铜团簇、胸腺嘧啶修饰的透明质酸和多聚铜团簇、其制备方法和应用与流程

铜团簇、胸腺嘧啶修饰的透明质酸和多聚铜团簇、其制备方法和应用
1.本发明专利申请是基于2019年1月16日提交的发明名称为“铜团簇、胸腺嘧啶修饰的透明质酸和多聚铜团簇、其制备方法和应用”的中国专利申请号 2019100391135的分案申请。
技术领域
2.本发明一般涉及纳米药物技术领域，并且更具体地涉及尤其涉及铜团簇 (cuncs)、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)和多聚铜团簇(pcuncs)、以及制备方法及其在检测、诊断和治疗中的应用；例如帕金森氏病。


背景技术：

3.神经退行性疾病是人类健康的主要威胁之一。其共同的病理特征是神经细胞中蛋白质的异常缠结和淀粉样变性，以及相关神经元凋亡和神经损伤。帕金森病(pd)是第二常见的神经退行性疾病，特征是震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、姿势不稳定和运动障碍。pd主要发生在老年人中，发病率随年龄增长而增加。据保守估计，世界上pd患者的数量已经超过1000万。然而，pd的病因尚不清楚。就临床治疗而言，尽管美国fda批准了几种药物用于治疗轻度和中度帕金森病，但这些药物是神经递质调节药物，只能暂时改善患者的认知或运动功能。停药后症状就会反弹。目前尚无药物能终止或逆转pd的病理过程。因此，开发新的药物治疗帕金森病具有极其重要的意义。
4.pd的主要病理特征是脑干、脊髓和皮层中多巴胺能神经元的缺失和细胞内蛋白样包涵体的存在，称为lewy小体。lewy小体主要由变性α-synuclein(α-syn) 聚集形成的淀粉样纤维组成。α-syn位于神经元的突触前膜末端，细胞内的自然状态为可溶性和开放状态。在病理条件下发生的α-syn错误折叠，产生β片状结构，这些结构又聚集和纤毛化形成lewy小体病变。
5.铜是人体许多生物功能所必需的稀有元素。α-syn对金属离子具有很强的亲和力，如cu
2
。cu
2 -α-syn相互作用与氧化应激的增加和有毒低聚物的产生有关，这些低聚物在体外在膜双层中形成孔状结构，改变电导活性，在体内破坏膜导致细胞死亡。此外，铜离子可以与多巴胺(da)协同结合到α-syn，在很大程度上增强α-syn的纤毛化。在pd患者中发现铜稳态失调。最近的研究显示黑质(sn) 中的总组织铜减少；但在脑脊液中发现高水平的非结合铜，可能导致运动障碍。高水平的cu
2
与pd相关。在此基础上，旨在调节pd患者铜稳态失调的治疗已被广泛评估。pd动物模型的临床前研究调查了先前描述的铜螯合剂氯喹在治疗中的潜在应用，并显示sn神经元存活。此外，对铜离子络合物cu
2
双乙酰双(4-甲基硫代氨基脲)(cu
2
(atsm))在四种不同的pd动物模型中的体内评估显示神经保护、认知功能的改善和运动功能的恢复(giampietro r,2018；kozlowski h,2012； tristan-lopez l,2014)。体外研究表明形成cu
2 -α-syn复合体(duzik cg,2011) 和铜离子依赖的α-syn胞内聚集物(mcrayalfa,2018)。
6.铜团簇(cuncs)是一种介于铜原子和铜纳米颗粒之间的物质，通常由几个到几十个铜原子组成，并在外面包裹着配体以保护其稳定存在(yao q,2018)。铜团簇由于具有独特的尺寸依赖的光电性质，常被用于纳米催化剂、生物传感、细胞标记以及光电相关的纳米器件研究(jin r,2016；liu x,2018)。利用铜团簇(cuncs)来治疗pd尚未见报道，利用某种化合物在体内直接将cu
2
直接转变为铜团簇(cuncs)或多聚铜团簇(pcuncs)则更未见报道。
7.manna等公开了一种用于药物递送的稳定多层膜，是基于在壳聚糖和透明质酸(ha)骨架上所替代的dna碱基(腺嘌呤和胸腺嘧啶)对之间的氢键而构建的。 chitosan用腺嘌呤修饰，而ha用胸腺嘧啶修饰。随后，利用dna碱基对通过氢键的相互作用，将这两种聚合物依次吸附在平坦的基底上。在此文中，以胸腺嘧啶修饰的ha和腺嘌呤修饰的壳聚糖配对使用，用于药物递送的被动载体。为了达到胸腺嘧啶修饰的ha和腺嘌呤修饰的壳聚糖之间的相互作用所需强度，选用了高取代度的胸腺嘧啶修饰的ha，例如超过75％(manna u,2009)。
8.杨等公开了一种基于聚(胸腺嘧啶)模板选择性形成铜纳米粒子(cunps)和炔
ꢀ‑
叠氮环加成“点击”反应的碱性磷酸酶荧光检测方法，其中cu

被用作cu资源，用于在维生素c和dna模板存在的条件下的cunps的合成(yang d；2018)。然而，杨等没有提示利用胸腺嘧啶作为配体来形成铜团簇。


技术实现要素：

9.本发明提供一个或多个配体修饰的铜团簇(cuncs)。在一些实施例中，所述配体修饰的铜团簇的直径在0.5-5nm的范围内。
10.在所述铜团簇的一些实施例中，所述配体修饰的铜团簇的直径在0.5-3nm的范围内。
11.在所述铜团簇的一些实施例中，所述配体修饰的铜团簇的直径在0.5-2.5nm 的范围内。
12.在所述铜团簇的一些实施例中，所述配体包括胸腺嘧啶，l(d)-半胱氨酸及其他半胱氨酸衍生物，如n-异丁酰基-l-半胱氨酸(l-nibc)、n-异丁酰基-d
‑ꢀ
半胱氨酸(d-nibc)、n-乙酰基-l-半胱氨酸、n-乙酰基-d-半胱氨酸等；含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不局限于含半胱氨酸的二肽、三肽、四肽及其它肽，如：l-半胱氨酸-l-精氨酸二肽(cr)、l-精氨酸-l-半胱氨酸二肽(rc)、 l-半胱氨酸l-组氨酸(ch)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(gcr)、l-脯氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(pcr)、l-谷胱甘肽(gsh)、甘氨酸-l-丝氨酸-l
‑ꢀ
半胱氨酸-l-精氨酸四肽(gscr)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-丝氨酸-l-精氨酸四肽 (gcsr)等；及其他含巯基的化合物，如1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l
‑ꢀ
脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、d-3-巯基缬氨酸、十二硫醇等中的一种或多种。
[0013]
本发明提供用于治疗帕金森氏病(pd)患者的组合物，其特征在于，所述组合物包括：所述铜团簇(cuncs)；药学上可接受的赋形剂。
[0014]
本发明提供使用所述铜团簇(cuncs)来制造治疗pd患者的药物。
[0015]
本发明提供一种治疗pd患者的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0016]
向pd患者施用有效剂量的治疗pd的组合物，所述组合物包含所述铜团簇 (cuncs)。
[0017]
本发明提供胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)，其特征在于，所述tmha 由式i表示：
[0018][0019]
其中，ha中胸腺嘧啶的取代度在1-50％的范围内，其中代表glca-glcnac重复数的n是一个从10到10000的整数。
[0020]
在所述tmha的一些实施例中，所述ha中胸腺嘧啶的取代度在4-30％的范围内。
[0021]
在所述tmha的一些实施例中，所述ha中胸腺嘧啶的取代度在5-20％的范围内。
[0022]
在所述tmha的一些实施例中，所述ha中胸腺嘧啶的取代度在7-16％的范围内。
[0023]
在所述tmha的一些实施例中，所述ha中胸腺嘧啶的取代度在8-15％的范围内。
[0024]
在所述tmha的一些实施例中，所述n是从10到1000的整数。
[0025]
在所述tmha的一些实施例中，所述n是从10到100的整数。
[0026]
本发明提供用于治疗帕金森氏病(pd)患者的组合物，其特征在于，所述组合物包括：所述胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)；药学上可接受的赋形剂。
[0027]
本发明提供使用所述胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)来制造治疗pd患者的药物。
[0028]
本发明提供一种治疗pd患者的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0029]
向pd患者施用有效剂量的治疗pd的组合物，所述组合物包含所述胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)。
[0030]
本发明提供检测溶液中铜离子的试剂盒，其特征在于，所述胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)；其中，通过荧光光谱仪检测620nm处的荧光来表示溶液中铜离子的存在。
[0031]
在所述检测溶液中铜离子的试剂盒的一些实施例中，所述溶液是尿液或血液。
[0032]
本发明提供检测溶液中铜离子的方法，其特征在于，所述方法包含：
[0033]
将该溶液与权利要求8-14所述tmha混合；
[0034]
孵化一段时间；
[0035]
用荧光光谱仪检测620纳米的荧光。
[0036]
在所述检测溶液中铜离子的方法的一些实施例中，所述溶液是尿液或血液。
[0037]
本发明提供多聚铜团簇(pcuncs)，其特征在于，所述pcuncs包括：所述的胸腺嘧啶修饰透明质酸(tmha)；多个铜团簇(cuncs)；其中，所述多个 cuncs沿tmha形成，而得以形成pcuncs。
[0038]
在所述pcuncs的一些实施例中，所述pcuncs中，cu和tmha的摩尔比为10:1至500∶1。
[0039]
在所述pcuncs的一些实施例中，所述多个cuncs的直径为0.5-3纳米。
[0040]
本发明提供用于治疗帕金森氏病(pd)患者的组合物，其特征在于，所述组合物包括：所述多聚铜团簇(pcuncs)的物质；药学上可接受的赋形剂。
[0041]
本发明提供使用所述多聚铜团簇(pcuncs)来制造治疗pd患者的药物。
[0042]
本发明提供一种治疗pd患者的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0043]
向pd患者施用有效剂量的治疗pd的组合物，所述组合物包含所述多聚铜团簇(pcuncs)。
[0044]
通过结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。
附图说明
[0045]
本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。
[0046]
图1-1(a)(i)显示式1所代表的tmha的结构；图1-2(a)(ii)演示tmha的合成，图1-2(a)(iii)和(iv)分别显示ha和tmha的典型外观；图1-3(b)分别显示 tmha(红线)和纯ha(蓝线)的紫外-可见光谱；图1-3(c)显示了ha和tmha 的ft-ir；图1-4(d)显示了ha和tmha的1h nmr谱。
[0047]
图2提供了曲线图，显示了(a)cu
2
和tmha之间的摩尔比、(b)反应ph值、 (c)反应温度和(d)反应时间对所得pcuncs的光致发光强度的影响。
[0048]
图3提供了曲线图，显示了(a)nacl浓度(0-1m)、(b)常见阳离子和阴离子、 (c)ph值(4-10)和(d)储存时间(0-5周)对所得pcuncs的荧光强度的影响。
[0049]
图4-1～图4-2提供了显示用胸腺嘧啶不同取代度(ds)的tmha制备的 pcuncs的照片和曲线图。图4-1(a)和(d)分别显示了用胸腺嘧啶的ds为3.2％的 tmha制备的pcuncs的tem或afm图像；图4-1(b)和(e)分别显示了用胸腺嘧啶的ds为10.5％的tmha制备的pcuncs的tem或afm图像；图4-1(c) 和(f)显示了用胸腺嘧啶的ds为20.1％的tmha制备的pcunc的tem或afm 图像。图4-1(g)和(h)分别显示了tmha和pcuncs的质谱，图4-2(i)和(j)分别显示了(i)cuncs的全区和(j)cu 2p区的xps光谱。在图4-1中，插图：(b，g，h) 分别是pcuncs纳米线、电离碎片和pcuncs的示意图；(e，f)组成纳米线的分离cuncs。
[0050]
图5是含有gsh配体的cuncs的热重分析的曲线图。
[0051]
图6是显示使用胸腺嘧啶的ds分别为3.2％(蓝色)、10.5％(红色)和20.1(绿色)时获得的cuncs的激发(在λem＝613nm处测量)光谱。
[0052]
图7显示：(a)不同胸腺嘧啶ds的pl光谱(左)和衰减曲线(右)。插图：365 纳米激发的图像。(b)tmha探针相对cu
2
含量的pl反应。(c)cu
2
对各种金属的tmha探针的pl和颜色变化(插入)。
[0053]
图8显示：(a)h2o2与cuncs反应的紫外吸光度。(b)cuncs和各种对照的gpx样活性的初始速率。(c)cuncs的sod样活性。插图：o2生成率。(d) cuncs与其它金属的催化活性的比较。
[0054]
图9显示用于pd早期诊断的尿中cu
2
的检测曲线图。
[0055]
图10(a)显示细胞活力数据的条形图(***p《0.001)；图10(b)显示pi染料染色的死(红)细胞，在4mm mpp

、2μm cu
2
和10μg ml-1
tmha的条件下处理细胞；图10(c)显示用钙黄素-am染色的活(绿)细胞。细胞在4mmpp

、10μm cu
2
和 10μg ml-1
tmha条件下进行处理。
[0056]
图11(a)显示细胞内ros水平的数据的条形图，***p《0.001；图11(b)显示了在4mm mpp

、10μg ml-1
tmha条件下处理并通过特异性荧光探针dcfh-da 染色的细胞内ros的clsm
图像；图11(c)显示了在4mmmpp

、10μgml-1
tmha、10μmcu
2
的条件下处理并通过特异性荧光探针dcfh-da染色的细胞内ros的clsm图像。
[0057]
图12(a)显示记忆缺陷小鼠的行进距离和跌倒潜伏期，***p《0.001；图12(b)显示大剂量mptp(30mgkg-1
)处理的动物的线粒体，其中经红线勾勒的线粒体显示肿胀、空泡状和严重的嵴。图12(c)显示了用mptp(30mgkg-1
) tmha(30mgkg-1
)处理的动物的线粒体，而通过红线勾勒出的线粒体显示出健康的形态。
[0058]
图13显示l-谷胱甘肽(gsh)修饰的cuncs(gsh-cuncs)对α-syn纤维化动力学的影响的曲线图。
[0059]
图14显示cuncs对mpp

损伤pd细胞(sh-sy5y)模型细胞活力影响的柱状图。
[0060]
图15-1～图15-3显示了cuncs的特征数据。图15-1(a)cuncs的典型透射电子显微镜(tem)图像。图15-1(b)根据tem图像计算的cuncs尺寸分布。图15-2(c)cuncs中铜(0)的2p
3/2
和2p
1/2
电子的x射线光电子能谱(xps)。图15-2(d)gsh改性cuncs(上)和gsh(下)的傅立叶变换红外光谱(ft-ir)比较。图15-3(e)cuncs的荧光激发(左)和发射光谱(右)。
具体实施方式
[0061]
可以通过引用以下的本发明的某些实施例的详细描述而更容易地理解本发明。
[0062]
在本技术中，为了更充分地描述本发明所涉及领域状态，当出版物被引用，这些出版物的公开内容的全部经引用而并入本技术。
[0063]
本发明提供胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)及其合成方法。
[0064]
tmha的结构由图1(a)(i)的式1所示，其中ha由葡萄糖醛酸(glca)-n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)重复序列组成，glcnac被胸腺嘧啶修饰，n是10-10000，优选10-1000，更优选10-100的整数。需要注意的是，ha中的不是每一个glcnac被胸腺嘧啶修饰的。胸腺嘧啶在tmha中的取代度(ds)定义为tmha的每100个糖残基中胸腺嘧啶分子的数量。胸腺嘧啶在tmha中的取代度(ds)在1-50％的范围内、优选地4-30％、优选地5-20％、优选地7-16％、优选地8-15％的范围内。
[0065]
合成tmha的方法包括：
[0066]
提供浓度为0.05-0.02w/v％的胸腺嘧啶酸性水溶液，在一些实施例中，酸性水溶液由水和hcl组成；
[0067]
提供浓度为1-5％(重量)的ha溶液；
[0068]
在ha溶液中加入催化剂；在一些实施例中，催化剂是聚磷酸酯；
[0069]
将胸腺嘧啶的酸性水溶液加入含催化剂的ha溶液中，形成ha-胸腺嘧啶混合物；在一些实施例中，胸腺嘧啶的酸性水溶液通过滴注加入；
[0070]
将ha-胸腺嘧啶混合物加热预定时间；在一些实施例中，加热温度为45-50℃，在油浴中加热12-20小时；将加热的ha-胸腺嘧啶混合物冷却到预定温度；在一些实施例中，预定温度约为0℃，以沉淀未反应的胸腺嘧啶；
[0071]
将从冷却的ha-胸腺嘧啶混合物的上清液进行透析；在一些实施例中，透析进行48-96小时，截留分子量8000，以去除未反应的试剂和杂质；
[0072]
将透析液冻干，得到tmha。
[0073]
本发明还提供了多聚铜团簇(pcuncs)及其合成方法。
[0074]
在一些实施例中，pcuncs合成方法包括：
[0075]
提供tmha溶液；在一些实施方案中，tmha溶液为0.1mm，ph7.0；
[0076]
向tmha溶液中加入cuso4溶液，在一些实施方案中，cuso4溶液为20mm， ph7.0，并且以滴状方式加入；
[0077]
从而允许混合物反应；在一些实施例中，在黑暗中37℃反应20分钟以获得pcuncs溶液；在黑暗中4℃储存pcuncs溶液以供使用。
[0078]
在紫外光(365nm)的辐射下，可以清楚地看到亮橙红色的发射，表明发光 cuncs的形成是成功的。
[0079]
在一些实施例中，cu和tmha之间的摩尔比在10:1至500:1的范围内，进一步在15:1至300:1的范围内，进一步在20:1至200:1的范围内，进一步在25:1 至100:1的范围内，并且进一步在30:1至80:1的范围内。
[0080]
pcuncs含有分散良好的球形纳米团簇，直径为0.5-3nm。
[0081]
本发明提供tmha在溶液中检测铜离子的用途。在一些实施例中，该溶液是生物液体，如尿液和血液。在一些实施例中，通过将溶液与tmha混合、孵育一段时间、以及通过荧光光谱仪检测620nm处的荧光来进行检测。
[0082]
本发明也提供了一种治疗帕金森病(pd)患者的组合物。
[0083]
在一些实施例中，该组合物包括铜团簇(cuncs)，以及药学上可接受的赋形剂。
[0084]
在一些实施例中，该组合物包括胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)，以及药学上可接受的赋形剂。
[0085]
在一些实施例中，该组合物包括多聚铜团簇(pcuncs)的物质，以及药学上可接受的赋形剂。
[0086]
本发明也提供了铜团簇(cuncs)、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)和多聚铜团簇(pcuncs)在制备用于治疗pd的药物中的应用。
[0087]
本发明也提供了治疗pd患者的方法。
[0088]
在一些实施例中，该方法包括：向患者施用有效剂量的组合物，该组合物包含铜团簇(cunc)。
[0089]
在一些实施例中，该方法包括：向患者施用有效剂量的组合物，该组合物包含胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)。
[0090]
在一些实施例中，该方法包括：向患者施用有效剂量的组合物，该组合物包含多聚铜团簇(pcuncs)。
[0091]
在一些实施例中，pd患者通过腹腔注射施用tmha或pcuncs的有效剂量。在一些实施例中，有效量在2-100mg kg-1
的范围内。
[0092]
本发明提供了由一个或多个配体修饰的铜团簇(cuncs)。在一些实施例中，所述配体修饰的铜团簇的直径在0.5-5nm的范围内，优选地在0.5-3nm，更优选地在0.5-2.5nm的范围内。在一些实施例中，配体包括，但不局限于，胸腺嘧啶， l(d)-半胱氨酸及其他半胱氨酸衍生物，如n-异丁酰基-l-半胱氨酸(l-nibc)、 n-异丁酰基-d-半胱氨酸(d-nibc)、n-乙酰基-l-半胱氨酸、n-乙酰基-d-半胱氨酸等；含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不局限于含半胱氨酸的二肽、三肽、四肽及其它肽，如：l-半胱氨酸-l-精氨酸二肽(cr)、l-精氨酸-l-半胱氨酸二肽(rc)、l-半胱氨酸l-组氨酸(ch)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽 (gcr)、
l-脯氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(pcr)、l-谷胱甘肽(gsh)、甘氨酸-l-丝氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸四肽(gscr)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-丝氨酸-l-精氨酸四肽(gcsr)等；及其他含巯基的化合物，如1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、d-3-巯基缬氨酸、十二硫醇等中的一种或多种。
[0093]
提供下面实施例的唯一目的是说明本发明的原理；它们决不旨在限制或缩小本发明的范围。
[0094]
实施例一、胸腺嘧啶修饰的透明质酸(tmha)的合成
[0095]
首先制备聚磷酸酯作为催化剂。将二乙醚(14.5ml)和chcl3(5.6ml)加入五氧化二磷(10g)中，搅拌，在50℃下回流加热12h，得到澄清溶液。冷却至室温后，在真空下蒸馏除去溶剂。所得到的无色粘性残渣是聚磷酸酯，用作催化剂而无需进一步纯化。
[0096]
tmha合成如下。溶于添加了0.25ml浓盐酸溶液(25％)的25mlh2o中，得到清澈的胸腺嘧啶溶液(23.6mg)。将聚磷酸酯(1.5g)加入ha溶液(50ml， 2.2wt％；mw120kd)，然后滴注胸腺嘧啶，混合物在油浴中加热到50℃，16h，冷却到0℃以沉淀未反应的胸腺嘧啶。然后，通过透析袋(截留分子量8000) 对上清液透析72小时，以去除任何未反应的试剂和杂质。将得到的溶液冻干得到tmha，产率为86％，取代度(ds)为10.5％。通过1h nmr和ft-ir对最终产物的质量进行了分析。
[0097]
现在参考图1-1～图1-4，图1-2(a)(ii)示出了tmha的合成，图1-2(a)(iii)和 (iv)分别显示了ha和tmha的典型外观；图1-3(b)分别显示了tmha(红线)和纯ha(蓝线)的紫外-可见光谱；图1-3(c)显示了ha和tmha的ft-ir；以及图 1-4(d)显示ha和tmha的1h nmr谱。在10mg ml-1
样品浓度下，在d2o 中以80℃和400mhz进行1h nmr谱分析。在ftir分析中，样品制备过程中使用kbr晶体作为基体。
[0098]
通过比较天然ha及其衍生物的光谱，用ftir对tmha共轭物的化学结构进行了定性研究。与天然ha相比，这些光谱在3000-3200cm-1
和1300-1800cm-1
的范围内显示出显著的差异，特别是对于具有较高ds的tmha衍生物。天然 ha的特征峰分配是：3360cm-1
(次级o-h伸展)，2873cm-1
(c-h伸展)，1622cm-1 (酰胺ii带，乙酰基的c-o伸展)，1554cm-1
(酰胺ii带，n-h伸展)，1380cm-1 (ch2组的不对称c-h伸展弯曲)，1314cm-1
(初级醇基的o-h伸展)和1026cm-1 (涉及桥c-o伸展的骨骼振动)。tmha衍生物的光谱显示三个特征峰，即3195 和3079cm-1
(n-h伸展)、1730cm-1
(c＝o伸展)和1340cm-1
(c-n伸展振动)，提示胸腺嘧啶对ha的功能化。更重要的是，由于属于ha的初级醇基的o-h 伸展，在1314cm-1
处的一条带消失，表明ha的glcnac中只有初级-oh基团与胸腺嘧啶发生反应。1h nmr分析进一步证实了成功的修饰。
[0099]
实施例二、用tmha合成多聚铜团簇(pcuncs)
[0100]
10ml tmha(ds为10.5％)溶液(0.1mm，ph 7.0)逐渐加热至37℃，溶解tmha。滴加2ml硫酸铜(20mm，ph 7.0)溶液，在黑暗下37℃再反应 20分钟。在紫外光(365nm)的照射下，可以清楚地看到亮橙红色的发射，表明发光pcuncs的形成是成功的。最后，将所得溶液在黑暗中4℃储存，备用。
[0101]
分别研究了cu
2
/tmha的摩尔比、ph值、反应温度、反应时间等最佳合成条件。为了考察反应体系中cu
2
含量的影响，在10ml的tmha溶液中加入 2ml不同浓度的cuso4，使反应体系中cu
2
与tmha的摩尔比为5:1、10:1、 15:1、20:1、30:1、40:1、60:1、80:1、100:1。黑暗中在37℃和ph 7.0下温和搅拌反应20min后，得到胶体样品，并用发光分光光度计进行测定。
为了更好地理解ph值对pcuncs形成的影响，在另外相同的环境条件下，以1.0m naoh 或1.0m hcl调节不同ph值，进行了一系列实验。同样研究了反应温度(20～ 70℃)和反应时间(1～25min)对反应的影响。用荧光分光光度计对所得样品进行测试。
[0102]
现在参考图2，显示了(a)cu
2
与tmha的摩尔比、(b)反应ph值、(c)反应温度和(d)反应时间对所得pcuncs的光致发光强度的影响。如图2(a)所示， pcuncs的荧光强度随cu
2
与tmha的摩尔比从5增加到40而增强，随 cu
2
/tmha比从40增加到100而逐渐降低。如图2(b)所示，反应ph值在形成高质量的pcuncs中起着重要作用。随着反应ph值从4增加到7，pcuncs的荧光强度显著升高，然后开始迅速下降。例如，在反应ph 10时，pcuncs的发射很难通过荧光光谱法监测。如图2(c)所示，反应温度在20～50℃范围内是形成高荧光pcuncs的理想参数。如图2(d)所示，随着合成时间从1分钟延长到8 分钟，制备的pcuncs的荧光强度显著提高，当时间持续增加到25分钟时， pcuncs的荧光强度保持不变。在ph 7.0溶液中,cu
2
和tmha的摩尔比约为 40,然后在37℃下反应4h,所得pcuncs的荧光强度最高。
[0103]
实施例三、pcuncs的稳定性研究
[0104]
pcuncs发光稳定性的评价按以下步骤进行。首先，将不同浓度的氯化钠溶液(100μl)与pcuncs溶液(900μl)混合，在25℃下孵育30分钟；其次，将500μl的pcuncs溶液与各种正负离子溶液(500μl，2mm)充分混合，在 25℃下孵育30分钟。再其次，将naoh(1.0m)或hcl(1.0m)引入5ml pcuncs 溶液中，调节体系ph值，在25℃下孵育30分钟。最后，在激发波长385nm和发射波长610nm处测量了pcunc的荧光光谱。
[0105]
现在参考图3，显示了(a)nacl浓度(0-1m)、(b)常见阳离子和阴离子、(c)ph 值(4-10)和(d)储存时间(0-5周)对所得pcuncs的荧光强度的影响。如图3(a)所示，在不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0m)的氯化钠溶液中，pcuncs的荧光强度保持不变，表明pcuncs在强离子强度环境中具有良好的稳定性。更重要的是，在pcuncs溶液中加入2mm其它传统金属离子，如na

、ba
2
、fe
3
、gd
3
、 sn
4
和阴离子，如cl-、co
32-、po
43-、c2o
42-、c6h5o
73-，发现所有这些选定离子对荧光强度的干扰都可忽略不计(图3(b))。在图3(c)中也显示了类似的稳定荧光性能。将ph值从4.0调整到10.0几乎不影响pcuncs的相应荧光光谱。显然，在本缓冲体系中，pcuncs对ph值不敏感。此外，在室温(25℃)下在空气中储存5周后，pcuncs没有观察到沉淀、絮凝或荧光强度下降(图3(d))。这些结果表明我们的pcuncs具有优异的稳定性，使它们在实际应用中非常有前景。
[0106]
实施例四、胸腺嘧啶在tmha中的取代度(ds)对pcuncs合成的影响
[0107]
透明质酸(ha)和胸腺嘧啶是两个天然的生物分子，胸腺嘧啶负责有效地螯合cu
2
，ha的羟基作为金属团簇成核和生长的还原剂。本发明的发明人发现胸腺嘧啶的取代度(ds)是合成pcuncs的一个关键调节因子。在ph 7.0的溶液中， cu
2
和tmha的摩尔比约为50，然后在37℃下反应4h。
[0108]
现在参见图4-1～图4-2，显示用胸腺嘧啶不同取代度(ds)的tmha制备的 pcuncs的照片和曲线图。图4-1(a)和(d)分别显示了用胸腺嘧啶的ds为3.2％的 tmha所制备的pcuncs的tem或afm图像；图4-1(b)和(e)分别显示了用胸腺嘧啶的ds为310.5％的tmha所制备的pcuncs的tem或afm图像；图4-1(c)和(f)分别显示了用胸腺嘧啶的ds为20.1％的tmha所制备的 pcuncs的tem或afm图像。图4-1(g)和(h)分别显示了tmha和pcuncs的质谱，图4-2(i)和(j)分别显示了(i)cuncs的全区和(j)cu 2p区的xps光谱。在图 4-1中，插图：(b，g，h)
分别是pcuncs纳米线、电离碎片和pcuncs的示意图；，f)组成纳米线的分离cuncs。
[0109]
胸腺嘧啶的ds为10.5％时，生成直径为1.64
±
0.48nm的均匀分散球形 cuncs。相比之下，在低(3.2％)和高(20.1％)水平下，大量绒毛状cuncs分别以1.08
±
0.72nm和1.96
±
0.83nm直径存在。随后，在另外相同的实验因素下用空白ha替换tmha仅显示严重融合的大分子网络(图4-2(i)和图4-2(j))。更令人惊讶的是，10.5％的ds可以得到直径为8.05
±
0.43nm的pcuncs纳米线的一维组装(图4-1(b)和图4-1(e))。当胸腺嘧啶的ds增加到20.1％时，纳米线的形状部分由于严重衰减的长度/直径比而变得模糊(图4-1(c)和图4-1(f))。 cuncs和线性tmha模板之间的微调共价键保证了cuncs被自组装成高度有序的阵列，即pcuncs。我们强调，基于聚集诱导发射(aie)的概念，这种纳米线有效地改善了pcuncs的荧光稳定性和强度(见下文)。
[0110]
实施例五、用其它配体取代胸腺嘧啶
[0111]
为了更清楚地检测形成纳米线的单个cuncs，在不改变金属芯尺寸的情况下，通过生成更强的cu-s键，胸腺嘧啶配体被硫代物取代。当gsh作为配体如预期那样形成cuncs时，它的使用容易将母纳米线分解成其构建单元，即 cuncs。如图5所示，图中显示了具有gsh配体的cuncs的热重分析。这里，采用配体交换策略将母纳米线分解成其构建块，例如cuncs。将制备好的tmha 作为模板的cuncs(1ml)加入gsh水溶液(0.05m，5ml)中，在室温下搅拌8h。随着反应的进行，会产生白色沉淀。在8000rpm下离心10分钟左右，得到的上清液；加入乙醇从上清液中沉淀出gsh稳定的cuncs，用乙醇反复洗涤 3次。最后，将产品冷冻干燥后储存在冰箱中进行长期保存。
[0112]
实施例六、pcuncs的鉴定
[0113]
值得注意的是，ds在10.5％时形成完整、球形和均匀的cuncs，通过截面轮廓分析和多分散性指数进行了验证。通过仔细计算hr-tem图像，发现条纹间距为0.207nm，与面心金属cu的(111)晶面非常匹配。图6显示使用胸腺嘧啶的ds分别在3.2％(蓝色)、10.5％(红色)和20.1(绿色)下获得的cuncs的激发(在λem＝613nm处测量)光谱的图。
[0114]
在以下章节中，除非另有说明，有意使用了由ds为10.5％的tmha来制备pcuncs。
[0115]
作为电子显微镜的补充，质谱(ms)已被证明是团簇尺寸分析中更可靠的工具。试图利用高分辨电喷雾电离质谱(esi-ms)技术鉴定亚纳米cuncs的精确分子式。值得注意的是，纯ha没有任何可见的离子信号，主要是由于它在正离子模式下电离效率低。相反，tmha的正电离在m/z＝106.1936(图4-1(g))下产生单峰。由于胸腺嘧啶hnco的丢失,可归纳出式[c4h5no

na]。在筛选了几个测量参数后得出，c4h5no而不是thma作为cuncs电离中的配体，帮助释放出丰富的离子信号。这些传递适当的能量以促进胸腺嘧啶的分解的，因此选择为最佳的，参数为毛细管电压为4500v左右，干燥温度为150℃。结合元素分析和 m/z＝1043.2545(图4-1(h))时的最高离子峰，确定cuncs的定式为cu6l5。低质量范围内的其他离子峰也与含cu6物种的碎片精确对应。结果表明，cu6簇是优势物种，与胸腺嘧啶的ds分别为3.2％和20.1％的tmha对照组相比，胸腺嘧啶的ds为10.5％的tmha合成的cuncs具有优越的单分散性。
[0116]
x射线光电子能谱(xps)分析表明，cuncs由所有预期的元素组成，包括c、 o、n、cu。计算cuncs中的无机含量为29.8重量％。此外，在932.3和952.1ev 两个强信号被指定为cu0的2p
3/2
和2p
1/2
电子的结合能，并且没有卫星信号暗示缺少cu
2
。值得一提的是，cu0的2p
3/2
结
合能与cu

的结合能非常接近。因此，制备的cuncs的价态很可能介于0和 1之间。
[0117]
现在参考图7，显示：(a)具有不同胸腺嘧啶ds的pl光谱(左)和衰减曲线 (右)。插图：365纳米激发的图像。(b)tmha探针的pl反应相对于cu
2
含量。 (c)用于cu
2
的tmha探针对各种金属的的pl和颜色变化(插入)。
[0118]
实施例七、tmha作为铜离子检测的探针
[0119]
5份尿样，其中3份来自健康成人志愿者，其余的来自患有pd的成年志愿者，用乙腈稀释以去除尿中蛋白质和其他生物物质的干扰。在10℃，以12000rpm 的速度离心10分钟后，收集上清液用于以下实验。首先，用去离子水稀释上清液，以降低上清液中残留的cu
2
浓度。然后，将100μl尿样与200μl tmha (0-40μg ml-1
)混合，在25℃下孵育10分钟后用荧光光谱仪检测。
[0120]
明显地，在560nm处，光学特征明显不同于大尺寸铜纳米粒子的表面等离子体共振。xrd峰向基线的展宽与cuncs的微小尺寸一致。有趣的是，亚纳米级的cuncs具有ds依赖的光致发光(pl)特征。在385nm的激发下，10.5％ds 诱导的纳米线在613nm峰处产生明亮而稳定的红光发射，长寿命为57s，大量子产率为14.8％(图7(a))。对于那些不那么有序的cuncs组装，这些特性衰退迅速，暗示了自组装驱动的aie。更紧密和有序地包裹的cuncs，更稳定和强烈的pl 反应。通过调节反应因素，我们的简洁合成路线依赖于tmha(螯合，还原cu
2
和模板自组装成cunc纳米线)，消除了传统路线引入的杂质，并提供了引人注目的pl性能。例如，tmha传感器的pl强度是线性的，根据cu
2
浓度明确地改善(图7(b))，对应于2.2ppb的极低检测限度。与目前报道的方法相比，该分析性能分别比美国环保署的最新探针和最大饮用水量小约1.5倍和480倍。此外，在图7(c)中，与外来离子相比，光学性质对cu
2
有选择性。总之，tmha可作为高灵敏度、高选择性的铜离子比色和荧光探针。
[0121]
实施例八、cuncs的抗氧化功能
[0122]
研究了cuncs功能模拟细胞抗氧化酶的能力。引人注目的是，cuncs可以基于一级反应动力学而剧烈分解h2o2(图8(a))。然后我们通过nbt方法研究了功能模拟的gpx样活性。在各种分析条件下记录的初始速率显示在图8(b)中，它直接支持cuncs的gpx样功能。此外，cuncs具有非常显著的sod样活性，从ko2作为超氧化物源产生大量o2推导出工作原理：超氧化物歧化成h2o2和 o2(图8(c))。此外，cuncs比用作细胞抗氧化剂的现有金属具有明显的多酶优势(图8(d))。
[0123]
现在参见图8，显示：(a)h2o2与cuncs反应的紫外吸收率。(b)cuncs 和各种对照的gpx样活性的初始速率。(c)cuncs的sod样活性。插图：o2生成率。(d)cuncs与其它金属的催化活性的比较。
[0124]
实施例九、tmha对pd的无创诊断
[0125]
以tmha为探针，测定人尿中cu
2
的含量。令人兴奋的是，红色荧光仅出现在pd患者的尿液样本中。考虑到其特异性高，操作简单，tmha可能为pd 的早期诊断和风险评估开辟了新的机遇。
[0126]
现在参考图9，显示尿液中cu
2
的检测用于pd的早期诊断。
[0127]
实施例十、体外细胞保护实验
[0128]
pc12(大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞系)、shsy-5y(人神经母细胞瘤细胞系)和hek293(人胚胎肾细胞系)细胞培养，dmem培养基，另外添加10％(v/v) 胎牛血清、2mm l-谷
氨酰胺、100u ml-1
青霉素和100μg ml-1
链霉素；37℃， 5％co2。
[0129]
采用甲基噻唑四氮唑(mtt)法，通过测定细胞活力，测定体外细胞毒性。为了进行mtt分析，shsy-5y细胞以每孔5000个存活细胞的密度接种在96孔板中，培养24小时以允许细胞附着。然后，用空白tmha溶液(不添加cu
2
) 在指定的浓度下培养细胞。随后将细胞在37℃和5％co2下孵育24小时。然后用含5mg ml-1
mtt的新鲜dmem代替培养基，再培养4小时。去除mtt溶液后，用dmso溶解紫色甲烷晶体，用微板阅读器在570nm处监测吸光度 (fl600，bio-tek)。结果表示为三个测量值的平均值。用同样的方法测定了纯 thma对hek 293细胞和pc12细胞的体外细胞毒性。tmha无毒性，剂量高达500μg ml-1
。
[0130]
在实验性pd模型中评价tmha对细胞的保护作用。它是用mptp(1-甲基
ꢀ‑
4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)的活性代谢产物mpp

(1-甲基-4-苯基吡啶)处理大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pc12)而产生的。
[0131]
1-甲基-4-苯基-1,2，3，6-四氢吡啶(mptp)是一种神经毒素。它本身无毒，但进入大脑后，新陈代谢产生的1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(mpp

)会破坏黑质中da能神经元。同时，mpp

还可以干扰线粒体代谢呼吸链中的重要物质nadh 脱氢酶，导致细胞死亡和自由基的积累。此过程导致da能神经元大量死亡，严重影响大脑皮层的运动控制，导致类似的pd症状。因此，mptp和mpp

被广泛用于pd相关动物模型和细胞模型的建立以及pd药物的研究和开发。
[0132]
在不存在或存在cu
2
和thma的条件下，在6孔板中培养pc12细胞。然后加入不同浓度的mpp

(0.5-4mm)。mtt法测定细胞的相对存活率。4mm mpp

触发pc12细胞的严重细胞毒性(即仅小于20％细胞存活率)。令人兴奋的是，8 μm cu
2
和10μg ml-1
tmha完全逆转4mm mpp

诱导的细胞毒性(即超过80％的细胞存活率)。细胞存活率的数据如图10(a)所示(**p＜0.001)。
[0133]
共聚焦激光扫描显微镜(clsm)观察细胞形态学变化。为了在clsm上观察活细胞和死细胞，用3
′
,6
′‑
二(o-乙酰基)-4
′
,5
′‑
双[n,n-双(羧甲基)氨基甲基]荧光素 (即四乙酰氧基甲酯(钙黄素-am))染色活细胞，产生绿色荧光 (λ
ex
＝490nm,λ
em
＝515nm)，用碘化丙啶(pi)染色死细胞，产生红色荧光(λ
ex
＝535 nm，λ
em
＝617nm)。具体而言，在去除培养基后，分别加入0.1ml钙黄素-am 溶液(20mm)和0.1ml pi溶液(20mm)。培养10分钟后，这两种染色液迅速去除，并用pbs漂洗两次。所获得的细胞可以随后通过clsm观察。图10(b) 显示用pi染料染色的死(红)细胞，其中细胞处理的条件为4mm mpp

、2μm cu
2
和10μg ml-1
tmha；图10(c)显示用钙黄素-am染色的可活(绿)细胞，其中细胞处理的条件为4mm mpp

、10μm cu
2
和10μg ml-1
tmha。
[0134]
为了用clsm直接观察活性氧(ros)，首先将pc12细胞接种在clsm专用培养盘中，在37℃,5％co2气体下进行过夜粘附。以2’,7
’‑
二氯荧光素二乙酸酯 (dcfh-da)1ml培养20min后，用含有以下物质的新鲜培养基(ph＝7.4)代替培养液：(a)4mm mpp 作为对照；(b)4mm mpp ，10μg ml-1
tmha；(c)4mm mpp ， 10μm cu
2
；(d)4mm mpp ,10μg ml-1
tmha,2μm cu
2
；(e)4mm mpp ,10μgml-1
tmha,4μm cu
2
；(f)4mm mpp ,10μg ml-1
tmha,6μm cu
2
；(g)4mmmpp ,10μg ml-1
tmha,8μm cu
2
；(h)4mm mpp ,10μg ml-1
tmha,10μm cu
2
。在37℃、5％co2浓度下再次孵育30分钟后，用新鲜pbs洗涤细胞两次。通过检测新生dcf(λ
ex
＝488nm，λ
em
＝525nm)的荧光来评价细胞内ros水平。胞内ros 水平的数据见图11(a)；*p＜0.001。
[0135]
图11(b)显示了在4mm mpp 和10μgml-1
tmha条件下处理的细胞中胞内ros的clsm图像，并通过特定荧光探针dcfh-da染色；图11(c)显示了在4 mm mpp ,10μml-1
tmha,10μm cu
2
条件下处理的细胞中胞内ros的clsm图像，经特定荧光探针dcfh-da染色。ros特异性荧光强度明显下降，表明tmha 能有效清除细胞内升高的ros。特征性1：2：2：1羟自由基自旋进一步证实了 tmha处理减少胞内ros。
[0136]
实施例十一、体内保护实验
[0137]
一般认为，施用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(mptp)可导致动物产生与人类散发性pd非常相似的临床症状。因此，我们的实验中，我们利用 mptp来产生pd动物模型。c57bl/6小鼠随机分为7组(n＝每组小鼠5只)，即：空白对照组(生理盐水)、高剂量tmha组(100mg kg-1
)、低剂量tmha组(50mgkg-1
)、高剂量mptp组(30mg kg-1
)、低剂量mptp组(10mg kg-1
)、mptp tmha 组(30mg kg-1
10mg kg-1
)和mptp tmha(30mg kg-1
20mg kg-1
)。特别地，对于模型组，通过连续腹腔注射mptp至少4天来产生pd小鼠模型。空白对照组和 thma组分别用生理盐水和thma治疗。其余mptp tmha组，预先0.5h腹腔注射tmha(10或20mg kg-1
)(每天一次)，然后腹腔注射30mg kg-1
mptp 7天。
[0138]
通过游泳试验评估运动功能。每只动物放置在直径为120厘米和高度为80 厘米的圆形水池中。水的深度(25℃)为60厘米。使用跟踪系统(上海吉良软件技术有限公司)以10分钟间隔记录行程距离(cm 10min-1
)和持续时间(sec)。使用 rotrod(ugo basile)测量运动协调和平衡。小鼠在旋转杆上进行3次15分钟的试验，每次试验以10rpm开始，30s内加速至22rpm。试验间歇时间为3分钟。测量各组从杆上摔下来的时间，并进行平均。图12(a)显示记忆缺失小鼠的行走距离和跌倒潜伏期，*p＜0.001。这些数据表明tmha处理可以恢复mptp 处理的动物的认知活动。
[0139]
线粒体形态学改变是ros诱导线粒体功能障碍的早期重要标志。在这里，我们使用tem观察线粒体形态改变。通常，c75bl/6小鼠的脑组织在放入环氧树脂之前，依次在冷的含有2.5％戊二醛的0.1m pbs(ph 7.2)和含有2％多聚甲醛的0.1m磷酸缓冲液(ph 7.2)的混合物中连续固定过夜。将包埋好的样品装入胶囊中，在38℃下聚合9h，然后在60℃下聚合48h。在透射电子显微镜(jem-2100f) 检查之前，将合适的薄切片区域切成小于100nm的厚度，在80kv下用饱和4％乙酸铀酰/4％柠檬酸铅染色。图12(b)显示了用大剂量mptp(30mg kg-1
)处理的动物的线粒体，而如红线划出的轮廓，线粒体显示肿胀、空泡状形状和严重的嵴破坏；相比之下，图12(c)显示了用mptp(30mg kg-1
) tmh(30mg kg-1
)处理的动物的线粒体；如红线划出的轮廓，线粒体显示健康的形态。
[0140]
实施例十二、具有不同配体的单个cuncs的α-syn聚集动力学实验
[0141]
根据文献，制备了不同配体修饰的cuncs。硫黄素t(缩写：tht)是一种特别用于染色淀粉样纤维的染料。当tht与多肽或蛋白质的单体一起孵育时，其荧光没有显著变化。当tht遇到具有纤维结构的淀粉样多肽或蛋白质时，它会立即与淀粉样多肽或蛋白质偶联，其荧光强度将呈指数增加。因此，tht被广泛用作监测多肽或蛋白质淀粉样变性的标记物。本实施例采用tht荧光标记法监测在cuncs存在下α-syn的纤维化聚集动力学过程。具体实验方法如下：
[0142]
α-syn单体的预处理：将冷冻干燥的α-syn粉末(bachem corp.)溶于hfip中得到1g/l的α-syn溶液，封口后在室温下保温2-4h，然后在通风柜用高纯氮气以适当的流速吹干
hfip，溶解干燥α-syn在200μldmso，密封溶液，将其保存在20℃冰箱中以备将来使用，最多一周。使用前，用大量磷酸盐缓冲液(pbs，10mm，ph＝7.4)将α-syndmso溶液稀释到20μm，得到α-synpbs溶液。实验中所有的α-syn-pbs溶液均在使用前制备。
[0143]
样品制备和检测：在α-synpbs溶液中加入配体修饰的cuncs，使cuncs和α-syn分别达到5ppm和35μm的最终浓度。37℃将溶液在96孔板中连续孵育，每10分钟用微型板读出器监测荧光强度，通过tht荧光强度的变化鉴定α-syn聚集的动力学过程。实验组采用配体修饰的cuncs。配体对照组采用不与cuncs结合的配体分子。空白对照组仅采用α-syn。
[0144]
现在参考图13，显示l-谷胱甘肽(gsh)修饰的cuncs(gsh-cuncs)对-syn纤维化动力学的影响。结果表明，在37℃孵育35μmα-syn的过程中，tht标记的荧光强度从25小时开始迅速增加，表明α-syn发生了聚集和纤维化。配体对照组结果表明，单独使用配体gsh对α-syn的聚集动力学无明显影响。对于添加cuncs的实验组，在70小时内tht标记的荧光强度基本保持在基线附近，无任何增加，表明gsh修饰的cuncs能完全抑制α-syn聚集和纤维化，其作用来源于cuncs，但不是gsh配体。
[0145]
在本实施例中，还使用相同的方法研究了用其他配体修饰的cunc，例如l(d)-半胱氨酸、n-异丁酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nibc)和n-乙酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nac)。用不同配体修饰的cuncs也观察到类似的现象，并得出相同的结论：这些配体本身不能影响α-syn的聚集和纤维化，而配体修饰的cuncs可以完全抑制α-syn的聚集和纤维化。
[0146]
实施例十三、mpp 诱导的pd细胞(sh-sy5y)模型实验
[0147]
本实验以cck-8法测定的细胞活力为指标，反映配体修饰的cuncs对pdsh-sy5y神经细胞模型中mpp (一种常用的神经毒素)的毒性作用的抵抗作用，以证明其对pd的神经保护作用。具体方法：
[0148]
1)取对数生长期的sh-sy5y细胞，用完全培养基稀释，形成细胞密度为5
×
104/ml的细胞悬液，将200μl细胞悬液放入96孔平板的每一孔中，在37℃和5％co2的环境中培养。在细胞附着后加入样品。
[0149]
2)添加100μl配体修饰cuncs样品或不同粒径的配体修饰铜纳米颗粒样品，样品制备于维持培养基，最终浓度分别为0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm和20ppm。用配体修饰的cuncs预处理2小时后，分别向给药组和细胞对照组加入mpp (最终浓度为1mm)，同时设空白对照组，不含sh-sy5y细胞，阴性对照组含sh-sy5y细胞，不含cuncs和mpp ，含有sh-sy5y细胞和仅含1mmmpp 的细胞对照组，含有sh-sy5y细胞和100ppmcuncs但不含mpp 的样品对照组，以及含有sh-sy5y细胞和1mmmpp 以及相应的配体分子(最终浓度为20ppm)的配体对照组，在37℃孵育24h，离心除去培养基，加入含10％cck-8的100μl维持培养基，孵育4h，在450nm处测量各孔的吸光度，以反映配体修饰cuncs对mpp les的预保护和治疗效果。
[0150]
现在参考图14，显示cuncs对mpp 损伤pd细胞(sh-sy5y)模型细胞活力的影响。结果表明，培养24小时后，加入100ppmcuncs，但未经mpp 处理的对照组，与空白对照组(设定为100％)相比，其细胞存活率为110
±
6.2％(p＜0.01)，提示cuncs无毒。添加1mmmpp ，但无cuncs模型对照组，其细胞存活率下降至58.9
±
5.4％(p＜0.01，与空白对照组相比)；配体对照组的细胞成活率为56.9
±
3.4％(p＜0.01，与空白对照组相比)，提示单独使用配体不能提高mpp 损伤细胞模型的生存能力。而添加0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm和20ppmcuncs各组的细胞存活率则分别提高到70.9
±
7.1％(p《0.001，与模型对照组相比)、89.3
±
4.1％
(p《0.001，与模型对照组相比)、90.5
±
6.1％(p《0.001，与模型对照组相比)、92.8
±
4.8％(p《0.001，与模型对照组相比)和88.5
±
1.4％(p《0.001，与模型对照组相比)，提示本发明提供的配体修饰的cuncs对pd的神经细胞具有显著的保护作用，这种作用也来源于配体以外的cuncs。
[0151]
还采用相同的步骤对其它配体修饰的cuncs进行实验，如l(d)-半胱氨酸、 n-异丁酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nibc)和n-乙酰基-l(d)-半胱氨酸 (l(d)-nac)。效果是相似的，所以这里将不作详细描述。
[0152]
实施例十四、铜团簇的表征
[0153]
合成了一种或多种配体修饰的铜团簇，合成方法参照文献。配体包括胸腺嘧啶，l(d)-半胱氨酸和其他半胱氨酸衍生物，例如n-异丁酰-l-半胱氨酸 (l-nibc)、n-异丁酰-d-半胱氨酸(d-nibc)、n-乙酰-l-半胱氨酸和n-乙酰-d
‑ꢀ
半胱氨酸、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物，包括但不限于二肽、三肽、四肽和其他含半胱氨酸的肽，如l-半胱氨酸-l-精氨酸二肽(cr)、l-精氨酸-l-半胱氨酸二肽(rc)、l-半胱氨酸l-组氨酸(ch)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽 (gcr)、l-脯氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(pcr)、l-谷胱甘肽(gsh)、甘氨酸-l-丝氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸四肽(gscr)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-丝氨酸-l-精氨酸四肽(gcsr)和其他含硫醇的化合物，例如1-[(2s)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-l-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、硫酚、d-3-特洛洛韦醇和十二烷基硫醇中的一种或多种。
[0154]
作为一个实例，以下为gsh修饰的铜团簇的表征数据。
[0155]
1)通过透射电镜(tem)的形态观察
[0156]
将试验粉末(gsh修饰的铜团簇样品)溶解于超纯水中，溶解至2mg/l作为样品，然后用悬滴法制备试验样品。具体方法：将5μl样品滴在铜网上，自然挥发至水滴消失，然后用jem-2100f stem/eds场发射高分辨透射电镜观察样品的形态。
[0157]
图15-1的a幅和b幅显示了gsh修饰的铜团簇的典型扫描电镜图像，并从不同的透射电镜图像计算出它们的尺寸分布。结果表明，铜团簇具有良好的分散性，其尺寸在0.5-5.0nm之间。
[0158]
2)x射线光电子能谱
[0159]
在escalab 250xi x射线光电子能谱仪上测量了x射线光电子能谱 (xps)。将双面导电胶(3mm
×
3mm)贴在铝箔上，将试验粉均匀地涂在双面胶带上，并覆盖一层铝箔。样品在8兆帕压力下保持1分钟。去除表面的残余粉末，然后切出中心样品(1mm
×
1mm)进行xps测试。
[0160]
图15-2的c幅是铜团簇中铜元素的xps光谱。两个峰分别出现在931.98 和951.88ev，这可以归因于铜的2p
3/2
和2p
1/2
电子的结合能。942.0ev附近没有 cu 2p
3/2
卫星峰证实了cu(ii)电子不存在。由于cu(0)的结合能与cu(i) 的结合能只有0.1ev距离，因此不可能排除cu(i)的形成，而且在得到的gsh 修饰的铜团簇中，铜的价态很可能在0和 1之间。
[0161]
3)傅立叶变换红外光谱
[0162]
在perkinelemer ls 55荧光光谱仪上测试ft-ir光谱。将试验粉末溶解于超纯水中，在室温下测定。扫描范围为200-800nm，样品池为标准石英试管，光路为1cm。
[0163]
图15-2的d幅显示了gsh修饰的铜团簇(上)和gsh(下)的ft-ir光谱的比较。gsh表现出许多特征性的红外波段，即cooh(1390和1500cm-1
)、 n-h拉伸(3410cm-1
)和nh2组n-h弯
曲(1610cm-1
)。在2503cm-1
处观察到的峰值可归结于s-h拉伸振动模式。除s-h拉伸振动带(2503cm-1
)外，gsh修饰的铜团簇均具有相应的红外特性。结果表明，s-h键发生了断裂，gsh分子通过铜-硫键的形成与铜团簇的表面结合。
[0164]
4)荧光光谱法
[0165]
将试验粉末溶解于超纯水中，室温下用荧光光谱法测定。
[0166]
如图15-3的e幅所示，在365nm的激发峰值下，铜团簇显示出红色发射，峰值为595nm，在半最大值(fwhm)时发相应全宽为约80nm。值得注意的是，由于聚集诱导的发射增强，当乙醇加入到溶液中时，铜团簇的fl强度将显著提高。此外，大的斯托克斯(stokes)位移(230nm)显示了荧光探针和生物成像的良好前景。
[0167]
尽管本发明参照特异的实施方式来描述，但是将被理解的是，实施例是说明性的，本发明的范围并不局限于此。本发明的替代实施例对本发明涉及的领域的普通技术人员将变得显而易见。这样的替代实施例都被认为是包含在本发明的精神和范围之内。因此，本发明的范围由所附的权利要求被描述，由前面的描述所支持。
[0168]
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