一种心脾两虚型抑郁症小鼠模型构建方法及其应用

1.本发明涉及医学生物领域，具体讲是一种心脾两虚型抑郁症小鼠模型构建方法及其应用。


背景技术：

2.抑郁症是临床上一种常见的精神疾病，据世界卫生组织报告，全球大约有3.4亿抑郁症患者，有可能成为仅次于心脏病的世界第二大疾病。抑郁症其主要表现为情绪郁闷，兴趣减弱，心态悲观，思维迟缓，缺乏主动性等。随着病情的加重，患者可从闷闷不乐发展至悲痛欲绝，更严重者可有幻想、躁狂等精神病症。常常有患者因不堪抑郁的折磨，走向自残自杀的极端。现在关于抑郁症模型主要从用慢性不可预知温和刺激模型，该种模型的造模时间长、工作量大、成本较高，对于人力物力以及时间都有较多的要求，同时，临床抑郁症的发病原因是多种多样的，仅靠慢性不可预知温和刺激模型这一种模型难以满足研究抑郁症发病机制和研发抗抑郁症新药的需求。
3.因此，长期处于恐惧环境之中的人群产生的压力也持续存在。此外，随着社会经济的发展，很多人群长期处于工作、生活、学业的压力之下，科学研究证明，长期处于这种高压环境下抑郁症的发生率将大大提。
4.目前中医抑郁症病症结合动物模型，多是采用复合因素造模而成，与临床证型形成存在较大的差别。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种心脾两虚型抑郁症小鼠模型构建方法及其应用。
6.本发明的技术解决方案如下：
7.一种抑郁症小鼠模型构建方法，采用足底电击方式构建。
8.优选地，采用单因素刺激方式构建。
9.优选地，所述足底电击方式具体为：足底电击电流为0.1-1000ma，造模持续时间1-1000天，刺激频率为1-5000次/天，每次1-5000s。
10.优选地，构建时小鼠采用单笼饲养。
11.优选地，构建时用鼠为spf级c57bl/6j品系的雄性小鼠。
12.优选地，对小鼠抑郁模型评价采用行为学评价表观效度、神经递质差异测定评价结构效度以及验证药物评价。
13.优选地，行为学评定方式包括旷场实验、十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验；神经递质采用uplc-ms/ms测定，取材部位为血、脑，对其中五羟色胺含量进行检测。
14.本发明还公开了一种抑郁症小鼠模型构建方法在筛选治疗心脾两虚型抗焦虑、抑郁药物上的应用。
15.优选地，采用治疗抗焦虑、抑郁的药物作为阳性药物，验证所述抑郁症小鼠构建模
型是否成功，结合颈动脉超声、激光散斑脑血流指标辩证后，运用心脾两虚症经典方剂验证该症型是抑郁症心脾两虚症。
16.优选地，所述阳性药物采用帕罗西汀，所述心脾两虚症经典方剂采用归脾汤。
17.本发明的有益效果是：本发明的一种抑郁症型小鼠模型采用足底电击方式制作因持续性恐慌压力所导致的小鼠抑郁症模型，丰富了抑郁症病因动物模型的种类，并在造模成功后对小鼠所形成的证型进行判断和验证，更加符合病症结合动物模型制作的规律。同时为研究因恐慌压力所引起的疾病动物模型提供了新的造模方式；也为抑郁症药物的筛选提供了新的动物模型；还为抑郁症发病机制及防治方法的开发提供了研究基础；以及为抑郁症药物作用机制提供研究基础；为建立病症结合中医证候动物模型提供借鉴与参考。
附图说明
18.图1为旷场实验结果图；
19.图2为悬尾实验结果图；
20.图3为强迫游泳实验结果图；
21.图4为血液中五羟色胺含量变化；
22.图5为脑中五羟色胺含量变化；
23.图6各组脑血流指数均值变化；
24.图7为颈动脉收缩期管径；
25.图8为颈动脉舒张期管径；
26.图9为颈动脉血流流速峰值；
27.图10为对照组小鼠旷场实验轨迹图；
28.图11为模型组小鼠旷场实验轨迹图；
29.图12为帕罗西汀组小鼠旷场实验轨迹图；
30.图13为归脾汤验证组小鼠旷场实验轨迹图；
31.图中，control-空白组，model-模型组，paroxetine-帕罗西汀验证组，guipidecoction-归脾汤验证组。
32.图中，*代表p≤0.05，**代表p≤0.01，***代表p≤0.001，p《0.05 具有统计学意义。
具体实施方式
33.下面对本发明的具体实施方式进行进一步描述，以便更好的理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
34.本发明实施例中所描述的饲养条件、模型检测方式、方法以及所得结果仅适用于本发明。
35.需要说明的是：uplc-ms/ms为超高效液相色谱-串联质谱。
36.实施例1
37.一、材料与仪器
38.1.实验动物
39.雄性spf级c57bl/6j品系小鼠30只(体重20-24g)，由江西中医药大学动物实验科
技中心提供，饲养条件：环境温度24-26℃，湿度40-60％，喂标准颗粒饲料，自由饮食和摄水，适应性饲养一星期后，进行实验。
40.2.仪器与药物
41.仪器：万分之一电子天平(型号：bs224s型，sartorius corporation)、精密移液枪(德国eppendorf公司)、一次性注射器(2.5ml*100支江西三鑫医疗科技股份有限公司)、5810r冷冻离心机(eppendorf，germany)、制冰机(常熟雪科电器有限公司)、组织研磨器(天津杰灵仪器制造有限公司)、强迫游泳玻璃桶(自制)、旷场实验箱(自制)、高架迷宫(自制)、行为学分析软件smart version3.0.06(东乐自然基因生命科学有限公司)、超高分辨小动物超声影像系统vevo2100(toronto，canada)、耦合剂(西青区大寺制作所)、激光散斑血流成像仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。
42.试药：甲醇、乙腈(色谱纯，fisher scientific，fairlawn，nj，usa)，甲酸(色谱纯，sigma-aldrich co.ltd，stlouis，mo，usa)，蒸馏水 (屈臣氏)，其余试剂为分析纯、帕罗西汀(湖北九州通医药有限公司) 归脾汤原方用量参考《方剂学》，所用药材购自厦门本草真源生物医药科技有限公司。具体每付药材为白术18g、人参9g、黄芪18g、茯神18g、当归3g、炙甘草6g、远志3g、酸枣仁18g、木香9g、龙眼肉18g、大枣一枚、生姜五片，按原料：水1：10(g:ml)加水,投原方5付，浸泡30分钟后，煎煮2小时后，经浓缩得到浸膏175ml。
43.二、方法
44.1.动物分组及模型建立：
45.(1)空白组(control)：正常喂养。
46.(2)模型组(model)：采用足底电击方式进行模型制作。足底电击电流为6ma，造模持续时间28天，刺激频率为600次/天，每次30s。
47.(3)帕罗西汀验证组(paroxetine)：采用足底电击方式进行模型制作，造模完成后，通过腹腔注射给予小鼠帕罗西汀给药治疗，给药量为 8mg/d/kg，验证模型是否成功。
48.(4)归脾汤验证组(guipi decoction)：采用足底电击方式进行模型制作成功后，每只小鼠按0.15ml/d灌胃给予所述浸膏，用以考察并验证所建立的证候模型是否成功。
49.以上4组，每组6只小鼠，采用单笼饲养，实验过程中正常给予饮食水。造模结束后，每组均进行行为学测试；空白组和模型组在行为学测试结束后完成解剖、取材，阳性药物验证组按8mg/d/kg给予腹腔注射帕罗西汀两周。归脾汤验证组在造模一周后，因中药方剂起效时间较帕罗西汀等化学药物起效时间较慢，故边造摸边给予归脾汤浸膏，给药两周。给药结束后进行行为学测试，并解剖、取材，进行颈动脉超声测量、激光散斑测量脑血流以及神经递质测量，验证模型的有效性。
50.1.旷场实验：
51.操作过程：将小鼠放入45*45*45的旷场试验箱中，维持人工照明，实验开始时，将小鼠迅速放入旷场试验箱中，同时开始录像和计时。实验总时长6min，实验结束后，对实验后4min小鼠在旷场试验箱中的活动情况运用行为学分析软件进行分析，统计抑郁组模型组和药物验证组进入旷场中心区域的总时间。
52.实验结果见图1以及图10-13，旷场实验结果证明，模型小鼠进入旷场中心区域的时间显著性降低(p《0.05)，帕罗西汀和归脾汤验证组小鼠与模型组小鼠进入旷场中心区域的时间具有显著性差异(p《0.05),证明帕罗西汀和归脾汤对模型组小鼠抑郁行为均具有显
著改善作用。
53.2.悬尾实验：
54.操作过程：将小鼠尾端的部位用胶布固定在悬尾测试架上，使小鼠头部朝下悬挂，其头部离水平面一致，隔开相邻小鼠之间的视线，实验开始时开始计时和录像，实验总时长为6min，实验结束后，对实验后4min小鼠的活动情况运用行为学分析软件进行分析，不动时间作为悬尾试验指标。
55.实验结果见图2，悬尾实验结果证明，模型组小鼠不动的时间较对照组小鼠显著性提高(p《0.05)，帕罗西汀和归脾汤验证组小鼠与模型组小鼠不动的时间具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对小鼠抑郁行为均具有显著改善作用。
56.3.强迫游泳实验：
57.操作过程：将小鼠放入高50cm，直径25cm的玻璃圆桶中，内装24-25℃的温水，水深25cm，使小鼠不能触及圆桶底部。实验开始时，进行计时和录像。实验总时长为6min，实验结束后，对实验后4min小鼠在水中的的活动情况运用行为学分析软件进行分析，其在水中的不动时间作为强迫游泳试验指标。
58.实验结果见图3，强迫游泳实验结果证明，模型组小鼠不动的时间较对照组小鼠显著性提高(p《0.05)，帕罗西汀和归脾汤验证组小鼠与模型组小鼠不动的时间具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对小鼠抑郁行为均具有显著改善作用。
59.4.颈动脉超声测量
60.操作过程：将小鼠麻醉后，为其颈部进行脱毛，对其颈动脉进行超声测量，测量其颈动脉收缩期、舒张气管径以及经动脉血流量。
61.实验结果见图7-9，从图中可以看出，模型组小鼠颈动脉收缩期、舒张期管径以及血流量较对照组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，阳性药物验证组以及中药方剂验证组较模型组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的颈动脉收缩期、舒张期管径以及血流量均具有改善作用。
62.5.激光散斑测量脑血流
63.操作过程：将小鼠麻醉后，为其头部进行脱毛，脱毛后剪开头皮表层，用激光散斑进行脑血流测量。
64.实验结果见图6(图中bfi为blood flow index，指的是脑血流指数均值)，该图可以看出，模型组小鼠脑血流量较对照组小鼠具有显著性差异 (p《0.05)，阳性药物验证组以及中药方剂验证组较模型组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的脑血流量均具有显著改善作用。
65.6.采用uplc-ms/ms测定神经递质：
66.操作过程：小鼠腹腔麻醉后对其进行摘眼球取血后进行解剖，对取出的血液样品进行离心，取上清液，放-80℃冰箱中保存。当眼眶取血完成后，对小鼠进行解剖，从小鼠心尖灌注适量pbs缓冲液，然后迅速取小鼠脑组织，放-80℃冰箱中保存。实验时，分别对血样和脑组织样品进行处理。
67.脑组织样品的制备：
68.脑组织取出后，用滤纸吸干水分称重全脑，用镊子剪碎放入ep管，加入与重量一致体积的生理盐水，放在匀浆机上匀浆2分钟后，取匀浆液 0.1ml，加入2000μl乙腈，进行离
心，离心机设置温度为4℃，以15000r/min 高速离心15min；吸取上清，放入进样小瓶。
69.血液样品的制备：
70.取血液样品上清液样本100μl于1.5ml ep离心管，向内加入380μl 乙腈和20μl内标，涡旋30s后，进行离心，离心机设置温度为4℃，以15000 r/min高速离心15min；吸取上清，放入进样小瓶。
71.色谱条件：
72.对照品和样品在ab sciex instruments公司的shimadzu controllecbm20alite系统上进行分析，该系统与shimadzu公司的uplc系统相结合。对照品和样品是在40℃的sil-30ac中进行分离，流动相是由 0.01％甲酸-水(a)和乙腈(b)组成，进行的线性梯度洗脱程序如下：2％ b 0-0.001分钟；2％b 0.001-1分钟；2％-30％b 1-4分钟；30％-90％b 4-10 分钟；90％-100％b 10-10.1分钟；100％b 10.1-13分钟；100％-5％b 13-13.1 分钟；stop 15分钟。总流量为0.2000ml/min，每次注射进样量2.00ul。
73.质谱条件：
74.质谱在正离子模式下使用的是triple quad 5500。电离参数如下：气帘气(cur)35.00psi；离子源气体1(gs1)45.00；离子源气体2(gs2) 40.00；离子源温度(tem)550.00℃；入口电位(ep)10.00v；碰撞室出口电压(cxp)14v；碰撞诱导裂解电压(cad)7psi。质谱仪和uplc 系统analyst1.6.2软件控制。
75.实验结果见4-5，模型组小鼠血液中和脑组织中五羟色胺含量较空白组显著性下降，帕罗西汀和归脾汤验证组小鼠与模型组小鼠血液中和脑组织中的五羟色胺含量具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的血液中和脑组织中五羟色胺含量均具有显著改善作用。
76.7.数据分析：
77.采用统计软件graphpad prism8.0.2进行统计学分析，组间采用单因素方差分析。p《0.05为有统计学差异，p》0.05无统计学差异。
78.三、结论：
79.对小鼠造模结束后，通过旷场实验、悬尾实验、强迫游泳实验，以及颈动脉超声测量、激光散斑测量、神经递质含量测定和阳性验证药物以及中药方剂对该模型进行表观效度、结构效度以及有效性验证。旷场实验结果证明，模型小鼠进入旷场中心区域的时间显著性降低(p《0.05)，验证组小鼠与模型组小鼠进入旷场中心区域的时间具有显著性差异(p《0.05),证明帕罗西汀和归脾汤对模型组小鼠抑郁行为具有显著改善作用。悬尾实验结果证明，模型组小鼠不动的时间较对照组小鼠显著性提高(p《0.05)，验证组小鼠与模型组小鼠不动的时间具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对小鼠抑郁行为具有显著改善作用。强迫游泳实验结果证明，模型组小鼠不动的时间较对照组小鼠显著性提高(p《0.05)，验证组小鼠与模型组小鼠不动的时间具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对小鼠抑郁行为具有显著改善作用。颈动脉超声实验结果表明，模型组小鼠颈动脉收缩期、舒张期管径以及血流量较对照组小鼠具有显著性差异 (p《0.05)，阳性药物验证组以及中药方剂验证组较模型组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的颈动脉收缩期、舒张期管径以及血流量具有显著改善作用。激光散斑实验结果表明，模型组小鼠脑血流量较对照组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，阳性药物验证组以
及中药方剂验证组较模型组小鼠具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的脑血流量具有显著改善作用。通过神经递质检测，我们发现模型组小鼠血液中和脑组织中五羟色胺含量较空白组显著性下降，验证组小鼠与模型组小鼠血液中和脑组织中的五羟色胺含量具有显著性差异(p《0.05)，证明帕罗西汀和归脾汤对抑郁模型组小鼠的血液中和脑组织中五羟色胺含量具有显著改善作用。
80.以上实验结果显示，在行为学表现以及神经递质的测定结果都证明了该抑郁模型符合抑郁评价的表观效度和结构效度指标，并且通过阳性药物验证，证明了本发明的基于持续性恐惧压力刺激的小鼠抑郁症模型成功建立。确认抑郁症疾病模型建立成功后对小鼠辩证，进行颈动脉超声测量，激光散斑脑血流测量，以及对应证型中药方剂证候验证，以判断心脾两虚型抑郁症小鼠模型的建立成功。该方法简便稳定，此模型成功率高、重复性好，不仅可以为抑郁症的选方用药提供支持，同时有利于精准防治抑郁症，对其后续机制的研究具有重要价值。
81.在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
82.以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。