示出有效的抗
hpv病毒的能力。
21.2、本技术通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的卵黄免疫球蛋白凝胶，有利于抗hpv卵黄免疫球蛋白更好的发挥作用；且凝胶本身具有阻止hpv病毒组装的作用，从而能够进一步提高卵黄免疫球蛋白凝胶的抗hpv病毒功效。
22.3、本技术采用微孔膜乳化的方式，相比于采用传统的搅拌乳化方式，有利于得到更加稳定、均一的卵黄免疫球蛋白凝胶，从而能够保证抗hpv卵黄免疫球蛋白更好地发挥功效。
具体实施方式
23.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
24.本技术的主要技术内容为：获取一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下质量百分比的原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白
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0.100-2.000%褐藻酸盐
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0.100-2.000%碱法明胶
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0.100-2.000%卡波姆
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0.100-1.000%中和剂
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0.200-2.000%防腐剂
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0.100-2.000%聚乙二醇
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0.100-2.000%甘油
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1.00-10.00%纯化水
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余量。
25.其中：在本技术中，抗hpv卵黄免疫球蛋白具体为抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉，通过以下五个步骤获得：1、取hpv抗原与佐剂混合后施用于蛋鸡上进行免疫，间隔7-21天后按上述方案再次进行免疫，重复若干次，使蛋鸡体内产生免疫球蛋白。
26.在本技术中，hpv抗原购自美国santa公司，且hpv抗原可为hpv6型抗原、hpv11型抗原、hpv16型抗原、hpv18型抗原、hpv31型抗原、hpv33型抗原、hpv35型抗原、hpv45型抗原、hpv52型抗原、hpv58型抗原、hpv65型抗原、hpv81型抗原、广谱hpv抗原（即上述各型抗原等质量比混合产物）、hpv16型-hpv18型混合抗原（等质量比混合）、hpv6型-hpv11型混合抗原（等质量比混合）或hpv52型-hpv58型-hpv31型-hpv33型-hpv35型-hpv45型抗原混合抗原（等质量比混合）；其中，优选为广谱hpv抗原。同时，hpv抗原的剂量为0.001-1.00mg，优选为0.025mg。
27.佐剂是一类可增强或改变机体对抗原的免疫应答的非特异性免疫增强剂。在本技术中，佐剂可为r71佐剂、弗式佐剂或铝盐佐剂。
28.蛋鸡在本技术中可为无特定病原（spf）蛋鸡也可为普通商用蛋鸡；鸡的种类可为白来亨鸡或星杂白鸡；其中优选为spf白来亨蛋鸡。
29.将抗原和佐剂施用于蛋鸡的方法在本技术中具体可为皮下给药、皮内给药、肌肉注射、静脉注射、点眼、滴鼻、喷雾、口服或基因枪注射；其中优选皮下给药。
30.在本技术中，免疫间隔时间为7-21天，其中优选为16天；免疫次数为2-5次，其中优
选为3次。
31.2、收集免疫后的蛋鸡的鸡蛋，并提取鸡蛋的卵黄液；之后将卵黄液中不水溶的脂肪及脂蛋白去除而分离出抗hpv卵黄免疫球蛋白。
32.在本技术中，分离抗hpv卵黄免疫球蛋白的方法可为有机物沉淀法、有机溶剂抽提法、天然胶法、中链脂肪酸法、去污剂分离法、水稀释法或超临界气体提取法；其中，优选为有机物沉淀法，其具体过程为：将卵黄液用缓冲溶液稀释后与硫酸葡聚糖混合，待分层后，取上层液，即为抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液。
33.3、对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行提纯。本技术中，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行提纯的方法可为超滤法、无机物沉淀法或有机溶剂沉淀法；其中，优选为无机物沉淀法，其具体过程为：采用无机盐溶液与抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液混合而发生盐析沉淀；之后收集沉淀物，得到提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白。上述无机盐溶液在本技术中可为硫酸钠、硫酸铵或氯化镁；其中，优选为硫酸铵。同时，为了能够沉淀充分，优选采用不同浓度的无机盐溶液对抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液进行多次盐析。
34.4、对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行纯化。本技术中，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行纯化的方法可为凝胶过滤层析法、离子交换层析法、亲硫层析法或固相金属离子亲和层析法；其中优选为固相金属离子亲和层析法，其具体过程为：将经提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白上样到金属亲和柱中；先后用磷酸盐缓冲液、含乙酸盐和盐酸盐的混合缓冲液洗柱；合并洗脱液，烘干至含水量小于75 %而得到纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
35.5、先将纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白进行预冻；再抽真空，对抗hpv卵黄免疫球蛋白进行真空冷冻干燥而得到抗hpv卵黄免疫球蛋白液冻干粉。本技术中，预冻的温度为-50
‑‑
25℃，预冻的时间为1-4h，真空冷冻干燥时的压力为60-90pa，真空冷冻干燥的时间为20-40h；其中，优选预冻的温度为-40℃，预冻的时间为4h，真空冷冻干燥时的压力为80pa，真空冷冻干燥的时间为30h。
36.抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的其他组成中：褐藻酸盐为天然多糖碳水化合物，是一种天然高分子材料，具有丰富的亲水基团，可在水中形成网络状的凝胶结构，并将抗hpv卵黄免疫球蛋白包裹于其中；从而，褐藻酸盐起到了构成核心成分的组织载体的作用；同时，褐藻酸盐为阴离子载体可减少传统阳离子载体的细胞毒性及免疫原性等问题。碱法明胶是一种等电点在ph 4.8-5.0的大分子亲水胶体；当体系的ph高于其等电点时，碱法明胶显负电性；带负电的碱法明胶可以与病毒衣壳蛋白正电荷区域结合，从而能够阻止hpv病毒的组装，减少了hpv病毒侵入粘膜基底层的宿主细胞，进而起到阻断hpv病毒感染的作用。同时，由于褐藻酸盐也带有负电，故其与碱法明胶相配合，能够提高对病毒衣壳蛋白正电荷区域的吸引和结合，从而提高了阻止hpv病毒组装的作用；而碱法明胶作为一种亲水胶体，本身也具有构成凝胶的能力；故其与褐藻酸盐相配合，通过两者分子链的缠绕，而形成了更加稳定的凝胶结构。因此，通过褐藻酸盐和明胶之间的协同作用，不仅形成了稳定的包含有抗hpv卵黄免疫球蛋白的凝胶，且该凝胶本身也具有阻止hpv病毒组装的能力，从而进一步提高了卵黄免疫球蛋白凝胶抗hpv病毒的功效。
37.在本技术中，褐藻酸盐可以为褐藻酸钙或褐藻酸钠，其中，优选为褐藻酸钠；同时，褐藻酸钠1wt%粘度为150-1000cps（25℃，ndj-1,4#转子）范围内的任意值，其中，优选为400-800cps。
38.在本技术中，碱法明胶可为120冻力明胶、160冻力明胶、180冻力明胶、200冻力明胶、220冻力明胶或240冻力明胶；其中，优选为180冻力明胶。
39.卡波姆（carbopol）是由烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚等与丙烯酸聚合得到的丙烯酸交联树脂，是一种性质稳定、无刺激、无致敏性医用高分子材料。在本技术中，卡波姆能够覆盖于受损组织，可起到隔离、阻断感染，修复粘膜损伤，促进愈合的作用；同时被中和后的卡波姆还可作为凝胶基质，起到辅助凝胶的作用。本技术中的卡波姆可以为卡波姆934、卡波姆940或卡波姆941；其中，优选为卡波姆934。
40.中和剂用于调节体系的酸碱度，并有助于提高体系的凝胶性。本技术中的中和剂可以为有机中和剂或无机中和剂；有机中和剂，如氨丁三醇、三乙醇胺等；无机中和剂，如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钾等；进一步的，本技术的中和剂优选为氨丁三醇或三乙醇胺。
41.防腐剂用于提高凝胶体系的抗菌性和稳定性；在本技术中，防腐剂可以为苯氧乙醇、尼泊金甲酯或spectrastat phl。
42.聚乙二醇在凝胶体系中起到润滑、保湿、粘结的作用。本技术中的聚乙二醇可以为peg2000、peg4000或peg6000；其中，优选为peg4000。
43.上述抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法如下：s1、按上述配方取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水，并将这些组成混合均匀而得到混合液；控制纯化水的温度为30-50℃，优选为40℃。
44.s2、将混合液进行乳化而得到抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶。
45.在本技术中，乳化的方式可为机械搅拌乳化或微孔膜乳化；其中，优选为微孔膜乳化，该方法通过加压使混合液通过微孔膜的方式得到凝胶；采用该方法得到的凝胶颗粒的粒径更细也更均匀，凝胶结构更加稳定。上述方法中，微孔膜的孔径在本技术中小于10μm即可，其中，优选为5μm；加压的压力在本技术中为0.1-0.3mpa，其中，优选为0.2mpa。
46.实施例1：蛋鸡的hpv免疫1、取hpv6型抗原、hpv11型抗原、hpv16型抗原、hpv18型抗原、hpv31型抗原、hpv33型抗原、hpv35型抗原、hpv45型抗原、hpv52型抗原、hpv58型抗原、hpv65型抗原、hpv81型抗原（均购自美国santa公司），等质量比混合成广谱hpv抗原。
47.2、取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行初次免疫。
48.3、隔16天后，再次取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml，将两者混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行二次免疫。
49.4、再隔16天后，第三次取广谱hpv抗原0.025mg和弗式佐剂0.01ml，将两者混合后通过皮下给药的方式注入spf白来亨蛋鸡的体内，进行三次免疫。
50.通过上述多次免疫，蛋鸡体内产生了数量可观的能抵抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白。
51.实施例2：抗hpv卵黄免疫球蛋白的分离1、收集实施例1所得蛋鸡的鸡蛋，用清水清洗鸡蛋表面后浸泡在新洁尔灭中2min；之后取出擦干，再用75%酒精擦拭一遍后自然晾干；之后在无菌条件下，用蛋黄分离器去除鸡蛋的卵白；之后刺破卵黄膜，收集卵黄液。
52.2、将100ml的卵黄液用500ml的pbs缓冲液稀释，得到卵黄稀释液。
53.3、向卵黄稀释液中加入21g硫酸葡聚糖（分子量为5w），常温下以100rpm转速搅拌2h而得到分层体系；取分层体系的上层液，即为抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液，而卵黄中不水溶的脂肪及脂蛋白则存在分层体系的下方而被去除；通过上述方法，抗hpv卵黄免疫球蛋白被从卵黄中分离了出来。
54.实施例3：抗hpv卵黄免疫球蛋白的提纯1、将实施例2所得的抗hpv卵黄免疫球蛋白水溶液100ml和浓度为10wt%的硫酸铵溶液100ml混合，以100rpm转速搅拌8h；收集沉淀物及上层液。
55.2、将步骤1所得上层液与等体积的浓度为36wt%的硫酸铵溶液混合，以100rpm转速搅拌8h；收集沉淀物。
56.3、合并两次沉淀物，得到提纯的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
57.实施例4：抗hpv卵黄免疫球蛋白的纯化1、取ida－sepharose 6b 50ml装填到金属亲和层析柱中；本实施方案中，层析柱柱长与柱径比例为5:1，柱床体积为500ml。之后先后采用1500ml的纯化水、2000ml的浓度为0.75g/l的cuso4·
5h2o 溶液以及2500ml的磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）进行洗柱。
58.2、取磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）100ml稀释实施例3所得的提纯抗hpv卵黄免疫球蛋白20mg。之后将稀释液在5000rpm的转速下离心2min获得澄清的抗hpv卵黄免疫球蛋白液。
59.3、将抗hpv卵黄免疫球蛋白液上样到金属亲和柱。
60.4、先采用2000ml的磷酸钠盐缓冲液（0.02m，ph 7.4）洗柱；之后采用2000ml的洗脱缓冲液（每升含乙酸钠100 mmol、含氯化钠0.5 mol）洗柱，合并洗脱液，之后干燥至含水量为70%后得到纯化的抗hpv卵黄免疫球蛋白。
61.实施例5：抗hpv卵黄免疫球蛋白冻干粉的制备1、取实施例4所得抗hpv卵黄免疫球蛋白放入冷冻设备中，调节温度为-40℃进行预冻，控制预冻时间为4h。
62.2、保持温度，对冷冻设备抽真空，使抗hpv卵黄免疫球蛋白所处环境的气压为80pa；之后真空冷冻干燥30h，得到卵黄免疫球蛋白液冻干粉。
63.实施例6本实施例公开了一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.01g、碱法明胶0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
64.其中：在本实施方案中，抗hpv卵黄免疫球蛋白为由实施例5所得的卵黄免疫球蛋白液冻干粉；褐藻酸盐为1wt%粘度为600cps（25℃，ndj-1,4#转子）的褐藻酸钠；碱法明胶为180冻力明胶；卡波姆为卡波姆934；中和剂为三乙醇胺；防腐剂为尼泊金甲酯；聚乙二醇为peg4000。
65.本实施例还公开了上述抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：s1、按上述配方取抗hpv卵黄免疫球蛋白、褐藻酸盐、碱法明胶、卡波姆、中和剂、防腐剂、聚乙二醇、甘油以及纯化水。加热纯化水至40℃；保持水温，将褐藻酸盐、碱法明胶、抗
hpv卵黄免疫球蛋白、卡波姆、中和剂、甘油、聚乙二醇、防腐剂依次加入纯化水中；边加边以120rpm的搅拌速度进行搅拌，直至上述组成混合均匀而得到混合液。
66.s2、将混合液通入膜乳化器(fm0210/500m，中科森辉微球技术(苏州)有限公司)中，加0.2mpa压力使混合液通过膜孔径为5μm的膜管。反复过膜三次，得到凝胶产品。
67.实施例7本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
68.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.05g、褐藻酸盐0.08g、碱法明胶0.06g、卡波姆0.08g、中和剂0.16g、防腐剂0.04g、聚乙二醇0.05g、甘油0.7g以及水8.78g。
69.实施例8本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
70.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.12g、褐藻酸盐0.12g、碱法明胶0.1g、卡波姆0.05g、中和剂0.12g、防腐剂0.09g、聚乙二醇0.1g、甘油0.5g以及水8.8g。
71.实施例9本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
72.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.17g、褐藻酸盐0.16g、碱法明胶0.15g、卡波姆0.03g、中和剂0.08g、防腐剂0.15g、聚乙二醇0.14g、甘油0.3g以及水8.82g。
73.实施例10本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料配比不同。
74.具体为：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.2g、褐藻酸盐0.2g、碱法明胶0.2g、卡波姆0.01g、中和剂0.02g、防腐剂0.2g、聚乙二醇0.2g、甘油0.1g以及水8.87g。
75.实施例11本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的制备方法中乳化方式不同。
76.具体为：s2、将混合液用桨式搅拌机，以600rpm的搅拌速度搅拌4.5h，即得到凝胶产品。在搅拌过程中使用真空泵将原料中的气泡排出。
77.实施例12本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：中和剂为氨丁三醇。
78.实施例13本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：防腐剂为苯氧乙醇。
79.实施例14本实施例和实施例9基本相同，不同之处在于：防腐剂为spectrastat phl。
80.对比例1本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入褐藻酸盐，并以水补充。
81.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、碱法明胶0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.66g。
82.对比例2本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入碱法明胶，并以水补充。
83.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.01g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.66g。
84.对比例3本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入褐藻酸盐，并以碱法明胶补充。
85.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、碱法明胶0.02g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
86.对比例4本对比例与实施例6的主要区别在于：抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶的原料中不加入碱法明胶，并以褐藻酸盐补充。
87.具体为：一种抗hpv病毒的卵黄免疫球蛋白凝胶，其由以下原料制备而成：抗hpv卵黄免疫球蛋白0.01g、褐藻酸盐0.02g、卡波姆0.1g、中和剂0.2g、防腐剂0.01g、聚乙二醇0.01g、甘油1g以及纯化水8.65g。
88.性能检测取实施例6-14和对比例1-4所得的凝胶，采用elisa-间接法进行检测，检测凝胶对hpv病毒的效价；检测结果列于表1中。
89.表1 实施例6-14和对比例1-4所得卵黄免疫球蛋白凝胶的效价项目效价实施例61:2048实施例71:4096实施例81:4096实施例91:4096实施例101:2048实施例111:2048实施例121:4096实施例131:4096实施例141:4096对比例11:512对比例21:512对比例31:1024对比例41:1024
参见表1，由实施例6-14的检测结果可知：本技术各实施例所得卵黄免疫球蛋白凝胶对hpv病毒均具有较高的效价，显示出有效的抗hpv病毒的能力。
90.由实施例1和对比例1的检测结果可以发现：当原料中不加入褐藻酸钠时，所得凝胶的抗hpv效价明显降低，即抗hpv病毒的能力明显降低；这是由于：褐藻酸钠作为抗hpv卵黄免疫球蛋白的主要载体，不加入褐藻酸钠会导致凝胶的结构稳定性变差，从而影响了抗hpv卵黄免疫球蛋白发挥作用。
91.由实施例1和对比例2的检测结果可以发现：当原料中不加入碱法明胶时，所得凝胶的抗hpv效价降低显著；这是由于：碱法明胶通过与病毒衣壳蛋白正电荷区域的吸引和结合，阻止了hpv病毒的组装，从而提高了所得凝胶的抗hpv能力；相反，如不加入碱法明胶，则阻止hpv病毒组装的能力大大下降，导致所得凝胶的抗hpv病毒能力大大降低。
92.由实施例1和对比例3-4的检测结果可以发现：褐藻酸钠和碱法明胶具有良好的协同效应，两者相互配合不仅大大提高了卵黄免疫球蛋白凝胶的稳定性，从而有利于抗hpv卵黄免疫球蛋白功效的发挥；同时也提高了所得凝胶本身对hpv病毒组装的阻止能力，从而能够进一步提高所得凝胶的抗hpv病毒的功效。
93.分析实施例9和实施例11的检测结果可以得到：相比于采用传统的搅拌方式，实施例9采用微孔膜乳化的方式，由于可以得到更加稳定的卵黄免疫球蛋白凝胶，从而更好的发挥了抗hpv卵黄免疫球蛋白的功效，故所得凝胶对于hpv病毒的抵抗能力提高。
94.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。
再多了解一些
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