一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用与流程

1.本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用。


背景技术：

2.体外诊断试剂稳定性是试剂研发阶段乃至产品上市整个过程中需要着重关注的性能指标，体外诊断医疗器械在制造商规定界限内(例如：通常包含环境、状态、温度、时限等)保持其性能特性。
3.体外诊断试剂根据组成结构和反应原理等可分为不同类别，各类别产品组成成分也比较复杂，许多体外诊断试剂本身就是生物试剂。一些体外诊断试剂组成成分的活性基团会有不同的化学不稳定性趋向，容易发生水解、酶解和氧化等反应，从而影响到试剂的质量和稳定性。比如胶乳增强免疫比浊试剂中的试剂稳定性是值得关注的一方面。
4.胶乳增强免疫比浊法就是基于免疫反应原理，和纳米颗粒的特殊效应，可溶性抗原与相应抗体反应后形成免疫复合物，使介质浊度发生改变，入射光通过形成浊度的溶液时，被免疫复合物微粒吸收，当抗体量一定时，吸光度(od值)与抗原的量呈正相关。
5.而胶乳增强免疫比浊试剂并不稳定，胶乳增强免疫比浊试剂中会出现抗体脱落或者胶乳凝集等现象。通常情况下，胶乳试剂在标记偶联完成后，在2-8℃保存时可以很好的处于悬浮、单分散状态，但是如果静置时间过长就会出现由于重力作用发生的沉淀凝集现象和抗体脱落现象，以及在胶乳偶联工艺过程中也会有加入交联剂前后出现胶乳凝集的现象。


技术实现要素：

6.为解决现有的胶乳增强免疫比浊试剂不稳定的技术问题，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用。
7.本发明实施例通过下述技术方案实现：
8.第一方面，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂的稳定方法，包括：
9.采用细胞膜囊泡包裹胶乳增强免疫比浊试剂中的致敏微球以提高胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性。
10.进一步的，还包括：
11.细胞膜囊泡的制备：将细胞膜利用挤出设备制备得到细胞膜囊泡。
12.进一步的，细胞膜囊泡的制备：将细胞膜利用挤出设备制备得到细胞膜囊泡；包括：
13.将细胞膜重悬，超声之后与等体积待包裹致敏微球溶液混匀，得到悬浮液；
14.用挤出器将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出，制备得到具有不同尺度载物纳米囊泡的混悬液；
15.将所述混悬液处理后得到细胞膜囊泡。
16.进一步的，所述超声的功率为400w,超声时间为25-35s。
17.进一步的，将所述混悬液处理后得到细胞膜囊泡；包括：
18.于4℃、离心1h，弃上清，沉淀用200-500ul pbs重悬得到细胞膜囊泡。
19.进一步的，所述致敏微球的制备方法包括：
20.取胶乳微球与mes混合，得到混合液；
21.向所述混合液中加入edc和nhs活化，处理后得到活化的胶乳微球溶液；
22.将待偶联抗体加入到所述活化的胶乳微球溶液中混匀，处理后得到致敏微球。
23.进一步的，胶乳微球与mes的体积比为1:9。
24.第二方面，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂，包括试剂r1和试剂r2；其特征在于，
25.所述试剂r2中的致敏微球包裹于细胞膜囊泡内；
26.所述试剂r1中含有非离子表面活性剂。
27.第三方面，本发明实施例提供细胞膜囊泡在制备体外诊断试剂中的应用。
28.第四方面，本发明实施例提供细胞膜囊泡在制备胶乳增强免疫比浊试剂中的应用。
29.本发明实施例与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
30.本发明实施例的一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用，通过采用细胞膜囊泡包裹胶乳增强免疫比浊试剂中的致敏微球以提高胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性，从而避免了现有的胶乳增强免疫比浊试剂不稳定的缺陷，从而，避免了胶乳增强免疫比浊试剂中会出现抗体脱落或者胶乳凝集等现象。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
32.图1为致敏微球的分子结构示意图。
33.图2为细胞膜囊泡结构示意图。
34.图3为致敏微球进入或离开细胞膜囊泡的过程示意图。
35.图4为致敏微球进入细胞膜囊泡内的结构示意图。
36.附图中标记及对应的零部件名称：a-胶乳微球；b-交联剂(作为桥梁连接胶乳微球和蛋白)c.抗体或抗原；d-细胞膜囊泡；e-致敏微球；f-磷脂双分子层；g-已释放的致敏微球；h-将溶解的磷脂双分子层；i-待释放的致敏微球。
具体实施方式
37.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
38.在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，
为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
39.在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
40.在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
41.实施例
42.为解决现有的胶乳增强免疫比浊试剂不稳定的技术问题，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂、稳定方法及应用。第一方面，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂的稳定方法，包括：采用细胞膜囊泡包裹胶乳增强免疫比浊试剂中的致敏微球以提高胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性。
43.具体过程参考图1-3所示。致敏微球包括胶乳微球a、交联剂b和抗体或抗原c；细胞膜囊泡d具有磷脂双分子层f；当致敏微球e进入细胞膜囊泡内的过程中，将溶解的磷脂双分子层h逐渐溶解，待释放的致敏微球i向细胞膜囊泡内运动；当致敏微球e向细胞膜囊泡外运动时，释放的致敏微球g向细胞膜囊泡的开口运动。
44.通过将致敏微球包裹在细胞膜囊泡内，保证了致敏微球的稳定性，从而提高了胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性。
45.为了解决胶乳试剂出现抗体脱落和胶乳凝集的现象，本发明实施例通过纳米级的细胞膜囊泡与试剂包封，具体说是基于细胞膜制备的细胞膜囊泡，利用细胞膜囊泡的空腔包裹致敏微球来提高其试剂稳定性的应用。
46.具体原理为：细胞膜囊泡的生物相容性能优异，这种源于天然的材料可以继承亲本细胞的众多表面抗原、在血液中非常稳定、不受免疫监测的影响。同时，由磷脂双分子层构成的空腔结构赋予它天然的载药优势。可以起到胶乳不凝集以及抗体脱落情况减小的作用，从而提高胶乳试剂的稳定性。
47.具体的采用上述稳定方法制成的胶乳增强免疫比浊试剂，工作原理也是基于胶乳增强免疫比浊法，胶乳偶联抗体后得到致敏微球，接下来制备细胞囊泡，然后通过细胞膜挤出技术，将致敏微球转入细胞囊泡内得到胶乳试剂r2，随即在试剂r1中加入温和的非离子表面活性剂，在试剂工作时，试剂r2遇到试剂r1中的温和非离子表面活性剂，囊泡溶解、致敏微球被释放，样本中可溶性抗原与相应抗体反应后形成的免疫复合物，使介质浊度发生改变，入射光通过形成浊度的溶液时，被免疫复合物微粒吸收，当抗体量一定时，吸光度(od值)与抗原的量呈正相关。
48.进一步的，还包括：
49.细胞膜囊泡的制备：将细胞膜利用挤出设备制备得到细胞膜囊泡。
50.细胞膜囊泡的制备：细胞释放囊泡受到多种因素的影响，比如所处环境的氧气水平，营养，酸碱度以及光照刺激等。我们可以利用细胞囊泡的不同生理特性，包括形状、大小、质量密度、电荷以及特征抗原等来实现微囊泡的收集。利用到的方法包括可以连续过滤，尺寸排阻色谱，外泌体沉淀，免疫亲和捕获，差速离心，密度梯度离心等。
51.连续过滤法是利用过滤孔径的不同来实现尺寸不同的囊泡的纯化。尺寸排阻色谱法也称凝胶过滤法。二者操作都比较简单，但连续过滤法可能会对囊泡造成破坏，且囊泡容易吸附在滤膜上，造成浪费。同时因为挤压作用，也可能对囊泡造成损坏。而尺寸排阻色谱法在分离过程中有可能造成污染，稀释产物，因此不利于后续实验的展开。
52.同样，外泌体沉淀法也容易对囊泡造成污染，因为该方法本质是将含聚合物的沉淀溶液与生物流体混合，然后离心。然而该方法要求仪器简单，操作简便。利用前列腺特异性膜抗原，表皮生长因子受体egfr，cd43等囊泡表面的特征抗原，可以与涂有抗体的预功能化磁珠等结合而被捕获，这就是免疫亲和捕获法。该方法直接有效，但是耗时长，成本高。
53.密度梯度离心法和差速离心法都是利用离心来实现对囊泡的分离，密度梯度离心法利用不同尺寸囊泡在蔗糖溶液中的悬浮密度不同。差速离心法利用不同转速，这两种方法是目前最为认可且有效的收集细胞膜囊泡的方法。但当离心力过高时细胞囊泡可能会受到一定影响。
54.最终选取较为先进的利用细胞膜通过挤出技术制备的细胞膜载物纳米囊泡，包括以下步骤：
55.细胞膜载物纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5ml pbs重悬后，用超声破碎仪以400w功率超声25-35s，之后与等体积待包裹致敏微球溶液混匀，用挤出器将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出20-30次，制备不同尺度载物纳米囊泡；收集挤膜完成的混悬液，于4℃、100000g离心1h，弃上清，沉淀用200-500ul pbs重悬得到载物纳米囊泡。
56.进一步的，细胞膜囊泡的制备：将细胞膜利用挤出设备制备得到细胞膜囊泡；包括：
57.将细胞膜重悬，超声之后与等体积待包裹致敏微球溶液混匀，得到悬浮液；
58.用挤出器将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出，制备得到具有不同尺度载物纳米囊泡的混悬液；
59.将所述混悬液处理后得到细胞膜囊泡。
60.进一步的，所述超声的功率为400w,超声时间为25-35s。
61.进一步的，将所述混悬液处理后得到细胞膜囊泡；包括：
62.于4℃、离心1h，弃上清，沉淀用200-500ul pbs重悬得到细胞膜囊泡。
63.进一步的，所述致敏微球的制备方法包括：
64.取胶乳微球与mes混合，得到混合液；
65.向所述混合液中加入edc和nhs活化，处理后得到活化的胶乳微球溶液；
66.将待偶联抗体加入到所述活化的胶乳微球溶液中混匀，处理后得到致敏微球。
67.进一步的，胶乳微球与mes的体积比为1:9。
68.致敏微球的制备方法包括步骤：
69.1)取0.1ml胶乳微球，加入0.9ml、，0.1mol/l、ph6.0的mes混合；
70.2)向上述混合液中加入edc和nhs各5mg活化，室温下温和搅拌15min，10000rpm，离
心15min，用0.1mol/l pbs重复洗涤3次，弃上清，沉淀后经0.1mol/l pbs重悬、震荡、超声处理后得到活化的胶乳微球；
71.3)取40ul待偶联抗体(10mg/ml)加入到1ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌4h，10000rpm离心15min，沉淀用含0.05％tween20的pbs重复清洗3次，然后用0.1mol/l pbs复溶，即得到致敏微球。
72.第二方面，本发明实施例提供一种胶乳增强免疫比浊试剂，包括试剂r1和试剂r2；其特征在于，
73.所述试剂r2中的致敏微球包裹于细胞膜囊泡内；
74.所述试剂r1中含有非离子表面活性剂。
75.将致敏微球电转入细胞膜囊泡内得到胶乳试剂r2：细胞膜囊泡一般利用自身的载药或载颗粒功能，携带物质发挥作用。所以，要考虑如何将颗粒送进内腔或在纳米粒子表面的涂覆的方法。有四种主要的方法用于在细胞囊泡中封装合成的纳米粒子。最常见的方法是用含有合成纳米粒子的培养基直接孵育细胞，然后纳米颗粒被细胞内化，利用生物发生途径分泌。剩下的三种方法包括将细胞囊泡与合成的纳米粒子直接混合，使它们随时间被封装。在另一种方法中，对纳米颗粒-细胞囊泡混合物进行超声处理，导致在纳米颗粒表面形成细胞囊泡涂层。在最后一种方法中，将纳米颗粒-mvs混合物挤出多孔膜，从而形成囊泡包覆的纳米颗粒。除此之外还有使用电穿孔这种方式来增强纳米颗粒进入囊泡的方法。
76.试剂r1中加入非离子表面活性剂：非离子型去污剂的头端基因是没有极性的亲水基团，它们被认为是比较温和的表面活性剂，它们可以破坏蛋白质、脂质以及脂质与脂质之间的连接，但是不会破坏蛋白质、蛋白质的连接，而且大多非离子去污剂不能使蛋白质变性。因此，这种去污剂可以使蛋白质溶解和分离，但保留了蛋白质的天然构象、功能以及它们的相互作用。在分离膜蛋白的应用中，这是此类去污剂的优势所在。这也是在反应过程中起到打开囊泡释放致敏微球的作用。
77.实验例
78.对试剂r2进行稳定性研究，包括效期稳定性、开瓶稳定性和运输稳定性：
79.效期稳定性是将三个批次的试剂放置于2-8℃条件下，分别于配制完成(第0月)以及第3、6、9、12、15、16月，按照产品技术要求对外观、准确度、空白限、线性、重复性进行测定，测定结果应符合产品技术要求；
80.开瓶稳定性是将三个批次试剂开瓶置于2-8℃条件下，按照产品技术要求，分别于开瓶当天、11、21、28、35天，对外观、准确度、空白限、线性、重复性等指标进行测定，测定结果应符合产品技术要求；
81.运输稳定性是将三个批次的试剂通过冷链运输运送可能最远的单边距离，货物震荡程度、温差变化、路途时间等因素均为不利的条件下，将试剂再返回的方式，比较运输前后试剂外观、准确度、空白限、线性、重复性的变化，并储存到有效期进行外观、准确度、空白限、线性、重复性检验，来判定试剂运输稳定性能。以下为具体比对说明。
82.以crp胶乳试剂为例，实施例为完成纳米细胞膜囊泡与试剂包封后得到的试剂r2，分别包含80-100nm、120-180nm的致敏微球，对比例为未完成纳米细胞膜囊泡与试剂包封的试剂r2，以下将简略进行长期稳定性试验：在2～8℃储存条件下，分别在0天、3个月、6个月及13个月对crp质控qc1和qc2进行测试，每次测定3次，结果取均值，计算相对偏差，结果见
下表1和表2。
83.实施例具体实验操作如下：
84.1.胶乳偶连抗体后得到致敏微球：
85.1)取0.1ml110nm胶乳微球，加入0.9ml，0.1mol/l、ph6.0的mes混合；
86.2)向上述混合液中加入edc和nhs各5mg活化，室温下温和搅拌15min，10000rpm，离心15min，用0.1mol/l pbs重复洗涤3次，弃上清，沉淀后经0.1mol/l pbs重悬、震荡、超声处理后得到活化的胶乳微球；
87.3)取40ul待偶联抗体(10mg/ml)加入到1ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌4h，10000rpm离心15min，沉淀用含0.05％tween20的pbs重复清洗3次，然后用0.1mol/l pbs复溶，即得到致敏微球。
88.2.细胞囊泡的制备：
89.细胞膜的获取：通过合适的化学/物理刺激因子或修饰技术使细胞膜表达或嵌合某种特定功能分子，功能化的细胞用pbs分散，107个细胞/管分装在离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清液，获得备用细胞；准备细胞裂解液：0.01m tris，0.001m mgcl2、2mm pmsf，0.35m蔗糖、终浓度为10ug/ml的dnase和rnasea溶于蒸馏水，终ph＝7.4；107个备用细胞加入1ml细胞裂解液，2200rpm匀浆2min，4℃、4000rpm，离心10min，收集上清液，再4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，所获沉淀用细胞裂解液洗涤两遍，所得沉淀即为纯化细胞膜。
90.3.将致敏微球电转入细胞微囊泡内得到胶乳试剂r2：
91.细胞膜载物纳米囊泡制备：107个细胞的细胞膜用0.5ml pbs重悬后，用超声破碎仪以400w功率超声25-35s，之后与等体积待包裹致敏微球溶液混匀，用挤出器将悬浮液通过不同孔径尺寸的醋酸膜挤出20-30次，制备不同尺度载物纳米囊泡；收集挤膜完成的混悬液，于4℃、100000g离心1h，弃上清，沉淀用200-500ul pbs重悬得到载物纳米囊泡。
92.对比例具体实验操作如下：
93.1.胶乳偶连抗体后直接得到试剂r2：
94.1)取0.1ml110nm胶乳微球，加入0.9ml，0.1mol/l、ph6.0的mes混合；
95.2)向上述混合液中加入edc和nhs各5mg活化，室温下温和搅拌15min，10000rpm，离心15min，用0.1mol/l pbs重复洗涤3次，弃上清，沉淀后经0.1mol/l pbs重悬、震荡、超声处理后得到活化的胶乳微球；
96.3)取40ul待偶联抗体(10mg/ml)加入到1ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌4h，10000rpm离心15min，沉淀用含0.05％tween20的pbs重复清洗3次，然后用0.1mol/l pbs复溶，即得到试剂r2。
97.表1 80-100nm致敏微球测试
[0098][0099]
表2 120-180nm致敏微球测试
[0100][0101]
由以上结果分析可见，即使最终结果都在可控范围内，但完成纳米细胞膜囊泡与试剂包封后得到的试剂r2包括80-100nm、120-180nm的致敏微球无论在信号保留及与均值的相对偏差上都较未完成纳米细胞膜囊泡与试剂包封后得到的试剂r2更胜一筹。
[0102]
第三方面，本发明实施例提供细胞膜囊泡在制备体外诊断试剂中的应用。
[0103]
第四方面，本发明实施例提供细胞膜囊泡在制备胶乳增强免疫比浊试剂中的应用。
[0104]
从而，本发明实施例通过采用细胞膜囊泡包裹胶乳增强免疫比浊试剂中的致敏微球以提高胶乳增强免疫比浊试剂的稳定性，从而避免了现有的胶乳增强免疫比浊试剂不稳定的缺陷，从而，避免了胶乳增强免疫比浊试剂中会出现抗体脱落或者胶乳凝集等现象。
[0105]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。