一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医用材料技术领域，特别涉及一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料及其制备方法。


背景技术：

2.颅骨缺损是临床上一种常见的继发性疾病。主要见于各种外伤和术后，例如电击伤、车祸伤、枪弹伤、颅骨恶性肿瘤切除、先天性畸形、去颅骨瓣减压术后等。原则上最大直径超过3cm以上的颅骨缺损需进行颅骨重建手术，当颅骨缺损超过3cm，就可以产生临床症状。成功的颅骨重建需满足3个要求：(1)保持硬脑膜的完整性，即大脑的保护；(2)颅脑与外界之间的屏障保护，即生物力学稳定；(3)维持头部正常穹窿状外形，即美学要求。
3.理想的颅骨缺损修复材料满足下列特征：(1)获取方便；(2)生物相容性高；(3)能够完全匹配缺损部位和延展性好；(4)生物力学性能好，大脑屏障保护，抗外力；(5)具有诱导成骨潜能；(6)头颅影像检查兼容；(7)耐感染性。
4.目前，应用于临床的颅骨修复材料主要有自体骨、同种异体骨、异种异体骨和人工材料。自体骨修复是颅骨重建的金标准。自体骨组织具有良好的骨传导性和组织相容性，无免疫排斥反应，术后股外漏率低，但存在供区有限、塑形困难、增加二次创伤、移植骨具有较高的骨吸收率等问题，临床应用受限。同种异体骨一般是经过特殊的灭菌处理，不会出现一般的传染病，无免疫原性。同种异体骨术后可与自体组织生物性结合，允许组织血管化和自体组织的长入重建。但术后的高感染率、移植骨吸收率以及宗教、伦理等因素限制了同种异体骨在颅骨缺损上的临床应用。异种异体骨来源丰富，但免疫原性较强，临床上使用的冻干骨、煅烧骨和脱蛋白骨是将动物骨组织分别经过冻干、高温煅烧、辐照和脱钙等处理，去除了细胞，胶原等有机成分，保留了天然孔隙结构，消除了抗原性，但组织机械强度小，疏松易碎，力学强度差，降低了可塑性。
5.临床上常用的人工颅骨修复材料主要有羟基磷灰石、聚甲基丙烯酸甲酯、钛网和聚醚醚酮等。聚醚醚酮(peek)是一种全芳香族半结晶性的热塑性特种工程塑料，具有优良的理化性质、力学和热等性能，在250℃高温下也能保持较高的耐磨性和较低的摩擦系数。聚醚醚酮具有熔点高(334℃)、蠕变量低、弹性模量高、摩擦性能优异、耐高温、耐化学腐蚀等特点，越来越多地作为一种生物材料应用于骨科植入物和假体。聚醚醚酮具有良好的生物相容性，相比于传统硬组织植入金属材料(不锈钢、钛合金等)，其弹性模量和人类的皮质骨相当，植入后可有效减小“应力屏蔽效应”。此外，聚醚醚酮作为生物材料还具有放射线透过性及磁共振扫描不产生伪影等优点，可以更好地评估术后恢复情况，目前已被用于颅骨、颌骨、脊椎腰椎、人工关节以及口腔缺损修复等领域。
6.聚醚醚酮(peek)作为生物医用材料的最大限制是生物惰性。peek材料的亲水性较差，不利于成骨细胞的黏附和生长。另外peek材料在体液环境下，不易诱导骨组织上羟基磷灰石的沉积，因而不能与骨组织进行很好的键合，结合性较差，植入效果不佳。
7.为了实现植入后的最佳骨整合，在不影响peek材料优点的前提下，采用表面改性
方法增强peek表面的生物活性是首选途径。最常用的方法是通过物理或者化学方法制备生物活性涂层使peek功能化。现有报道的技术中许多涂层(包括羟基磷灰石、生物活性颗粒等)在一定程度上增强了peek植入物的骨整合性。但这些技术需使用98％的浓硫酸或在高温((360℃以上)条件下进行。


技术实现要素：

8.本技术的目的在于提供一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料及其制备方法，以解决目前对peek材料表面改性的过程存在安全隐患的问题。
9.本发明实施例提供了一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，所述方法包括：
10.将待修复头部进行分析，得到颅骨缺损部位信息；
11.将聚醚醚酮根据所述颅骨缺损部位信息进行成型，得到基体；
12.将聚多巴胺纳米微球对所述基体进行修饰，得到修饰基体；
13.将四水硝酸钙溶液、磷酸氢二铵溶液和引导组织再生层溶液进行混合，得到矿化引导组织再生层溶液；
14.将聚合物溶解于二氯甲烷，得到聚合物溶液；
15.将生长因子和所述聚合物溶液进行混合，得到第一乳液；
16.将所述第一乳液和第一聚乙烯醇进行混合，得到第二乳液；
17.将所述第二乳液和第二聚乙烯醇进行混合，后进行蒸发，得到载有生长因子的微球体；
18.将载有生长因子的所述微球体和所述矿化引导组织再生层溶液混合，得到含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液；
19.将1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、所述修饰基体和含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液混合，得到混合物；
20.将所述混合物进行反应、干燥、交联、解析和灭菌，得到含生长因子的颅骨修复聚醚醚酮材料。
21.可选的，所述聚合物包括聚已内酯、聚羟基脂族羧酸、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚体、聚乳酸-聚已内酯共聚体、聚酸酐、多糖、凝聚素、糖胺聚糖、脱乙酰壳多糖、纤维素、丙烯酸酯聚合物、乙醇酸的均聚物、乳酸的均聚物和由聚(丙交酯-共-乙交酯)衍生的共聚物中的至少一种；
22.所述生长因子包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子、转化生长因子-β、和血小板源性生长因子中的至少一种；
23.所述引导组织再生层溶液的溶质为可降解膜材料，所述可降解膜材料包括：透明质酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素、改性纤维素、改性壳聚糖、海藻酸盐、i型胶原蛋白、丝素蛋白、聚丙交酯、聚乙交酯、聚已内酯、聚羟基丁酸酯及以上物质的共聚物中的至少一种。
24.可选的，每100ml含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液中含有所述微球体0.1g-20g，所述微球体的直径为1μm-100μm；
25.所述矿化引导组织再生层溶液中，所述可降解膜材料的质量分数为0.5％～20％；
钙离子的物质的量和磷酸根离子的物质的量的比值为1～2：1。
26.可选的，所述混合物中，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐的质量浓度为0.1g/ml～0.3g/ml，所述n-羟基琥珀酰亚胺的质量浓度为0.01g/ml～0.05g/ml。
27.可选的，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥包括第一冷冻干燥和第二冷冻干燥，所述第一冷冻干燥的干燥温度为-80℃～-20℃，所述第一冷冻干燥的干燥时间为3h～24h；所述第二冷冻干燥的干燥温度为-50℃～37℃，所述第二冷冻干燥的干燥时间为24h～72h，所述第二冷冻干燥的干燥压强为0.1pa～50pa。
28.可选的，所述交联包括戊二醛蒸汽交联和热交联，所述戊二醛蒸汽交联的交联温度为37℃～52℃，所述戊二醛蒸汽交联的戊二醛蒸汽浓度为5％～25％，所述戊二醛蒸汽交联的交联时间为2h～12h；所述热交联的交联温度为100℃～110℃，所述热交联的交联压强为10pa～150pa，所述热交联的交联时间为12h～48h。
29.可选的，所述解析的解析温度为37℃～52℃，所述解析的解析时间为2d～4d。
30.可选的，所述反应的反应温度为4℃～6℃，所述反应的反应时间为40h～60h。
31.可选的，所述将聚多巴胺纳米微球对所述基体进行修饰，得到修饰基体，具体包括：
32.将所述基体浸泡于所述聚多巴胺纳米微球的溶液中进行搅拌反应，得到修饰基体；
33.其中，所述搅拌反应的反应时间为24h～48h，所述聚多巴胺纳米微球的溶液的制备方法包括：
34.将三羟甲基氨基甲烷粉末溶解于溶剂，得到三羟甲基氨基甲烷溶液；
35.将盐酸多巴胺粉末溶解于所述三羟甲基氨基甲烷溶液，得到所述聚多巴胺纳米微球的溶液。
36.基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种颅骨修复聚醚醚酮材料，所述聚醚醚酮材料采用如上所述的含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法制得。
37.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
38.本发明实施例提供的含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，通过聚多巴胺纳米微球交联修饰聚醚醚酮，原材料容易获取，安全且环境友好，避免在制备过程中以及终产品使用中对人体带来的隐患。
39.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
41.图1是本发明实施例提供的方法的流程图。
具体实施方式
42.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
43.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
44.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
45.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
46.申请人在发明过程中发现：3d打印钛网技术在颅骨修复应用解决了修复材料塑形性和契合性问题，并且加工速度快，植入物在1-2天时间内即可完成制造，减少病人的等待时间；类人体骨骼的多孔贯通结构，可有效克服植入物普遍存在的应力屏蔽和生物活性低的难题，同时可使颅腔中的热耗散最小化，维持正常的导热水平。然而单一的3d打印钛网属于生物惰性材料，不具有生物活性，不能与软组织快速融合，不能有效促进骨组织修复再生。
47.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，所述方法包括：
48.s1.将待修复头部进行分析，得到颅骨缺损部位信息；
49.s2.将聚醚醚酮根据所述颅骨缺损部位信息进行成型，得到基体；
50.在一些实施例中，基体可以采用聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料，以下仅以3d打印制备基体进行说明：
51.首先进行颅骨缺损部位ct平扫及增强扫描，然后进行三维重建，确定颅骨缺损的位置，大小，形状等；然后将扫描数据倒入软件进行骨缺损模型设计，以stl格式保存并导入3d打印机，运用软件对颅骨缺损模型进行修正和校准，根据模型的数据使用数字化设备进行塑型，制作出与缺损部位相匹配的聚醚醚酮基体。聚醚醚酮原料符合yy/t 0660-2008《外科植入物用聚醚醚酮(peek)聚合物的标准规范》标准。
52.s3.将聚多巴胺纳米微球对所述基体进行修饰，得到修饰基体；
53.聚多巴胺主要是由贻贝足腺分泌得到，其中含有大量粘附蛋白，其被分泌到海水中，逐渐凝固，并形成足丝，牢靠粘附于基底材料表面。受贻贝启发的聚多巴胺涂层技术能够与含有胺和硫醇官能团的各种材料和生物分子提供强大的粘附相互作用。聚多巴胺可以促进细胞的粘附，具有良好的生物相容性和生物降解能力，作为一种简易、通用的功能表面修饰方法迅速的发展和广泛应用。聚多巴胺不仅可用于规则表面的修饰，也可利用其修饰一些复杂度较高的三维表面，如金属、心血管支架表面和碳纳米管等。这些三维表面经过聚多巴胺修饰以后，由于其具有二次反应性，还可以直接进行连接生物分子和药物的修饰或结合其它涂层技术制备具有多功能的复合涂层。聚多巴胺在包覆基底材料表面时可实现厚度薄，结合牢固，且基底材料表面可以获得良好的亲水性和粘附性。文献报道，采用聚多巴胺涂层，不仅可以促进体外成骨分化和钙矿化，体内实验亦可以促进成骨及增加骨整合性。在聚醚醚酮进行聚多巴胺纳米微球修饰，可改善多孔聚醚醚酮材料表面亲水性和生物活
性，再在其表面进行二次涂层改性，有利于血管内皮细胞在材料表面的黏附、增殖、分泌细胞外基质，加快修补材料与软组织快速融合，使其表面形态、生物学性能更符合颅骨修复临床应用的需求。
54.在一些实施例中，将聚多巴胺纳米微球对所述基体进行修饰，得到修饰基体，具体包括：
55.s3.1.将所述基体浸泡于所述聚多巴胺纳米微球的溶液中进行搅拌反应，得到修饰基体；
56.其中，所述搅拌反应的反应时间为24h～48h，所述聚多巴胺纳米微球的溶液的制备方法包括：
57.s3.1.1.将三羟甲基氨基甲烷粉末溶解于溶剂，得到三羟甲基氨基甲烷溶液；
58.s3.1.2.将盐酸多巴胺粉末溶解于所述三羟甲基氨基甲烷溶液，得到所述聚多巴胺纳米微球的溶液。
59.具体而言，多巴胺溶液制备方法为：取三羟甲基氨基甲烷粉末溶解在去离子水中，用稀盐酸滴定调节ph至7.5～10，盐酸多巴胺粉末溶解在三羟甲基氨基甲烷溶液中混合搅拌30～120min形成多巴胺溶液。多巴胺溶液中多巴胺的质量浓度为0.1～20mg/ml。多巴胺在碱性(ph＞7.5)有氧环境中可进行氧化聚合反应形成聚多巴胺纳米微球。随着ph的升高，多巴胺逐渐发生自聚合反应形成聚多巴胺，颜色逐渐由浅棕色变为深棕色。将上述制得的聚醚醚酮基体加入多巴胺溶液中，于室温下磁力搅拌反应24～48h后，将聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮用纯水重复洗涤2～3次，于鼓风干燥箱中在37～52℃干燥12～24h烘干，得到修饰基体。
60.s4.将四水硝酸钙溶液、磷酸氢二铵溶液和引导组织再生层溶液进行混合，得到矿化引导组织再生层溶液；
61.具体而言，将四水硝酸钙溶液、磷酸氢二铵溶液和引导组织再生层溶液进行混合，得到矿化引导组织再生层溶液，包括：
62.s4.1.引导组织再生层溶液的制备；
63.s4.2.矿化引导组织再生层溶液的制备；向上述引导组织再生层溶液中滴加四水硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节ph至7～9混匀，溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子后，获得矿化引导组织再生层溶液。
64.在一些实施例中，引导组织再生层溶液的溶质为可降解膜材料，所述可降解膜材料包括：透明质酸、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素、改性纤维素、改性壳聚糖、海藻酸盐、i型胶原蛋白、丝素蛋白、聚丙交酯、聚乙交酯、聚已内酯、聚羟基丁酸酯及他们的共聚物中的至少一种。
65.在一些实施例中，矿化引导组织再生层溶液中，所述可降解膜材料的质量分数为0.5％～20％；钙离子的物质的量和磷酸根离子的物质的量的比值为1～2：1。
66.优选的，可降解膜材料选自i型胶原蛋白和丝素蛋白。具体的，引导组织再生层溶液的制备方法为：获得丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液混匀，获得引导组织再生层溶液；其中i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白溶解于0.05mol/l的醋酸溶液中获得，质量分数为0.5％～5％；丝素蛋白溶液中丝素蛋白解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液中，质量分数为0.5％～20％；引导组织再生层溶液中丝素蛋
白和i型胶原蛋白质量比为(0.3～3)：1；矿化引导组织再生层中钙离子加入的物质的量与所述蛋白溶液中蛋白的质量比为0.002mol/g～0.02mol/g，钙离子加入的物质的量与磷酸根离子加入的物质的量的摩尔比比值为1～2：1。
67.i型胶原蛋白是脊柱动物的主要结构蛋白，是成骨过程中成骨细胞分泌的细胞外基质，是钙盐沉积的支架和骨基质双层的促进剂、双层的模板；能够促进细胞迁移、吸附、分化，并能够调节细胞生长，作为生物材料已被美国fda认可，并有一系列胶原骨植入产品。i型胶原蛋白具有低免疫原性、体内降解产物无毒副作用等优点，但其力学性能差，降解速率快。丝素蛋白具有优良的生物相容性、生物可降解性和较好的力学特性，而且易于灭菌和塑形，广泛应用于韧带组织修补、血管组织移植、软骨组织修复、皮肤组织再生及神经组织工程等方面，但其力学强度远不及骨组织，且单纯丝素蛋白降解速度过慢。纳米级羟基磷灰石具有良好的骨传导性与生物相容性，但单一的羟基磷灰石脆性较大，韧性低。因此，将羟基磷灰石和i型胶原蛋白和丝素蛋白复合使用，可以解决单一材料性能不足，实现各类材料的优势互补，使得到的骨修复材料具有良好的力学性能和生物降解时间可控，使颅骨修复材料可以在一定时间内或长时间维持形态结构，并与植入部位原本颅骨骨组织的生物力学性能相匹配；i型胶原蛋白和丝素蛋白均是天然的纤维型蛋白，具有良好的生物相容性和骨诱导性能，有利于种子细胞在材料表面的黏附、增殖、分泌细胞外基质，加快修补材料与软组织快速融合，能够刺激植入部位周围的软骨细胞和成骨细胞分化，形成新骨组织；具备良好的骨诱导性，能够刺激植入部位周围的软骨细胞和成骨细胞分化，形成新骨组织。
68.s5.得到载有生长因子的微球体；
69.s5.1.将聚合物溶解于二氯甲烷，得到聚合物溶液；
70.在一些实施例中，聚合物是具有生物相容性和生物降解性的聚合物，选自聚已内酯，聚羟基脂族羧酸、聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚体，聚乳酸-聚已内酯共聚体，聚酸酐，多糖，凝聚素，糖胺聚糖，脱乙酰壳多糖，纤维素，丙烯酸酯聚合物，乙醇酸或乳酸的均聚物和由聚(丙交酯-共-乙交酯)(缩写为plga)衍生的共聚物中的至少一种。优选的，聚合物为聚(丙交酯-共-乙交酯)(缩写为plga)。
71.s5.2.将生长因子和所述聚合物溶液进行混合，得到第一乳液；
72.在一些实施例中，生长因子可以选自血管内皮生长因子(vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、类胰岛素生长因子(igf)、转化生长因子-β(tgf-β)(包括转化生长因子-β1(tgf-β1)、骨形态发生蛋白-2(bmp-2)等多种生长因子)或血小板源性生长因子(pdgf)中的至少一种。优选的，生长因子为骨形态发生蛋白-2(bmp-2)。
73.骨形态发生蛋白-2(bmp-2)被认为是具有最强骨诱导能力和促进骨再生的生长因子，能够跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，从而能够促进骨修复。将骨形态发生蛋白-2(bmp-2)包含在聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)微球体中，生长因子可以通过缓慢的扩散作用和微球载体的缓慢降解而实现较长时间的释放，保持较长时间的成骨活性，加速颅骨缺损修复愈合。
74.s5.3.将所述第一乳液和第一聚乙烯醇进行混合，得到第二乳液；
75.s5.4.将所述第二乳液和第二聚乙烯醇进行混合，后进行蒸发，得到载有生长因子的微球体；
76.在一些实施例中，微球体的直径为1μm-100μm，载有生长因子的微球体包括以质量
分数计0.1％～10％生长因子和90％～99.9％生物聚合物。
77.具体而言，微球体的制备方法包括：取一定量制备微球体的聚合物溶于二氯甲烷(dcm)制成聚合物溶液。取1ml聚合物溶液加入玻璃容器中，再加入一定量的生长因子。用超声探头将上述混合物超声30秒。将第一乳液加入一定体积的1％聚乙烯醇中，再对相进行14000rpm的强烈搅拌得到第二乳液。将上述乳液加入一定体积的0.1％聚乙烯醇30000～70000(sigma)，并且用匀浆机按300rpm搅拌1小时，以蒸发二氯甲烷。最终，经过滤收集微球体，用蒸馏水清洗数次后在冷冻干燥机中冷冻干燥。干燥的微球体保存在4℃直至使用。
78.s6.将载有生长因子的所述微球体和所述矿化引导组织再生层溶液混合，得到含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液；
79.在一些实施例中，每100ml含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液中含有所述微球体0.1g-20g。
80.将生长因子骨形态发生蛋白-2(bmp-2)包含在聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)微球体中，生长因子可以通过缓慢的扩散作用和微球载体的缓慢降解而实现较长时间的释放，促进创面新生毛细血管数和成纤维细胞数，加速颅骨组织修复愈合，控制微球体浓度为0.1～20g/100ml的原因是微球体可以通过降解实现长时间释放生长因子，加速颅骨组织修复愈合，该浓度取值过大的不利影响是微球体降解速度偏慢，影响生长因子释放，影响颅骨组织修复愈合，过小的不利影响是微球体降解速度偏快，生长因子含量少且释放速度快，影响颅骨组织修复愈合。
81.s7.将1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、所述修饰基体和含生长因子的所述矿化引导组织再生层溶液混合，得到混合物；
82.含生长因子的矿化引导组织再生层通过化学键合方式固定在聚醚醚酮材料上，克服了物理固定方法中生物分子不能长期作用于聚醚醚酮材料表面、易脱落问题，使矿化引导组织再生层能够实现缓慢降解，在新骨形成中充分发挥骨诱导作用，提高颅骨缺损部位骨形成能力。
83.在一些实施例中，混合物中，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐的质量浓度为0.1g/ml～0.3g/ml，所述n-羟基琥珀酰亚胺的质量浓度为0.01g/ml～0.05g/ml。
84.s8.将所述混合物进行反应、干燥、交联、解析和灭菌，得到颅骨修复聚醚醚酮材料。
85.在一些实施例中，干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥包括第一冷冻干燥和第二冷冻干燥，所述第一冷冻干燥的干燥温度为-80℃～-20℃，所述第一冷冻干燥的干燥时间为3h～24h；所述第二冷冻干燥的干燥温度为-50℃～37℃，所述第二冷冻干燥的干燥时间为24h～72h，所述第二冷冻干燥的干燥压强为0.1pa～50pa。
86.控制第一冷冻干燥的干燥温度为-20～-80℃、时间为3～24h的原因是满足实际冻干机设备参数及产品冻干工艺要求，该温度偏取值偏高，会导致时间会偏长，该温度取值偏低，设备温度参数达不到还会影响后续冻干工艺产品结构。
87.控制第二冷冻干燥的温度为-50～37℃，压强为0.1～50pa，时间为24～72h的原因是满足实际冻干机设备参数及产品冻干工艺要求，冷冻温度偏高，冷冻时间会偏长，冷冻温度偏低，冷冻速度过快，影响后续冻干工艺产品结构。
88.在一些实施例中，交联包括戊二醛蒸汽交联和热交联，所述戊二醛蒸汽交联的交
联温度为37℃～52℃，所述戊二醛蒸汽交联的戊二醛蒸汽浓度为5％～25％，所述戊二醛蒸汽交联的交联时间为2h～12h；所述热交联的交联温度为100℃～110℃，所述热交联的交联压强为10pa～150pa，所述热交联的交联时间为12h～48h。
89.控制戊二醛蒸汽交联的温度为37～52℃，戊二醛蒸汽体积浓度为5％～25％，时间为2～12h的原因是戊二醛蒸汽体积浓度过大难以达到，戊二醛蒸汽体积浓度过低，交联温度低，交联时间过长。
90.控制热交联温度100～110℃，压强10～150pa，交联时间12～48h的原因是热交联温度低，交联时间长，热交联温度高，影响产品结构性能。
91.在一些实施例中，解析的解析温度为37℃～52℃，所述解析的解析时间为2d～4d。
92.控制解析温度37～52℃，解析时间2～4d的原因是解析温度低，解析时间偏长，解析温度高，影响产品结构性能。
93.在一些实施例中，反应的反应温度为4℃～6℃，所述反应的反应时间为40h～60h。
94.控制反应温度为4℃～6℃，反应时间为40h～60h的原因是保持交联剂长时间活性，促使聚多巴胺微球修饰基体和矿化引导组织再生层间的充分交联反应。
95.下面将结合实施例、对照例及实验数据对本技术的含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法进行详细说明。
96.实施例1
97.一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，步骤如下：
98.获得或制得聚醚醚酮材料。获得聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料。3d打印制得聚醚醚酮材料方法为：首先进行颅骨缺损部位ct平扫及增强扫描，然后进行三维重建，确定颅骨缺损的位置，大小，形状等；然后将扫描数据倒入软件进行骨缺损模型设计，以stl格式保存并导入3d打印机，运用软件对颅骨缺损模型进行修正和校准，根据模型的数据使用数字化设备进行塑型，制作出与缺损部位相匹配的聚醚醚酮。聚醚醚酮原料符合yy/t 0660-2008《外科植入物用聚醚醚酮(peek)聚合物的标准规范》标准；
99.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮。多巴胺在碱性(ph＞7.5)有氧环境中可进行氧化聚合反应形成聚多巴胺纳米微球。多巴胺溶液制备：取0.121g三羟甲基氨基甲烷粉末溶解在100ml去离子水中，用稀盐酸滴定调节ph至8.5，取200mg盐酸多巴胺粉末溶解在三羟甲基氨基甲烷溶液中混合搅拌60min形成多巴胺溶液。将上述制得的聚醚醚酮加入多巴胺溶液中，于室温下磁力搅拌反应36h后，将聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮用纯水重复洗涤2～3次，于鼓风干燥箱中在40℃干燥24h烘干；
100.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层。制备方法为：
101.引导组织再生层溶液的制备；制备方法为：获得丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液混匀，获得引导组织再生层溶液；其中i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白溶解于0.05mol/l的醋酸溶液中获得，质量分数为1％；丝素蛋白溶液中丝素蛋白解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液中，质量分数为5％；引导组织再生层溶液中丝素蛋白和i型胶原蛋白质量比为7：3；
102.矿化引导组织再生层溶液的制备；向上述引导组织再生层溶液中滴加四水硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节ph至7混匀，溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子
后，获得矿化引导组织再生层溶液；矿化引导组织再生层中钙离子加入的物质的量与所述蛋白溶液中蛋白的质量比为0.01mol/g，钙离子加入的物质的量与磷酸根离子加入的物质的量的摩尔比比值为1.67；
103.制备载有生长因子的微球体；
104.将载有生长因子的微球体加入到上述矿化引导组织再生层溶液中混合均匀得到含生长因子的矿化引导组织再生层溶液；载有生长因子的微球体直径为1～100μm，矿化引导组织再生层溶液中微球体浓度为10g/100ml，载有生长因子的微球体包括以质量分数计0.5％生长因子和99.5％生物聚合物；
105.向上述含生长因子的矿化引导组织再生层溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮，并于5℃下混合反应48h；矿化引导组织再生层溶液中交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)浓度为0.2g/ml，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)浓度为0.03g/ml；
106.进行冷冻干燥，戊二醛蒸汽交联、热交联、解析工艺和钴60辐照灭菌得到颅骨修复聚醚醚酮材料。具体地，冷冻干燥的工艺条件为：在-60℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度10℃，压强10pa下进行冷冻体干燥48h；戊二醛蒸汽交联的工艺条件为：在温度40℃、戊二醛蒸汽浓度10％的条件下交联12h；热交联的工艺条件为：真空干燥箱中在100℃、100pa的条件下交联48h；解析工艺条件为：鼓风干燥箱中，解析温度37℃、解析时间2d。
107.实施例2
108.一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，步骤如下：
109.获得或制得聚醚醚酮材料。获得聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料。3d打印制得聚醚醚酮材料方法为：首先进行颅骨缺损部位ct平扫及增强扫描，然后进行三维重建，确定颅骨缺损的位置，大小，形状等；然后将扫描数据倒入软件进行骨缺损模型设计，以stl格式保存并导入3d打印机，运用软件对颅骨缺损模型进行修正和校准，根据模型的数据使用数字化设备进行塑型，制作出与缺损部位相匹配的聚醚醚酮。聚醚醚酮原料符合yy/t 0660-2008《外科植入物用聚醚醚酮(peek)聚合物的标准规范》标准；
110.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮。多巴胺在碱性(ph＞7.5)有氧环境中可进行氧化聚合反应形成聚多巴胺纳米微球。多巴胺溶液制备：取0.121g三羟甲基氨基甲烷粉末溶解在100ml去离子水中，用稀盐酸滴定调节ph至8.5，取250mg盐酸多巴胺粉末溶解在三羟甲基氨基甲烷溶液中混合搅拌80min形成多巴胺溶液。将上述制得的聚醚醚酮加入多巴胺溶液中，于室温下磁力搅拌反应24h后，将聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮用纯水重复洗涤2～3次，于鼓风干燥箱中在50℃干燥12h烘干；
111.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层。制备方法为：
112.引导组织再生层溶液的制备；制备方法为：获得丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液混匀，获得引导组织再生层溶液；其中i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白溶解于0.05mol/l的醋酸溶液中获得，质量分数为1％；丝素蛋白溶液中丝素蛋白解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液中，质量分数为10％；引导组织再生层溶液中丝素蛋白和i型胶原蛋白质量比为3：2；
113.矿化引导组织再生层溶液的制备；向上述引导组织再生层溶液中滴加四水硝酸钙
溶液和磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节ph至7.5混匀，溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子后，获得矿化引导组织再生层溶液；矿化引导组织再生层中钙离子加入的物质的量与所述蛋白溶液中蛋白的质量比为0.015mol/g，钙离子加入的物质的量与磷酸根离子加入的物质的量的摩尔比比值为1.67；
114.制备载有生长因子的微球体；
115.将载有生长因子的微球体加入到上述矿化引导组织再生层溶液中混合均匀得到含生长因子的矿化引导组织再生层溶液；载有生长因子的微球体直径为1～100μm，矿化引导组织再生层溶液中微球体浓度为6g/100ml，载有生长因子的微球体包括以质量分数计0.5％生长因子和99.5％生物聚合物；
116.向上述矿化引导组织再生层溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮，并于5℃下混合反应48h；矿化引导组织再生层溶液中交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)浓度为0.2g/ml，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)浓度为0.03g/ml；
117.进行冷冻干燥，戊二醛蒸汽交联、热交联、解析工艺和钴60辐照灭菌得到颅骨修复聚醚醚酮材料。具体地，冷冻干燥的工艺条件为：在-50℃条件下进行预冷冻12h，之后在温度20℃，压强20pa下进行冷冻体干燥48h；戊二醛蒸汽交联的工艺条件为：在温度40℃、戊二醛蒸汽浓度20％的条件下交联6h；热交联的工艺条件为：真空干燥箱中在105℃、50pa的条件下交联24h；解析工艺条件为：鼓风干燥箱中，解析温度50℃、解析时间3d。
118.实施例3
119.一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，步骤如下：
120.获得或制得聚醚醚酮材料。获得聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料。3d打印制得聚醚醚酮材料方法为：首先进行颅骨缺损部位ct平扫及增强扫描，然后进行三维重建，确定颅骨缺损的位置，大小，形状等；然后将扫描数据倒入软件进行骨缺损模型设计，以stl格式保存并导入3d打印机，运用软件对颅骨缺损模型进行修正和校准，根据模型的数据使用数字化设备进行塑型，制作出与缺损部位相匹配的聚醚醚酮。聚醚醚酮原料符合yy/t 0660-2008《外科植入物用聚醚醚酮(peek)聚合物的标准规范》标准；
121.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮。多巴胺在碱性(ph＞7.5)有氧环境中可进行氧化聚合反应形成聚多巴胺纳米微球。多巴胺溶液制备：取0.121g三羟甲基氨基甲烷粉末溶解在100ml去离子水中，用稀盐酸滴定调节ph至9.0，取300mg盐酸多巴胺粉末溶解在三羟甲基氨基甲烷溶液中混合搅拌90min形成多巴胺溶液。将上述制得的聚醚醚酮加入多巴胺溶液中，于室温下磁力搅拌反应48h后，将聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮用纯水重复洗涤2～3次，于鼓风干燥箱中在40℃干燥24h烘干；
122.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层。制备方法为：
123.引导组织再生层溶液的制备；制备方法为：获得丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液混匀，获得引导组织再生层溶液；其中i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白溶解于0.05mol/l的醋酸溶液中获得，质量分数为1.5％；丝素蛋白溶液中丝素蛋白解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液中，质量分数为7.5％；引导组织再生层溶液中丝素蛋白和i型胶原蛋白质量比为1：1；
124.矿化引导组织再生层溶液的制备；向上述引导组织再生层溶液中滴加四水硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节ph至8.0混匀，溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子后，获得矿化引导组织再生层溶液；矿化引导组织再生层中钙离子加入的物质的量与所述蛋白溶液中蛋白的质量比为0.02mol/g，钙离子加入的物质的量与磷酸根离子加入的物质的量的摩尔比比值为1.67；
125.制备载有生长因子的微球体；
126.将载有生长因子的微球体加入到上述矿化引导组织再生层溶液中混合均匀得到含生长因子的矿化引导组织再生层溶液；载有生长因子的微球体直径为1～100μm，矿化引导组织再生层溶液中微球体浓度为15g/100ml，载有生长因子的微球体包括以质量分数计0.6％生长因子和99.4％生物聚合物；
127.向上述含生长因子的矿化引导组织再生层溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮，并于5℃下混合反应48h；矿化引导组织再生层溶液中交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)浓度为0.2g/ml，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)浓度为0.03g/ml；
128.进行冷冻干燥，戊二醛蒸汽交联、热交联、解析工艺和钴60辐照灭菌得到颅骨修复聚醚醚酮材料。具体地，冷冻干燥的工艺条件为：在-60℃条件下进行预冷冻24h，之后在温度5℃，压强30pa下进行冷冻体干燥48h；戊二醛蒸汽交联的工艺条件为：在温度40℃、戊二醛蒸汽浓度25％的条件下交联3h；热交联的工艺条件为：真空干燥箱中在110℃、30pa的条件下交联24h；解析工艺条件为：鼓风干燥箱中，解析温度45℃、解析时间3d。
129.实施例4
130.一种含生长因子颅骨修复聚醚醚酮材料的制备方法，步骤如下：
131.获得或制得聚醚醚酮材料。获得聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料。3d打印制得聚醚醚酮材料方法为：首先进行颅骨缺损损部位ct平扫及增强扫描，然后进行三维重建，确定颅骨缺损的位置，大小，形状等；然后将扫描数据倒入软件进行骨缺损模型设计，以stl格式保存并导入3d打印机，运用软件对颅骨缺损模型进行修正和校准，根据模型的数据使用数字化设备进行塑型，制作出与缺损部位相匹配的聚醚醚酮。聚醚醚酮原料符合yy/t 0660-2008《外科植入物用聚醚醚酮(peek)聚合物的标准规范》标准；
132.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮。多巴胺在碱性(ph＞7.5)有氧环境中可进行氧化聚合反应形成聚多巴胺纳米微球。多巴胺溶液制备：取0.121g三羟甲基氨基甲烷粉末溶解在100ml去离子水中，用稀盐酸滴定调节ph至9.5，取200mg盐酸多巴胺粉末溶解在三羟甲基氨基甲烷溶液中混合搅拌60min形成多巴胺溶液。将上述制得的聚醚醚酮加入多巴胺溶液中，于室温下磁力搅拌反应36h后，将聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮用纯水重复洗涤2～3次，于鼓风干燥箱中在45℃干燥12h烘干；
133.聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层。制备方法为：
134.引导组织再生层溶液的制备；制备方法为：获得丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液；将上述丝素蛋白溶液和i型胶原蛋白溶液混匀，获得引导组织再生层溶液；其中i型胶原蛋白溶液中i型胶原蛋白溶解于0.05mol/l的醋酸溶液中获得，质量分数为1％；丝素蛋白溶液中丝素蛋白解于溴化锂溶液或氯化钙三元体系溶液中，质量分数为5％；引导组织再生层
溶液中丝素蛋白和i型胶原蛋白质量比为3：7；
135.矿化引导组织再生层溶液的制备；向上述引导组织再生层溶液中滴加四水硝酸钙溶液和磷酸氢二铵溶液，并用氨水调节ph至7.5混匀，溶液静置，分离出沉淀并洗去杂质离子后，获得矿化引导组织再生层溶液；矿化引导组织再生层中钙离子加入的物质的量与所述蛋白溶液中蛋白的质量比为0.01mol/g，钙离子加入的物质的量与磷酸根离子加入的物质的量的摩尔比比值为1.67；
136.制备载有生长因子的微球体；
137.将载有生长因子的微球体加入到上述矿化引导组织再生层溶液中混合均匀得到含生长因子的矿化引导组织再生层溶液；载有生长因子的微球体直径为1～100μm，矿化引导组织再生层溶液中微球体浓度为20g/100ml，载有生长因子的微球体包括以质量分数计1％生长因子和99％生物聚合物；
138.向上述含生长因子的矿化引导组织再生层溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮，并于5℃下混合反应48h；矿化引导组织再生层溶液中交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)浓度为0.2g/ml，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)浓度为0.03g/ml；
139.进行冷冻干燥，戊二醛蒸汽交联、热交联、解析工艺和钴60辐照灭菌得到颅骨修复聚醚醚酮材料。具体地，冷冻干燥的工艺条件为：在-50℃条件下进行预冷冻24h，之后在温度25℃，压强15pa下进行冷冻体干燥72h；戊二醛蒸汽交联的工艺条件为：在温度40℃、戊二醛蒸汽浓度20％的条件下交联6h；热交联的工艺条件为：真空干燥箱中在110℃、100pa的条件下交联48h；解析工艺条件为：鼓风干燥箱中，解析温度45℃、解析时间4d。
140.对比例1
141.该对比例中，获得聚醚醚酮二维编织物材料或通过3d打印制得聚醚醚酮材料，不进行表面修饰改性。
142.对比例2
143.该对比例中，聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上复合含生长因子的矿化引导组织再生层过程中不加入交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；其余步骤同实施例1。
144.对比例3
145.该对比例中，聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上复合含生长因子的矿化引导组织再生层过程中不加入交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)；其余步骤同实施例4。
146.实验例
147.将实施例1和对比例1得到的一种颅骨修复聚醚醚酮材料进行表面接触角检测、细胞粘附与增殖能力检测和碱性磷酸酶(alp)活性检测。
148.表面接触角检测：采用接触角测试仪室温下测定各组表面接触角，每组样品测试3个样本，每个样本测试2个位置，计算平均值。
149.细胞粘附与增殖能力检测：在24孔板中的样品表面接种mg-63成骨细胞进行培养，分别在培养第1天和第7天后，加入人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽(cck-8)试剂，用酶标仪在450nm波长检测吸光光度值(od)。
150.碱性磷酸酶(alp)活性检测：在24孔板中的样品表面接种mg-63成骨细胞进行培养，分别在培养第7天和第14天时进行alp活性检测：用pbs液重复冲洗3次，加入0.1％triton-x，放置在冰箱中，4℃下裂解40min，之后按照二奎琳甲酸(bca)试剂盒说明书进行操作并检测alp活性。
151.检测结果如下表所示：
[0152][0153]
注：与对比例1比较，
①
p＜0.05；与对比例1比较，
②
p＜0.05
[0154]
从表中数据可得，相对于对比例1单纯聚醚醚酮材料，实施例1聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层后，聚醚醚酮材料接触角明显降低，说明亲水性提高，有利于细胞的黏附。
[0155]
相对于对比例1单纯聚醚醚酮材料，实施例1聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层后，cck试验结果说明，化学改性后的聚醚醚酮材料有良好的生物相容性，改性后细胞的黏附和增殖显著提高，表面活性有效提高。
[0156]
相对于对比例1单纯聚醚醚酮材料，实施例1聚多巴胺微球修饰聚醚醚酮上化学交联含生长因子的矿化引导组织再生层后，alp活性试验结果说明，化学改性后的聚醚醚酮材料alp活性有效提高，表面成骨活性提高，说明化学改性后的聚醚醚酮材料表面生物学活性有效提高。
[0157]
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
[0158]
(1)本发明实施例提供的方法采用的原材料容易获取，安全且环境友好，避免在制备过程中以及终产品使用中对人体带来的隐患；
[0159]
(2)本发明实施例提供的方法中含生长因子的矿化引导组织再生层通过化学键合方式固定在聚醚醚酮材料上，克服了物理固定方法中生物分子不能长期作用于聚醚醚酮材料表面、易脱落问题，使矿化引导组织再生层能够实现缓慢降解，在新骨形成中充分发挥骨诱导作用，提高颅骨缺损部位骨形成能力。
[0160]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0161]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0162]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围
之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。