分离血液中游离甲状腺激素的方法及其应用

1.本发明属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种分离血液中游离甲状腺激素的方法及其应用。


背景技术：

2.甲状腺为内分泌腺体，它分泌的具有生物活性的甲状腺激素(th)对机体的生理作用广泛而强烈。甲状腺激素分泌量增加或减少均可导致甲状腺功能失调，内分泌代谢紊乱。甲状腺疾病，包括甲状腺功能减退症和甲状腺功能亢进症，是世界范围内临床中经常遇到的一种相对普遍的疾病。由于甲状腺疾病的体征和症状在许多患者中不明显，并且甲状腺疾病是导致多种病理状况的原因，因此生化甲状腺功能测试(tft)对甲状腺疾病的准确诊断至关重要。然而，测定游离甲状腺激素是临床检测的难点，为了不干扰结合态与游离态之间的内源性平衡，需要采用适当的物理方法分离出游离甲状腺激素。目前主要采用的是平衡透析(ed)和超滤(uf)两种方法，2006年，van uytfanghe等人提出了第一种能够定量人血清中ft4的平衡透析方法。在随后的几年里，一些研究者成功地使用了与lc-ms/ms联用的平衡透析程序。然而，ed存在着显著的局限性，包括耗时(17—24小时)、劳动密集、不精确、技术要求高且成本高，很难在临床实验室进行。超滤(uf)的优势在于具有快速分离的能力(约30min)，并且未使用不适合lc
–
ms/ms分析的磷酸盐缓冲盐水稀释，但实验室下uf步骤的准确性和稳定性尚未得到充分验证，其缺点体现在相关分析物在膜上的吸附、蛋白质泄漏以及需要对温度和ph值进行最佳控制。总的来说，这两种技术都面临着分析物与膜或装置表面非特异性结合的挑战。
3.因此，迫切需要新的分离技术，能够克服现有技术的局限性，同时仍然提供快速和准确的分离。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明目的在于提供一种分离血液中游离甲状腺激素的方法，该方法通过选取合适的尺寸排阻填料，根据分子量大小不同，实现结合态甲状腺激素和游离态甲状腺激素的快速、有效分离，解决了游离态甲状腺激素分离过程中存在的非特异性吸附问题。
5.所述方法包括以下步骤：(1)活化spe凝胶小柱；(2)取血清样本上样孵育；(3)洗脱分离。
6.具体地，凝胶过滤被认为是一种有价值的替代方法，它的突出优点是所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，具有开发的潜力。
7.进一步，所述spe凝胶选自gpc或sec。
8.优选地，所述spe凝胶选自sephadex lh-20、sephadex g-25、toyopearl hw-40或sec-120。
9.进一步，步骤(1)中，所述活化的溶剂为pb缓冲溶液，ph为7.3-7.8。
10.进一步，步骤(1)中，所述pb缓冲溶液浓度为0.1m，由a液和b液配制而成，其中a液为nah2po4或kh2po4水溶液；b液为na2hpo4或k2hpo4水溶液。
11.进一步，步骤(1)中，所述活化包括：冲洗3-5个柱体积，平衡时间为0.5-2h。
12.具体地，进行活化是为了防止固体基质干扰结合态与游离态甲状腺激素的内源性平衡。
13.进一步，步骤(2)中，取与所述血清样本等体积的pb缓冲液进行上样孵育。所述pb缓冲溶液由a液和b液配制而成，其中a液为nah2po4或kh2po4水溶液；b液为na2hpo4或k2hpo4水溶液。
14.进一步，步骤(2)中，所述孵育为36-38℃恒温孵育0.5-1.5h。
15.进一步，步骤(3)中，所述洗脱分离包括：先使用洗脱液a进行冲洗，然后再使用洗脱液b进行冲洗，所述洗脱液a选自tris-hcl缓冲液、pb缓冲液中一种或多种混合，所述洗脱液b选自甲醇、质量分数0.1-0.2％氨水-甲醇、乙腈中的一种或多种混合。
16.进一步，所述洗脱液a的ph值设置为7.3-7.8。
17.进一步，步骤(3)中，在某些具体实施例中，填料量选择5-60mg。
18.本发明目的在于还提供一种分离血液中游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4或游离甲状腺激rt3中一种或多种的方法，该方法可以将游离甲状腺激素t3、t4或rt3同时从游离甲状腺激素(包括游离甲状腺激素t3、t4、rt3和其他物质)中分离出来。
19.所述方法包括以下步骤：(a)先利用前任一所述的方法将游离甲状腺激素从血液中分离出来得游离甲状腺激素；(b)然后使用高效液相色谱将游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4或游离甲状腺激rt3中一种或多种从所述离甲状腺激素进行分离。
20.具体地，在某些具体实施例中，分离血液中游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4或游离甲状腺激rt3中一种或多种的方法包括以下步骤：
21.(1)活化spe凝胶小柱：去除保存液，用pb缓冲液(0.1m，ph＝7.4)冲洗2次(3mlx2)，平衡1h。
22.(2)上样：取0.5ml血清，加入0.5mlpb缓冲液(0.1m，ph＝7.4)，轻轻摇匀，缓慢滴加至凝胶小柱，排除残余溶剂。
23.(3)恒温孵育(37℃，1h)。
24.(4)洗脱：
①
先用tris hcl缓冲液(0.1m，ph＝7.4)，冲洗2次(2mlx2)；
②
并立刻用0.4ml甲醇去除残留缓冲液；
③
最后用2ml甲醇洗脱游离甲状腺素。
25.(5)氮气浓缩、复溶(复溶液为甲醇、40％甲醇-水、乙腈其中一种)、加内标：将洗脱后的2ml溶液用氮气吹干，然后加入100ul的甲醇复溶，再加入100ul内标混合液(55pg/ml),振荡5分钟后进行高效色相色谱检测。
26.进一步，所述高效液相色谱以c18或者苯基或者五氟苯基为填料的色谱柱，以流动相a和流动相b为流动相进行梯度洗脱；所述流动相a为体积分数0.1-0.2％的甲酸水溶液，流动相b相为甲醇或乙腈的一种或多种混合；所述梯度洗脱的程序为：
27.0min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为58-60:40-42，
28.0.5min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为58-60:40-42，
29.4min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为2-4:96-98，
30.5min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为2-4:96-98，
31.5.01min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为58-60:40-42，
32.6min，设置所述流动相a与所述流动相b的体积比为58-60:40-42。
33.进一步，所述高效液相色谱的流速设置为0.3—0.5ml/min，柱温设置为35—40℃，进样量设置为2—10ul。
34.进一步，所述步骤(b)后，进入质谱仪进行检测；所述质谱仪的条件包括：选择三重四极杆质谱仪，esi源，正离子模式，多反应监测方式；检测游离甲状腺激素t3的离子对为651.8
→
478.8，检测检测游离甲状腺激素t4的离子对为777.7
→
604.7。
35.进一步，所述质谱仪的条件还包括：脱溶剂气温度为580-620℃；离子源温度为130-170℃；毛细管电压为2.5-3.2kv；锥孔电压为28-32v；脱溶剂气流量为580-620l/hr；吹扫气流量为18-22l/hr。
36.进一步，质谱检测后，采用同位素内标法测量所述游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4或游离甲状腺激rt3的含量；所述同位素内标法使用的内标溶液为包含t3-13c12
、rt3-13
c6、t4-13c12
的混合液。
37.进一步，对游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4进行定量分析时，定量游离甲状腺激素t3的离子对为651.8
→
605.8，定量游离甲状腺激素t4的离子对为777.7
→
731.8。
38.具体地，质谱检测后，采用同位素内标定量法，以标准品的浓度比为x轴，以标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线；根据测得的人血清样品与内标物峰面积比对照校准曲线，计算人血清样品中游离甲状腺激素的浓度。本发明有益效果在于
39.本发明提供的分离血液中游离甲状腺激素的方法采用凝胶过滤，将结合态和游离态甲状腺激素快速、有效分开，解决了分离过程中的吸附问题，保证游离甲状腺激素检测结果的准确性，与平衡透析(ed)和超滤(uf)相比，操作简便，处理效率高，耗材成本低，准确度高，便于临床推广和应用。
40.本发明提供的分离血液中游离甲状腺激素的方法血清样本加入等体积的缓冲液，降低黏度，减少吸附，并且维持ph为7.3-7.8，恒温孵育，保持温度37
±
2℃，模拟体内的生理环境，保证检测结果真实可靠。
41.本发明提供的分离血液中游离甲状腺激素t3、游离甲状腺激t4或游离甲状腺激rt3中一种或多种的方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，特异性高，可以极大的避免交叉反应的干扰,从而提高准确度；而且采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量。
附图说明
42.图1为ft3、ft4的校准品mrm图谱。
43.图2为检测校准品ft3、ft4的内标mrm图谱。
44.图3为人血清中ft3、ft4mrm图谱。
45.图4为检测人血清中ft3、ft4的内标mrm图谱
46.图5为三碘甲状腺原氨酸的校准曲线。
47.图6为甲状腺素的校准曲线。
具体实施方式
48.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
49.本发明实施例中，spe凝胶小柱的规格为：柱内径:1cm,长度：7cm。
50.本发明实施例中，超高效液相色谱分离的条件为：色谱柱型号：waters xbridge
tm phenyl column；流动相a：0.1％甲酸水，流动相b：甲醇；流速：0.3ml/min；柱温：40℃；进样量：5ul；梯度洗脱(梯度洗脱程序见表1)。表1本发明实施例超高效液相色谱梯度洗脱程序表1本发明实施例超高效液相色谱梯度洗脱程序
51.本发明实施例中，质谱检测条件为：离子源为：esi源；数据扫描方式：正离子模式；测定方式：多反应监测方式(mrm)；质谱的脱溶剂气温度为600℃；离子源温度为150℃；毛细管电压为2.50kv；锥孔电压为30v；脱溶剂气流量为600l/hr；吹扫气流量为20l/hr；各个目标物的保留时间，mrm检测离子对、碰撞电压见表2。表2本发明实施例中各个目标物的保留时间，mrm检测离子对、碰撞电压
52.本发明实施中，将t4、t3浓度均为100ng/ml的混合标准溶液，加入100μl活性炭去除甲状腺激素的空白血清基质中，配制得低、中、高三个浓度水平(4、50、75pg/ml)的甲状腺激素基质溶液，按上述方法进行前处理，并进行uplc-ms/ms分析，并计算该方法的回收率，以每个浓度重复测定6次的结果计算方法的重复性。
53.本发明实施例中，人血清中游离t3、t4的检测步骤如下：
54.(1)活化spe凝胶小柱：去除保存液，用pb缓冲液(0.1m，ph＝7.4)冲洗2次(3mlx2)，平衡1h。
55.(2)上样：取0.5ml血清，加入0.5mlpb缓冲液(0.1m，ph＝7.4)，轻轻摇匀，缓慢滴加至凝胶小柱，排除残余溶剂。
56.(3)恒温孵育(37℃，1h)。
57.(4)洗脱：
①
先用tris hcl缓冲液(0.1m，ph＝7.4)，冲洗2次(2mlx2)；
②
并立刻用0.4ml甲醇去除残留缓冲液；
③
最后用2ml甲醇洗脱游离甲状腺素。
58.(5)氮气浓缩、复溶、加内标：将洗脱后的2ml溶液用氮气吹干，然后加入100ul的甲醇复溶，再加入100ul内标混合液(55pg/ml),振荡5分钟后，将混合溶液转移至棕色进样瓶。
59.(6)进行超高效液相色谱分离；
60.(7)进入质谱进行检测。
61.实施例1 sephadex lh-20
62.本发明实施例选择sephadex lh-20 spe凝胶小柱进行检测，结果如下表3所示，表明甲状腺激素的回收率为82.6％-114.5％，相对标准偏差(rsd)为3.3％-8.9％。表3 sephadex lh-20的回收率和重复性
63.实施例2 sec-120
64.本发明实施例选择sec-120 spe凝胶小柱进行检测，结果如下表4所示，表明甲状腺激素的回收率为77.8％-109.6％，相对标准偏差(rsd)为2.9％-8.3％。表4 sec-120的回收率和重复性
65.实施例3 sephadex g-25
66.本发明实施例选择sephadex g-25 spe凝胶小柱进行检测，结果如下表5所示，表明游离甲状腺激素的回收率为71.6％-120.5％，相对标准偏差(rsd)为4.3％-9.6％。表5 sephadex g-25的回收率和重复性
67.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。