一种用于2,4-D检测的人工抗体的制备方法

技术特征：
1.一种用于2,4-d检测的人工抗体的制备方法，其特征在于：所述的人工抗体是以fe3o4纳米粒子为芯，聚合物为印记壳层，洗脱了位于壳层的2,4-d印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的印记壳层具有对2,4-d分子的特异性识别位点，人工抗体的壳层识别位点处的氮原子提供孤对电子对与进入识别位点的目标分析物2,4-d分子中羧基中氢原子二者通过非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，所述的芯-壳型fe3o4纳米粒子人工抗体的制备过程包括如下四个步骤：1.1 第一步是fe3o4纳米粒子的制备：首先，称取0.8 ~ 0.9g fecl3•
6h2o及0.2 ~ 0.4g fecl2•
4h2o，置于含有20 ~ 30 ml聚乙二醇的100ml单颈烧瓶中，以400 ~ 500rpm的转速搅拌，得到聚乙二醇混合溶液，再称取0.2 ~ 0.4 g二水合柠檬酸三钠及1.4 ~ 1.5 g无水乙酸钠，分别将其放入10 ~ 20 ml乙二醇溶液的50ml的单颈烧瓶中，以400 ~ 500rpm的转速搅拌，均匀混合后，将所得乙二醇混合溶液快速倒入聚乙二醇混合溶液中，搅拌1 ~ 2 h后，将所得的液体倒进100ml的反应釜中，在200 ~ 210 ℃干燥箱中恒温反应9 ~ 10 h，反应结束后，将反应釜冷却至25℃，取出反应釜内物料，清洗，将得到的fe3o4纳米粒子重新分散在去离子水中，通氮气密封保存备用；1.2第二步是芯-壳型fe3o4纳米粒子人工抗体的制备：量取80 ~ 90 ml的甲醇及 20 ~ 30 ml的fe3o4水溶液放入250ml的锥形瓶中，超声分散后，随后加入50 mg ~ 70 mg 的4-乙烯基吡啶以及20 ~ 30 mg的2,4-d，将锥形瓶中的溶液在摇床上培育18~22min，添加交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈后，超声4~6min，通氮气10~15min，密封，置于 60~65℃、250~300rpm的摇床中反应16~18h，进行磁性分离后，所得芯-壳型fe3o4纳米粒子用乙醇和水反复提纯，再用体积比为7：3的甲醇和乙酸混合溶液洗涤三次，去除模板分子，直到经磁性分离的上清液在284nm处无紫外吸收，得到芯-壳型fe3o4纳米粒子人工抗体，再将其重新分散在乙醇中，密封保存；1.3第三步是酶标2, 4-d的制备：称取2 ~ 4 mg辣根过氧化物酶溶解于1~3ml新鲜配制的乙酸盐缓冲液中，加入2 ~ 4 mg高碘酸钠，室温下以300 rpm的转速反应15 ~ 20min，对乙酸盐缓冲液透析2 ~ 4h，调节ph为4.5，称取2 ~ 6 mg己二胺加入到1 ml乙酸盐缓冲液中，室温下以300 rpm的转速反应3~4h，再用naoh将辣根过氧化物酶溶液的ph调节至9.2，反应后加入0.2 ml浓度为4 mg
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l-1
的硼氢化钠水溶液，搅拌20 min，加入2 ~ 4 mg n-羟基琥珀酰亚胺、10mg二环己基碳二亚胺，再搅拌1h在4℃下用3500d透析袋透析，得到酶标2,4-d备用；1.4第四步是酶联免疫化学发光实验：取第二步制备的8 ~ 10mg芯-壳型fe3o4纳米粒子人工抗体、2~5 mg的 2, 4-d及第三步制备的1~3ml酶标2,4-d于黑色96孔板中，室温下共培育2 h后，在外加磁场的存在下倒掉上清液，并用tris-hcl缓冲液洗涤三次，去除多余反应物，最后加入5.2 μl的30%过氧化氢与鲁米诺混合液，通过发光值的改变，实现对2,4-d的检测。2.根据权利要求1所述的一种用于2,4-d检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的人工抗体的制备中的磁性分离是fe3o4纳米粒子自身磁性在外加磁场作用下的聚集。3.根据权利要求1所述的一种用于2,4-d检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的人工抗体的制备中聚合物印迹壳层中的2,4-d分子是印迹分子、抗原分子模板分子和目
标分子。4.根据权利要求1所述的一种用于2,4-d检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的人工抗体的制备中酶标抗原分子是标记了辣根过氧化物酶的2,4-d。5.根据权利要求1所述的一种用于2,4-d检测的人工抗体的制备方法，其特征是：所述的人工抗体制备中的印迹壳层厚度可以通过改变交联剂和功能单体量来控制。

技术总结
本发明是一种用于2，4-D检测的人工抗体的制备方法。本发明制备了对2，4-D特异性识别的Fe3O4纳米粒子表面分子印迹聚合物，并结合化学发光免疫分析法，实现对2，4-D的痕量检测，检测限为1.33


技术研发人员：高大明 杨俊宇 张年玺 程远 王竞 张霞 张慧 张凌云 王晓晨 刘安求
受保护的技术使用者：合肥学院
技术研发日：2022.03.05
技术公布日：2022/6/4