大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用的制作方法

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用。


背景技术：

2.当前，一次性卫生用品卫生标准主要依据国家强制性标准gb 15979，在该标准中，除了规定大肠杆菌、致病性化脓菌、真菌的检出限值外，还对大肠杆菌、金葡菌的杀灭率及抑菌率提出了具体指标要求。
3.因此，准确定量检测微生物的数量，尤其是大肠杆菌、金葡菌的数量显得极为重要。gb 15979规定采用平板培养法进行定量检测，耗时48h，检测时间长。对于大肠杆菌的检测，还需进一步通过乳糖胆盐产气发酵、伊红美蓝琼脂平板接种、革兰氏染色镜检结合乳糖发酵的手段来完成；而对于金葡菌的检测，则需通过scdlp培养液增菌、血琼脂培养基培养、革兰氏染色镜检、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验来完成。由于这两种微生物检测过程复杂、检测时间长，检测手段各不相同，对检测人员的专业素质提出了较高的要求，同时增加检测过程中受感染的风险。
4.因此，若能发展一种简便快速可靠的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，只需通过简单的加样就能实现大肠杆菌、金葡菌的同步检测，则能大大提高检测效率。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法包括以下步骤：
7.s00、选取有相同激发波长而发射波长不同的两种荧光素分子作为信号报告器件；
8.s10、将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联；
9.s20、将带有荧光染料标签的大肠杆菌-金葡菌适配体互补序列与相应适配体进行杂交并构建大肠杆菌-金葡菌生物传感器；
10.其中，采用包被核酸适配体的羟基磁珠作为大肠杆菌及金葡菌的特异性识别器件，将标记其中一种荧光染料的大肠杆菌适配体互补序列作为大肠杆菌的信号报告器件，将另一种标记荧光染料的金葡菌适配体互补序列作为金葡菌的信号报告器件。
11.进一步地，步骤s10中，将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联的具体步骤为：
12.s11、通过偶联缓冲液清洗羧基磁珠多次，将羧基磁珠稀释至5mg/ml；
13.s12、用偶联缓冲液溶解edc与sulfo-nhs，按照1mg磁珠加入20-50μg的edc和sulfo-nhs的比例，在室温下对羧基磁珠进行活化15-45min直至活化结束；
14.s13、用偶联缓冲液洗去未反应的物质，然后将磁珠稀释至5mg/ml；
15.s14、用高压灭菌后的去离子水溶解大肠杆菌-金葡菌适配体至1μm，按照1mg磁珠
加入1-10nmol的大肠杆菌-金葡菌适配体的比例，加入等物质的量的大肠杆菌-金葡菌适配体进行偶联反应，室温下反应直至反应结束；
16.s15、磁分离弃上清，加入封闭缓冲液封闭2-4小时，弃上清，再用封闭缓冲液重悬至羧基磁珠浓度为5mg/ml，备用。
17.进一步地，步骤s00中，采用alexa fluor 488荧光标记来标记大肠杆菌适配体互补序列，采用pe-cy5.5荧光标记来标记金葡菌适配体互补序列，该pe-cy5.5荧光标记通过标记pe-cy5.5的链霉亲和素与生物素化的金葡菌适配体互补序列定向偶联获得。
18.进一步地，封闭缓冲液的制备方法为：称取6.06g的三羟甲基氨基甲烷、1g甘氨酸、1g牛血清白蛋白溶于1l的无菌水中，调节ph至7.0-7.4，过滤灭菌后待用。
19.进一步地，偶联缓冲液的制备方法为：称取9.76g的mes溶于1l的无菌水中，调节ph至4.5-5.5，高压灭菌后待用。
20.进一步地，大肠杆菌适配体的5端经过氨基化修饰，具体序列为：
[0021]5’‑
nh
2-aaaaaatccgtcacacctgctctatcaaatgtgcagatatcaagacgatttgtacaagatgg-3’；
[0022]
金葡菌适配体序列的5端经过氨基化修饰，具体序列为：
[0023]5’‑
nh
2-aaaaatccctacggcgctaacctcccaaccgctccaccctgcctccgcctcgccaccgtgctacaac-3’。
[0024]
大肠杆菌-金葡菌生物传感器，通过上述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法制备而得。
[0025]
基于大肠杆菌-金葡菌生物传感器的快速同步检测方法，包括以下步骤：
[0026]
s100、用不同已知浓度的大肠杆菌-金葡菌标准样品与含有上述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器的溶液进行孵育反应；
[0027]
s110、磁分离吸附移取上清液至石英比色皿；
[0028]
s120、将荧光仪的激发波长调整至488nm并分别记录525nm、694nm波长下不同浓度大肠杆菌-金葡菌标准样品所对应的荧光强度；
[0029]
s130、依据该荧光强度建立反应标准曲线；
[0030]
s140、将待测样品重复步骤s100至s120步骤，将该待测样品所测得的荧光值代入反应标准曲线得到待测样品中大肠杆菌-金葡菌的浓度。
[0031]
进一步地，还包括大肠杆菌-金葡菌定量检测步骤：
[0032]
s200、取冷冻保存的大肠杆菌和金葡菌接种到肉汤培养基中，摇床培养至培养完成；
[0033]
s210、将培养完成的大肠杆菌和金葡菌用1
×
pbs洗涤多次，8000r/min，离心5min，弃上清；
[0034]
s220、通过平板培养法技术确定大肠杆菌-金葡菌菌液的浓度，并用1
×
pbs稀释至多种菌落浓度，分别等体积加入到大肠杆菌-金葡菌生物传感器中，进行孵育反应至反应完成，磁分离后吸取上清液；
[0035]
s230、上清液移取至石英比色杯中再置入荧光仪中，用488nm的激发波长激发并分别记录525nm波长与694nm波长的荧光发射光强度；
[0036]
s240、根据不同浓度大肠杆菌-金葡菌菌液在525nm波长的荧光发射强度建立大肠
杆菌定量检测标准曲线，用于实现短时间内对大肠杆菌的定量检测；
[0037]
根据不同浓度大肠杆菌-金葡菌菌液在694nm波长的荧光发射强度建立金葡菌定量检测标准曲线，用于实现短时间内对金葡菌的定量检测。
[0038]
进一步地，步骤s210中，用1
×
pbs稀释到菌液至107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml。
[0039]
工作原理及有益效果：1、与现有技术相比，本发明选定具有相同激发波长(488nm)而发射波长不同的两种荧光素分子(alexa fluor 488、pe-cy5.5)为信号报告器件。采用包被核酸适配体的纳米磁珠作为大肠杆菌o157:h7及金黄色葡萄球菌的特异性识别器件，标记荧光染料alexa fluor 488的大肠杆菌适配体互补序列为大肠杆菌o157:h7的信号报告器件，标记荧光染料pe-cy5.5的金黄色葡萄球菌适配体互补序列为金葡菌的信号报告器件，经孵育、磁吸附取上清后，用488nm激发光激发，分别采集525nm(alexa fluor 488发射波长)、694nm(pe-cy5.5发射波长)通道的荧光强度，即可实现大肠杆菌-金葡菌的同步检测。可见本发明具有操作简便，对检测人员的专业素质要求低的优点，仅需简单的加样便可实现在4小时内同步报告大肠杆菌-金葡菌的检测结果，检测方法快速准确高效；
[0040]
2、同时本发明中肠杆菌与金黄色葡萄球菌的检测互不干扰，检测灵敏度高，特异性好。
附图说明
[0041]
图1是本发明一种实施例的简要步骤示意图一；
[0042]
图2是本发明一种实施例的简要步骤示意图二；
[0043]
图3是大肠杆菌-金葡菌检测标准曲线图。
具体实施方式
[0044]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0045]
本领域技术人员应理解的是，在本发明的披露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
[0046]
实施例1，
[0047]
如图1所示，本大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法大致为：步骤1.羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联；步骤2.带有荧光标签的大肠杆菌-金葡菌适配体互补序列与相应适配体进行杂交并构建起检测传感器。
[0048]
而在本实施例中，本大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法具体为以下步骤：
[0049]
s00、选取有相同激发波长而发射波长不同的两种荧光素分子作为信号报告器件；
[0050]
此步骤中，采用alexa fluor 488荧光标记来标记大肠杆菌适配体互补序列，采用
biotin-tttttgttgtagcacggt-3’)至100nm，95度变性5分钟；
[0072]
步骤2：取经实施例1中处理过的包被大肠杆菌/金葡球菌适配体的磁珠1ml，加入等分子量步骤1中的alexa fluor 488荧光标记序列、pe-cy5.5荧光标记序列(1-20nmol)，室温下杂交过夜。过夜后磁分离弃上清，再用封闭缓冲液重悬至1ml，即完成大肠杆菌-金葡菌生物传感器的构建。
[0073]
其中，本实施例使用到的原料为2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、甘氨酸、edc、sulfo-nhs、氯化钾、血红素、曲拉通、牛血清白蛋白(bsa)由sigma提供；羧基磁珠(3.8um)由bangs提供；dna片段委托上海生工进行合成，纯度为hplc级。
[0074]
实施例3，
[0075]
本实施例基于实施例1或实施例2的大肠杆菌-金葡菌生物传感器进行对大肠杆菌-金葡菌的快速同步检测，具体包括以下步骤：
[0076]
s100、用不同已知浓度的大肠杆菌-金葡菌标准样品与含有实施例1或实施例2的大肠杆菌-金葡菌生物传感器的溶液进行孵育反应；
[0077]
s110、磁分离吸附移取上清液至石英比色皿；
[0078]
s120、将荧光仪的激发波长调整至488nm并分别记录525nm、694nm波长下不同浓度大肠杆菌-金葡菌标准样品所对应的荧光强度；
[0079]
s130、如图3所示，依据该荧光强度建立反应标准曲线；
[0080]
s140、将待测样品重复步骤s100至s120步骤，将该待测样品所测得的荧光值代入反应标准曲线得到待测样品中大肠杆菌-金葡菌的浓度；
[0081]
实施例4，
[0082]
本实施例基于实施例3开发出一种新的大肠杆菌-金葡菌定量检测步骤，具体包括以下步骤：
[0083]
s200、取冷冻保存的大肠杆菌和金葡菌接种到肉汤培养基中，摇床培养至培养完成；
[0084]
s210、将培养完成的大肠杆菌和金葡菌用1
×
pbs洗涤多次，8000r/min，离心5min，弃上清；
[0085]
s220、通过平板培养法技术确定大肠杆菌-金葡菌菌液的浓度，并用1
×
pbs稀释至107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml等多种菌落浓度，分别等体积加入到大肠杆菌-金葡菌生物传感器中，进行孵育反应至反应完成，磁分离后吸取上清液；
[0086]
s230、上清液移取至石英比色杯中再置入荧光仪中，用488nm的激发波长激发并分别记录525nm波长与694nm波长的荧光发射光强度；
[0087]
s240、根据不同浓度大肠杆菌-金葡菌菌液在525nm波长的荧光发射强度建立大肠杆菌定量检测标准曲线，用于实现短时间内对大肠杆菌的定量检测；
[0088]
根据不同浓度大肠杆菌-金葡菌菌液在694nm波长的荧光发射强度建立金葡菌定量检测标准曲线，用于实现短时间内对金葡菌的定量检测。
[0089]
在本实施例中，该方法对大肠杆菌的检测下限为1*102cfu/ml，用103cfu/ml的标准样品重复测定10次，所得cv值在3％-5％之间；
[0090]
对金黄色葡萄球菌的检测下限为2*102cfu/ml，用103cfu/ml的标准样品重复测定
10次，所得cv值在3％-5％之间。
[0091]
下表1为对同样检测对象采用实施例3或实施例4的检测方法与现有技术的检测方法之间的比较：
[0092][0093]
其中，在国标gb 15979中，采用平板培养法，计算平板上的菌落数，再通过特异性试验确定不同菌株；酶联免疫吸附法和免疫层析法为现有技术，这里不再赘述具体步骤；
[0094]
以下为参考文献：
[0095]
1.张彤，陶晴，卞晓，陈谦，颜娟。基于滚环扩增技术的dna水凝胶用于大肠杆菌o157∶h7的可视化快速检测[j].分析化学，2021,49(03):377-386；
[0096]
2.张超楠。食品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法研究[d].吉林大学，2012；
[0097]
3.史咏梅，何晖，谭华，冯子力，伍碧梅，朱海，涂承宁，唐明慧，杨泽，汪海波。一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立[j].中国国境卫生检疫杂志，2015，38(03):157-160。
[0098]
相比与表中的各种检测方法，平板培养法的检测时间周期非常长，酶联免疫法和免疫层析法尽管检测周期有较为明显的缩短，但是对两种微生物的检测不能实现同步检测，并且检测的灵敏度不是特别理想；可见，采用本方法可以同时检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，且检测时间大大缩短，而且检测下限更低，具有检测灵敏度高，特异性好的优点，对检测人员的专业素质要求低，仅需简单的加样便可实现在4小时内同步报告大肠杆菌-金葡菌的检测结果，检测方法快速准确高效。
[0099]
本发明未详述部分为现有技术，故本发明未对其进行详述。
[0100]
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
[0101]
尽管本文较多地使用了专业术语，但并不排除使用其他术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。
[0102]
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上做任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。