一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法与流程

1.本发明属于药物检测分析技术领域，具体涉及一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法。


背景技术：

2.烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,nr)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,nad )的前体物质。nr不易被血清水解酶灭活，因此它是良好的外源性nad 的补充来源。而nad 是一种必需的辅酶，在各种代谢途径中都起着重要的作用，是治疗多种疾病调节生理状况的重要途径。近年来的研究表明，nr在治疗代谢性和神经退行性疾病方面存在巨大潜力，包括各种心血管疾病、神经和认知功能、代谢紊乱、肌肉损伤、衰老、化学疗法等领域。与其他nad 前体相比，使用nr的安全性和有效性相对较高，在将来可能会替代烟酸作为nad 的补充剂。然而nr作为营养补充剂时仍然存在着产量低、价格昂贵、含量检测复杂等问题。
3.nr的结构式如下所示：
[0004][0005]
此外，由于nr结构中具有核糖，极性较大，在常规c18色谱柱上保留较弱，文献报道较少。文献(陈晓丽等.离子对hplc法测定烟酰胺核糖.广东化工.2020，13：261～263)报道了离子对液相色谱法对nr中的有关物质及含量进行测定。在流动相中加入离子对试剂庚烷磺酸，然后在c18色谱柱上进行分离，紫外261nm检测。
[0006]
但是离子对试剂方法本身对色谱柱伤害较大，离子对试剂很难从色谱柱上洗脱，因此大大缩短色谱柱的使用寿命。此外，离子对试剂法对于流动相的ph特别敏感，对于流动相配制要求极高，方法的重复性和重现性均很难控制。
[0007]
因此，需开发一种方法快速、简易，成本低，重现性好，方便推广的胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法。


技术实现要素：

[0008]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种烟酰胺核糖氯化物的分离检测
方法。所述离子色谱法直接采用阳离子交换色谱柱进行分离，无需添加离子对试剂，通过紫外检测nr，方法快速、简易，成本低，方便推广。
[0009]
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0010]
本发明提供一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0011]
(1)溶液的配制：将胶囊的内容物溶解于稀释液中，配制得到供试品溶液；将烟酰胺核糖氯化物的对照品溶解于稀释液中，配制得到对照品溶液；
[0012]
(2)分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，使用离子色谱法对胶囊中烟酰胺核糖氯化物的含量进行检测。
[0013]
在本发明中，采用离子色谱法直接采用离子色谱法进行分离，能快速、准确地检测胶囊的内容物中nr的含量，且通过紫外检测nr方法的精密度、准确度及回收率等均良好，满足样品的检测要求，因而可应用于制剂的质量评价。同时，该方法具有方法快速、简易，成本低，方便推广的优点。
[0014]
优选地，步骤(1)中，所述胶囊的内容物包括：烟酰胺核糖氯化物、微晶纤维素和半乳糖。
[0015]
优选地，步骤(1)中，所述稀释液包括乙腈和水，所述乙腈和水的体积比为(2-4):(1-3)，例如可以是2:1、3:1、4:1、2:2、3:2、2:3、4:3等，优选为3:2。
[0016]
优选地，步骤(1)中，在所述供试品溶液中，所述内容物的质量和稀释液的体积比为(0.0015-1.0)mg:1.0ml，例如可以是0.0015mg:1.0ml、0.01mg:1.0ml、0.1mg:1.0ml、0.25mg:1.0ml、0.5mg:1.0ml、0.75mg:1.0ml、1.0mg:1.0ml等。
[0017]
优选地，步骤(1)中，在所述对照品溶液中，所述对照品的质量和稀释液的体积比(0.0015-1.0)mg:1.0ml，例如可以是0.0015mg:1.0ml、0.01mg:1.0ml、0.1mg:1.0ml、0.2mg:1.0ml、0.4mg:1.0ml、0.6mg:1.0ml、0.8mg:1.0ml、1.0mg:1.0ml等。
[0018]
优选地，步骤(1)中，所述溶解在超声下进行，所述超声的时间为10-30min，例如可以是10min、12min、14min、16min、18min、20min、22min、24min、26min、28min、30min等，所述超声的功率为200-600w，例如可以是200w、250w、300w、350w、400w、450w、500w、550w、600w等。
[0019]
优选地，步骤(2)中，所述检测使用的流动相a为乙腈，流动相b为醋酸铵水溶液。
[0020]
优选地，所述醋酸铵水溶液的浓度为140-160mm，例如可以是140mm、145mm、150mm、155mm、160mm等，优选为150mm。
[0021]
优选地，步骤(2)中，所述检测中采用等度洗脱，所述流动相a和流动相b的体积比为(55-65):(35-45)，例如可以是55:45、56:44、58:42、60:40、62:38、64:36、65:35等，优选为60:40。
[0022]
优选地，步骤(2)中，所述离子色谱仪用色谱柱为dionex ionpac cs17阳离子交换色谱柱。
[0023]
优选地，所述色谱柱的长度为50-300mm，例如可以是50mm、100mm、150mm、200mm、250mm、300mm等，优选为250mm；所述色谱柱的内径为2-5mm，优选为4mm。
[0024]
优选地，所述色谱柱的柱温为30-60℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等，优选为40℃。
[0025]
优选地，步骤(2)中，所述检测中流动相的流速为0.8-1.2ml/min，例如可以是0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min等，优选为1.0ml/min。
[0026]
优选地，步骤(2)中，所述检测中的进样量为5-50μl，例如可以是5μl、10μl、20μl、25μl、50μl等，优选为10μl。
[0027]
优选地，步骤(2)中，所述检测的波长为250-280nm，例如可以是250nm、255nm、260nm、265nm、270nm、280nm等，优选为260nm。
[0028]
优选地，步骤(2)中，所述检测的分析时间10-15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min等，优选为12min。
[0029]
作为本发明优选技术方案，所述检测方法包括以下步骤：
[0030]
(1)溶液的配制：将胶囊的内容物超声10-30min溶解于稀释液中，配制得到供试品溶液，其中，内容物的质量和稀释液的体积比为(0.0015-1.0)mg:1.0ml；
[0031]
将烟酰胺核糖氯化物的对照品超声10-30min溶解于稀释液中，配制得到对照品溶液其中，其中，对照品的质量和稀释液的体积比(0.0015-1.0)mg:1.0ml；
[0032]
(2)分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，使用离子色谱法对胶囊中烟酰胺核糖氯化物的含量进行检测；
[0033]
其中，离子色谱法的色谱条件包括以下内容：
[0034]
流动相a为乙腈，流动相b为140-160mm的醋酸铵水溶液，流动相a和流动相b的体积比为(55-65):(35-45)；色谱柱为dionex ionpac cs17阳离子交换色谱柱，长度为50-300mm，内径为3-5mm，柱温为35-45℃；流动相的流速为0.8-1.2ml/min，进样量为5-50μl；检测的波长为250-280nm，分析时间10-15min。
[0035]
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
[0036]
本发明离子色谱法直接采用阳离子交换色谱柱进行分离，流动相仅使用简单的醋酸铵和乙腈，无需添加离子对试剂，紫外检测nr，方法快速、简易，成本低，方便推广。
附图说明
[0037]
图1为空白溶液谱图的色谱图。
[0038]
图2为对照品溶液的色谱图。
[0039]
图3为nam、na和nr叠加图。
[0040]
图4为定量限溶液谱图。
[0041]
图5为检测限溶液谱图。
[0042]
图6为标准曲线图。
[0043]
图7为实施例1提供的供试品1的色谱图。
[0044]
图8为实施例2提供的供试品2的色谱图。
[0045]
图9为实施例3提供的供试品3的色谱图。
[0046]
图10为实施例4和5的对比色谱图。
[0047]
图11为实施例6和7的对比色谱图。
[0048]
图12为实施例8和9的对比色谱图。
[0049]
图13为实施例10和11的对比色谱图。
具体实施方式
[0050]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0051]
下述实施例和对比例各组分来源如下所示：
[0052]
名称厂家牌号/型号规格离子色谱仪thermo scientificdionex ics-5000dionex ionpac cs17thermo scientific250mm
×
4mm烟酰胺核糖氯化物的对照品aladdin纯度：100％
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例提供一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0055]
(1))溶液的配制：
[0056]
流动相a：乙腈，超声脱气10min；
[0057]
流动相b：150mm醋酸铵水溶液，超声脱气10min；
[0058]
空白溶液：乙腈-水(体积比为3:2)，也作稀释液。(图1为空白溶液谱图的色谱图，如图1所示，空白溶液中无干扰nr检测的色谱峰，待测色谱峰前后分离度均大于2)；
[0059]
对照品贮备液：称取50mg nr对照品置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为5mg/ml的对照品贮备液；
[0060]
对照品溶液：量取1ml对照品贮备液置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.5mg/ml的对照品溶液(图2为对照品溶液的色谱图，如图2所示，nr于7.893min位置出峰；
[0061]
系统适用性溶液：同对照品溶液；
[0062]
供试品溶液：称取胶囊内容物21.56mg(相当于含nr 12.5mg)置25ml量瓶中，加入稀释液超声20min溶解并稀释至刻度，摇匀过滤即得供试品溶液。平配制两份。
[0063]
(2)分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，使用离子色谱法对胶囊中烟酰胺核糖氯化物的含量进行检测；
[0064]
其中，离子色谱法的色谱条件包括以下内容：
[0065][0066]
(3)检测结果
[0067]
(a)抗干扰测试：
[0068]
图3为nam、na和nr叠加图，如图3所示，其中烟酸na和烟酰胺nam是nr合成的起始物料，也可能是nr的降解产物。由图可见，烟酸na和烟酰胺nam对nr检测均无干扰，表明方法也可同时测定。
[0069]
(b)定量限溶液：
[0070]
图4为定量限溶液谱图，如图4所示，逐级稀释对照品溶液使浓度为0.5012μg/ml，连续进样6针，峰面积的rsd为8.3％，信噪比在14.4-21.4之间，不小于10。
[0071]
(c)检测限溶液：
[0072]
图5为检测限溶液谱图，如图5所示，逐级稀释对照品溶液使浓度为1.504μg/ml，信噪比为7.7，不小于3。
[0073]
(d)线性与测量范围(0.0015mg/ml～1.00mg/ml)：
[0074]
逐级稀释对照品溶液，并分别通过离子色谱测定对应浓度的峰面积，作标准工作曲线，线性与范围如下表1所示，标准曲线图如图6所示：
[0075]
表1
[0076]
编号nr浓度(mg/ml)nr峰面积(mau*min)loq0.0015040.0958l20.010020.6497l30.100212.8837l40.250632.7725l50.501263.7207l60.751897.6665l71.0024131.8997
[0077]
图6为标准曲线图，其中，y＝131.1811x-0.5304，r＝0.9999。
[0078]
(e)供试品含量测定
[0079]
图7为实施例1提供的供试品1的色谱图，如图7所示，nr于7.897min处出峰，其峰面
积为48.3723mau*min，通过对照品溶液峰面积外标法计算，供试品1的内容物中的nr质量含量为42.4％。
[0080]
实施例2
[0081]
本实施例提供一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0082]
(1))溶液的配制：
[0083]
流动相a：乙腈，超声脱气10min；
[0084]
流动相b：150mm醋酸铵水溶液，超声脱气10min；
[0085]
空白溶液：乙腈-水(体积比为3:2)，也作稀释液。(图1为空白溶液谱图的色谱图，如图1所示，空白溶液中无干扰nr检测的色谱峰，待测色谱峰前后分离度均大于2)；
[0086]
对照品贮备液：称取50mg nr对照品置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为5mg/ml的对照品贮备液；
[0087]
对照品溶液：量取1ml对照品贮备液置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.5mg/ml的对照品溶液(图2为对照品溶液的色谱图，如图2所示，nr于7.893min位置出峰；
[0088]
系统适用性溶液：同对照品溶液；
[0089]
供试品溶液：称取胶囊内容物21.56mg(相当于含nr 12.5mg)置25ml量瓶中，加入稀释液超声20min溶解并稀释至刻度，摇匀过滤即得供试品溶液。平配制两份。
[0090]
(2)分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，使用离子色谱法对胶囊中烟酰胺核糖氯化物的含量进行检测；
[0091]
其中，离子色谱法的色谱条件包括以下内容：
[0092][0093]
(3)检测结果
[0094]
图8为实施例2提供的供试品2的色谱图，如图8所示，nr于7.687min处出峰，其峰面积为40.2157mau*min，通过对照品溶液峰面积外标法计算，供试品2的内容物中的nr质量含量为35.0％。
[0095]
实施例3
[0096]
本实施例提供一种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，所述检测方法包括
以下步骤：
[0097]
(1))溶液的配制：
[0098]
流动相a：乙腈，超声脱气10min；
[0099]
流动相b：150mm醋酸铵水溶液，超声脱气10min；
[0100]
空白溶液：乙腈-水(体积比为3:2)，也作稀释液。(图1为空白溶液谱图的色谱图，如图1所示，空白溶液中无干扰nr检测的色谱峰，待测色谱峰前后分离度均大于2)；
[0101]
对照品贮备液：称取50mg nr对照品置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为5mg/ml的对照品贮备液；
[0102]
对照品溶液：量取1ml对照品贮备液置10ml量瓶中，加入稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为0.5mg/ml的对照品溶液(图2为对照品溶液的色谱图，如图2所示，nr于7.893min位置出峰；
[0103]
系统适用性溶液：同对照品溶液；
[0104]
供试品溶液：称取胶囊内容物21.56mg(相当于含nr 12.5mg)置25ml量瓶中，加入稀释液超声20min溶解并稀释至刻度，摇匀过滤即得供试品溶液。平配制两份。
[0105]
(2)分别将供试品溶液和对照品溶液注入离子色谱仪中，使用离子色谱法对胶囊中烟酰胺核糖氯化物的含量进行检测；
[0106]
其中，离子色谱法的色谱条件包括以下内容：
[0107][0108]
(3)检测结果
[0109]
图9为实施例3提供的供试品3的色谱图，如图9所示，nr于7.687min处出峰，其峰面积为66.9560mau*min，通过对照品溶液峰面积外标法计算，供试品3的内容物中的nr质量含量为57.2％。
[0110]
实施例4-5
[0111]
本实施例提供两种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，与实施例1的区别仅在于，空白溶液(稀释液)中乙腈和水的体积比不同，具体如下表2所示：
[0112]
表2
[0113][0114]
图10为实施例4和5的对比图，如图10所示，稀释液中乙腈和水的体积比对nr的保留行为和峰面积影响较小，优选为3:2。
[0115]
实施例6-7
[0116]
本实施例提供两种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，与实施例1的区别仅在于，流动相中乙腈和150mm醋酸铵水溶液的体积比不同，具体如下表3所示：
[0117]
表3
[0118][0119]
图11为实施例6和7的对比图，如图11所示，稀释液中乙腈和水的体积比为优选为40:60；乙腈较少水较多会导致整体分析时间变长；乙腈较多水较少会导致nr与未知杂质分离不开。
[0120]
实施例8-9
[0121]
本实施例提供两种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，与实施例1的区别仅在于，流动相a和流动相b的选择不同，具体如下表4所示：
[0122]
表4
[0123][0124]
图12为实施例8和9的对比图，如图12所示，当流动相a为甲醇，流动相b为醋酸铵时，nr出峰时间较慢，分析时间多了近一倍；当流动相a为乙腈，流动相b为甲酸铵时，nr与前面未知杂质分离度要略差；本技术流动相a为乙腈，流动相b为醋酸铵水溶液才能达到很好地分离检测烟酰胺核糖氯化物的目的。
[0125]
实施例10-11
[0126]
本实施例提供两种胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，与实施例1的区别仅在于，色谱柱不同，具体如下表5所示：
[0127]
表5
[0128][0129]
图13为实施例10和11的对比图，如图13所示，采用cs12a色谱柱得到的nr色谱峰柱效低，有干扰峰；采用cs16色谱柱得到的nr色谱峰则保留时间长达14.633min，不适于快速分析；采用本技术所述dionex ionpac cs17阳离子交换色谱柱，才可满足对烟酰胺核糖氯化物的分离检测。
[0130]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的胶囊中烟酰胺核糖氯化物的分离检测方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。