用于表达嵌合受体的递送载体和颗粒及其使用方法与流程

用于表达嵌合受体的递送载体和颗粒及其使用方法
相关申请的交叉引用
1.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求2019年5月29日提交的美国临时申请62/854,082的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
2.本公开文本总体上涉及癌症治疗领域，具体地基于单核细胞的靶向细胞疗法。本公开文本提供了用于将编码嵌合受体的基因有效递送至单核细胞(如巨噬细胞)和其他免疫细胞的组合物和方法。本公开文本进一步提供了通过以下方式来治疗癌症的方法：向患者施用包含编码嵌合受体的载体的颗粒，使得所述嵌合受体在体内表达，从而当所述嵌合受体结合其靶分子或抗原时，激活所述患者的免疫系统以附着所述癌症。


背景技术：

3.提供以下讨论仅仅为了帮助读者理解本公开文本，而不是承认描述或构成其现有技术。
4.免疫系统由多种类型的细胞组成，这些细胞能够检测病原体或病理细胞在体内的存在并将它们从体内除去。有时，这是由于外来物被免疫系统细胞包封并被破坏或带出身体而发生的。如果活的宿主细胞已经被细菌细胞或病毒侵入，则免疫系统细胞可能靶向并破坏该受感染的细胞。
5.例如，单核细胞通常在体内巡逻以寻找外来的非自身抗原，如细菌。单核细胞吞噬细菌，然后在溶酶体中将其消化成较小的抗原部分。得到的细菌抗原循环回到这些细胞的细胞表面，以呈递给免疫系统的体液和细胞武器。此外，单核细胞还可以检测、靶向和破坏已经受损或发生遗传突变的病理细胞。癌细胞代表可被免疫系统的细胞杀伤的此类病理细胞的一个例子。
6.单核细胞在从血流迁移到特定组织后可以分化成巨噬细胞或树突细胞。重要的是，许多实体瘤在肿瘤床内存在大量巨噬细胞。这些肿瘤相关巨噬细胞(tam)被吸引到肿瘤的低氧和/或坏死微环境中，在那里它们可以通过各种途径(如核因子-κb(nf-κb)的激活和促血管生成信号(例如，vegf)的释放)促进肿瘤生长和进展。
7.此外，在许多情况下，癌细胞能够逃避患者的先天免疫系统。在正常情况下，t细胞将经由t细胞受体(tcr)识别特定抗原，当t细胞表面上的tcr与含有tcr特异性抗原的抗原呈递细胞(通常为树突细胞、巨噬细胞或b细胞)表面上的复合物结合时，tcr被“引发”。接下来，t细胞必须接收来自抗原呈递细胞的共刺激信号。这最常见地通过t细胞上的cd28受体与其配体b7-1和b7-2(也分别称为cd80和cd86)中的任一种的接合来提供。当此过程不能发生时，先天免疫系统对癌细胞产生耐受性。
8.因此，以这样的方式利用tam将是有益的，使得将逆转其先天促肿瘤活性，而是通过检查点抑制和细胞因子产生起到刺激免疫系统攻击肿瘤细胞的作用。


技术实现要素：

9.本文描述了使用用于指导治疗性蛋白表达的单核细胞特异性珠载体来治疗肿瘤的组合物和方法。
10.在一方面，本公开文本提供了递送载体，其包含：(i)基础颗粒和(ii)附着于所述颗粒的外部的非感染性病毒，其中所述非感染性病毒包含编码嵌合受体的核酸，所述嵌合受体包含靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
11.在前述方面的一些实施方案中，编码所述嵌合受体的核酸包含在表达载体内。在一些实施方案中，所述表达载体包含t7启动子或低氧诱导的启动子。在一些实施方案中，所述表达载体包含seq id no:44。
12.在前述方面的一些实施方案中，所述基础颗粒是酵母细胞壁颗粒(ycwp)。在一些实施方案中，所述ycwp负载有生物材料，如肿瘤裂解物。
13.在前述方面的一些实施方案中，所述基础颗粒是珠，如铁磁颗粒、微珠或微球体。
14.在前述方面的一些实施方案中，所述递送载体的尺寸允许其优先被单核细胞(如巨噬细胞或更具体地肿瘤相关巨噬细胞(tam))吞噬。
15.在另一方面，本公开文本提供了单核细胞，其包含在其表面表达的嵌合受体，所述嵌合受体包含靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施方案中，所述细胞是巨噬细胞(例如，肿瘤相关巨噬细胞)或树突细胞。
16.在前述方面的一些实施方案中，所述嵌合受体的靶结合结构域包含与免疫检查点蛋白结合的scfv。例如，所述检查点蛋白可以选自ctla-4、pd-1、pd-l1、lag3、b7.1、b7-h3、b7-h4、tim3、vista、cd137、ox40、cd40、cd27、ccr4、gitr、nkg2d和kir。在一些实施方案中，所述检查点蛋白是ctla-4。在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含scfv，所述scfv包含seq id no:3或去除igk前导序列的seq id no:3。在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含seq id no:1的可变重链序列和seq id no:2的可变轻链序列。在一些实施方案中，所述检查点蛋白是pd-1。在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含对应于派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗(cemiplimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)或信迪利单抗(sintilimab)的相应可变重链和轻链序列的可变重链序列和可变轻链序列。在一些实施方案中，所述检查点蛋白是pd-l1。在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含对应于德瓦鲁单抗、阿特珠单抗或阿维鲁单抗(avelumab)的相应可变重链和轻链序列的可变重链序列和可变轻链序列。
17.在前述方面的一些实施方案中，所述靶结合结构域对ox40具有特异性(即，其特异性识别或结合至ox40)。例如，在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含scfv，所述scfv包含对应于scfv的相应可变重链和可变轻链序列的可变重链序列和可变轻链序列，所述scfv可以包含9b12(nct01644968)、moxr0916、pf-04518600、medi0562、medi6469、medi6383、pf-04518600或bms 986178的cdr和/或可变结构域区。在一些实施方案中，所述靶结合结构域包含ox40l的细胞外结构域。
18.在前述方面的一些实施方案中，所述跨膜结构域至少包含toll样受体、cd28、cd4、cd8、4-1bb、cd27、icos、ox40、hvem或cd30的跨膜部分。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含seq id no:16-25中的任一个。
19.在前述方面的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含toll样受体
(tlr)如tlr4或tlr9的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含seq id no:26或seq id no:27。
20.在前述方面的一些实施方案中，所述非感染性病毒是腺病毒(例如，重组腺病毒)、慢病毒或腺相关病毒。在一些实施方案中，所述非感染性病毒也是非复制性的。
21.在另一方面，本公开文本提供了治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用前述实施方案中任一项的递送载体。在另一方面，本公开文本提供了刺激患者的免疫系统的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用前述实施方案中任一项的递送载体。
22.在所公开的方法的一些实施方案中，皮内地施用所述递送载体。在所公开的方法的一些实施方案中，靠近靶淋巴结施用所述递送载体。
23.在所公开的方法的一些实施方案中，所述癌症包含含有低氧微环境的至少一种肿瘤。在一些实施方案中，所述至少一种肿瘤包含肿瘤相关巨噬细胞(tam)。在一些实施方案中，所述癌症包含至少一种实体瘤。
24.在所公开的方法的一些实施方案中，所述递送载体被巨噬细胞吞噬，并且所述巨噬细胞随后在其表面表达所述嵌合受体。
25.本公开文本还提供了根据前述实施方案中任一项的递送载体，其用作抗癌剂。
26.本公开文本还提供了根据前述实施方案中任一项的递送载体，其用于治疗受试者的癌症，所述治疗包括向所述受试者施用所述递送载体。
27.本公开文本还提供了根据前述实施方案中任一项的递送载体，其用于刺激受试者的免疫系统，所述刺激包括向所述受试者施用所述递送载体。
28.本公开文本还提供了所述递送载体的前述实施方案中任一项作为抗癌剂的用途。
29.本公开文本还提供了所述递送载体的前述实施方案中任一项用于治疗受试者的癌症的用途，所述治疗包括向所述受试者施用所述递送载体。
30.本公开文本还提供了所述递送载体的前述实施方案中任一项用于刺激受试者的免疫系统的用途，所述刺激包括向所述受试者施用所述递送载体。
31.前面的发明内容和下面的具体实施方式是示例性和解释性的，而非对本公开文本的限制。
附图说明
32.图1显示了包含抗ctla-4scfv、gly4/ser1接头、人cd8跨膜结构域和人tlr4细胞内信号传导结构域的示例性嵌合受体的编码序列和组分。
33.图2显示了包含抗ctla-4scfv、gly4/ser1接头、人cd8跨膜结构域和人tlr4细胞内信号传导结构域的示例性嵌合受体的氨基酸序列和组分。
34.图3显示了包含嵌合受体融合基因的示例性表达载体。
35.图4显示了可以用于制备所公开的颗粒的示例性慢病毒载体。
36.图5显示了il-12特异性elisa测定的结果。在此测定中，将表达ctla4特异性嵌合受体的thp-1细胞暴露于各种浓度的重组ctla4。细胞通过以浓度依赖性方式表达il-12来响应于ctla4暴露。il-12表达不受暴露于lps的刺激，lps用作tlr激活的阳性对照。p1和p2是il-12的阳性对照，并且eb是elisa试剂盒提供的对照。
具体实施方式
37.一般而言，本公开文本提供了新型靶向基因递送载体和使用它们表达外源蛋白和治疗癌症的方法。具体地，本公开文本提供了用于在单核细胞(如巨噬细胞和树突细胞)中表达嵌合受体(即，嵌合抗原受体(car)或修饰的toll样受体(tlr))的基于珠或酵母细胞壁颗粒(ycwp)的递送载体。具体地，所公开的组合物和方法可以用于在肿瘤或肿瘤引流淋巴结的微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(tam)细胞中表达嵌合受体。表达所公开的嵌合受体的单核细胞(例如，tam)可以刺激免疫系统攻击肿瘤并克服免疫耐受性，免疫耐受性允许许多肿瘤避免免疫系统的检测。
38.更具体地，所公开的嵌合受体通常包含衍生自toll样受体(tlr)的细胞内信号传导结构域。tlr是一类单一的跨膜的非催化性受体，其在先天免疫系统中起关键作用并且通常在单核细胞(如巨噬细胞和树突细胞)上表达。在正常情况下，tlr识别衍生自微生物和其他外来非自身抗原的结构保守分子，并且在识别这种抗原后，tlr可以激活免疫细胞反应，包括但不限于细胞因子的表达。更具体地，tlr在免疫细胞的胞质溶胶内募集衔接蛋白(介导其他蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质)，以便传播抗原诱导的信号转导途径。然后，这些募集的蛋白质负责其他下游蛋白质的后续激活，所述其他下游蛋白质包括蛋白激酶(ikki、irak1、irak4和tbk1)，其进一步放大信号并最终导致协调炎症反应和其他转录事件的基因的上调或抑制。这些事件中的一些导致细胞因子产生、增殖和存活，而另一些导致更强的适应性免疫。
39.所公开的嵌合受体通过替换tlr的正常结合/抗原识别结构域并用识别参与免疫信号传导的检查点蛋白或另一种受体或分子(例如，ctla4、pd-1、pd-l1、ox40)的靶结合结构域替换它而起修饰的tlr的作用。因此，这种嵌合受体与其靶分子的结合将导致tlr激活以产生攻击性抗肿瘤免疫反应。虽然反应可以根据用于给定嵌合受体的细胞内tlr结构域而变化，但期望使用导致m1型(即，促炎性)细胞因子(如il-12、ifn-α、irn-γ、tnf-α、il-6和/或il-1β)表达的tlr(例如，tlr-4、tlr-9等)的信号传导结构域。因此，单核细胞(如巨噬细胞)对所公开的嵌合受体的表达和激活允许表达嵌合受体的细胞克服由大多数肿瘤促进的免疫抑制环境，而不像传统car t细胞那样直接攻击或吞噬肿瘤细胞。此外，因为此类受体在间接和基于传播免疫刺激中的推定作用机制，所以表达嵌合受体的细胞不必物理接触肿瘤或驻留在肿瘤微环境中(尽管这种定位是完全可接受的并且仍将起到破坏靶肿瘤的作用)。事实上，表达嵌合受体的细胞在肿瘤相邻淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)中的定位足以通过产生免疫活性的环境或背景来破坏肿瘤。
40.贯穿本公开文本，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引用来引用。将这些出版物、专利和公开的专利说明书的披露内容通过引用特此并入本公开文本中，以更全面地描述本公开文本所属领域的现有技术。定义
41.除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法均可以用于实施本文所述的方法。
42.如本文所用，术语“约”将为本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上将根据其使用的上下文而变化。如果本领域普通技术人员考虑到使用所述术语的上下文时对所
述术语的使用不清楚，则“约”将意指特定术语以及指定术语的最多加或减10％。例如，“约10”应当理解为意指“10”以及“9至11”。
43.如本文所用，术语“抗原结合结构域”可以与“靶结合结构域”可互换地使用。这些术语应当理解为是指旨在被所公开的嵌合受体结合的靶分子(例如，pd-1、pd-l1、ctla4、ox-40等)。所述术语不应当理解为暗示靶分子本身必须具有免疫原性或抗原性，而仅仅是所公开的受体(其可以包含抗体或抗体片段作为结合结构域的一部分)可以以与分离的抗体可以结合其靶抗原相同的意义与靶分子结合。
44.如本文所用，术语“包含”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但是不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
……
组成”应当意指排除对组合物或方法具有任何重要意义的其他要素。“由
……
组成”应当意指对于所要求保护的组合物和实质方法步骤排除其他成分的多于微量的要素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案均在本公开文本的范围内。因此，意图是方法和组合物可以包括另外的步骤和组分(包含)，或者可替代地包括不重要的步骤和组合物(基本上由
……
组成)，或者可替代地意图仅是所述方法步骤或组合物(由
……
组成)。
45.如本文所用，短语“治疗有效量”意指所公开的颗粒的剂量在需要这种治疗的受试者中提供施用药物所为的特定药理学作用，即通过激活免疫系统来减少、改善或消除癌症/肿瘤生长、进展或复发。要强调的是，治疗有效量的颗粒在治疗每个个体受试者的癌症/肿瘤中并不总是有效的，即使这样的剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。本领域技术人员可以根据治疗特定受试者和/或特定类型的癌症或肿瘤所需的标准实践来调整被认为是治疗有效量的量。治疗有效量可以基于施用途径、施用部位、剂型、受试者的年龄和体重和/或受试者的状况(包括治疗时癌症或肿瘤的进展、分期和/或类别)而变化。
46.如本文关于癌症或肿瘤所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指减少、改善或消除癌症/肿瘤生长和/或进展，或者引起癌症/肿瘤细胞死亡。
47.如本文所用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指停止癌症/肿瘤细胞的形成或抑制癌症/肿瘤生长的复发。
48.术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用，并且是指任何个体哺乳动物受试者，例如牛科动物、犬科动物、猫科动物、马科动物或人。
49.本公开文本的组合物和方法可以适当地在不存在本文未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当以广阔且无限制的方式来理解。另外，本文所采用的术语和表达已经用作描述性而非限制性的术语，并且不旨在使用此类术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效形式，但是应认识到在所要求保护的本公开文本的范围内各种修改均是可能的。嵌合受体
50.所公开的递送载体被设计为将编码嵌合受体的核酸递送到靶细胞(如单核细胞)中。出于本公开文本的目的，本公开文本的嵌合受体包含至少一个靶结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体可以进一步包含铰链/接头结构域和/或共刺激结构域。
51.在一些实施方案中，靶结合结构域可以是外源或非天然序列(例如，scfv片段)，而嵌合受体序列的其余部分包含toll样受体(tlr)序列。例如，示例性嵌合受体可以包含经由
gly4/ser1接头与cd8跨膜结构域连接的抗ctla-4scfv和人tlr4细胞内信号传导结构域。这种示例性嵌合受体的编码序列示于图1中。在一些实施方案中，嵌合受体可以包含不是衍生自tlr的跨膜结构域和/或细胞内结构域(例如，cdζ信号传导结构域)。a.靶结合结构域
52.所公开的嵌合受体的靶结合结构域决定受体的特异性。一般而言，靶结合结构域将包含抗体的可变结构域(例如，scfv结构域)，但是在一些实施方案中，靶结合结构域可以包含与靶向受体结合的肽，如pd-1的细胞外结构域、ctla-4的细胞外结构域或者ox40或ox40l(也称为gp34、cd252和tnfsf4)的细胞外结构域。pd-1细胞外结构域可以衍生自人(np_005009，nm_005018)、小鼠(np_032824，nm_008798)、牛科动物(np_001277851，nm_001290922)或其他动物来源。本领域技术人员将能够鉴定合适的pd-1细胞外结构域。例如，人pd-1的长度为288个氨基酸，并且氨基酸14-130代表细胞外结构域，而鼠pd-1也是288个氨基酸，但是氨基酸21-169代表细胞外结构域。ox40细胞外结构域可以衍生自人(np_003318，nm_003327)、小鼠(np_035789，nm_011659)或其他动物来源。本领域技术人员将能够鉴定合适的ox40细胞外结构域。例如，人ox40的n末端的氨基酸1-191构成细胞外结构域。ox40l细胞外结构域可以衍生自人(np_003317，nm_003326；nm_001297562，np_001284491)或其他动物来源。本领域技术人员将能够鉴定合适的ox40l细胞外结构域。例如，人ox40l的n末端的氨基酸1-133构成细胞外结构域。下表1中列出的任何抑制性或共刺激受体的细胞外结构域(如受体的配体结合结构域)也可以作为合适的靶结合结构域掺入所公开的嵌合受体中。
53.虽然应当理解对几乎任何肿瘤相关抗原或免疫途径信号传导分子均具有特异性的靶结合结构域可以掺入所公开的嵌合受体中，但优选的靶标是免疫检查点蛋白或ox40。
54.免疫检查点是参与免疫系统的抑制途径的蛋白质，其在正常条件下对于维持自身耐受性和调节外周组织中生理免疫反应的持续时间和幅度，以便使响应于病原性感染的附带组织损伤最小化是至关重要的。然而，作为免疫抗性和免疫逃避的重要机制，免疫检查点蛋白的表达通常因肿瘤而失调。
55.因为许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，所以它们可以容易地被对检查点配体和/或受体具有特异性的抗体或结合片段阻断。因此，所公开的嵌合受体的靶结合结构域可以被设计为对检查点蛋白(包括但不限于表1中所示的那些蛋白质)具有特异性，并且嵌合受体与其靶检查点蛋白的结合将抑制检查点信号传导。
56.出于本公开文本的目的，靶向检查点蛋白的靶结合结构域不受特别限制。例如，靶结合结构域可以包含人、嵌合、人源化或非人(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、牛科动物、猪科动物等)抗体的全部或部分。亲本抗体(即，用于掺入嵌合受体中的抗体序列)可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、ige或igm或者其变体或片段。在一些实施方案中，靶结合结构域包含单链fv(scfv)抗体片段(参见例如，bird等人,science,242:423-26(1988)；huston等人,proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-83(1988))，特别是与免疫检查点蛋白结合的scfv，所述免疫检查点蛋白包括但不限于上表1中列举的任何免疫检查点蛋白。
57.例如，在一些实施方案中，嵌合受体可以包含抗ctla-4scfv作为其结合结构域。抗ctla-4scfv可以包含伊匹单抗的互补决定区(cdr)和/或可变结构域区，其示于下表中。4scfv可以包含伊匹单抗的互补决定区(cdr)和/或可变结构域区，其示于下表中。
58.进一步的示例性抗ctla4 scfv包括但不限于衍生自替西木单抗(tremelimumab)
的可变链序列的scfv或包含以下序列的scfv：的可变链序列的scfv或包含以下序列的scfv：(seq id no:3；粗体/斜体文本代表igk前导序列)。衍生出此scfv的抗体的全长序列以及编码抗体的核酸序列披露于us 2011/0044953中，将其通过引用特此并入。
59.在一些实施方案中，嵌合受体可以包含抗pd-1scfv作为其结合结构域。抗pd-1scfv可以包含派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗、斯巴达珠单抗、卡瑞利珠单抗或信迪利单抗的cdr和/或可变结构域区，其示于下表中。
60.在一些实施方案中，嵌合受体可以包含抗pd-l1 scfv作为其结合结构域。抗pd-l1 scfv可以包含德瓦鲁单抗、阿特珠单抗和阿维鲁单抗的cdr和/或可变结构域区。
61.在一些实施方案中，嵌合受体可以包含抗ox40 scfv作为其结合结构域。抗ox40 scfv可以包含9b12(nct01644968)、moxr0916、pf-04518600、medi0562、medi6469、medi6383、pf-04518600或bms 986178的cdr和/或可变结构域区。ox40由于其独特的信号传导特性而在本文公开的靶分子中是特别期望的。例如，ox40可以在多种不同类型的t细胞上表达，并且其功能将根据细胞类型而变化。当在t效应细胞或t辅助细胞上表达的ox40结合其配体时，细胞被激活。但是当在t reg细胞上表达的ox40结合其配体时，细胞被失活。因此，激动ox40信号传导将有助于克服由许多肿瘤促进的免疫抑制环境，并且通过传播攻击性免疫反应产生活性免疫环境。b.跨膜结构域
62.所公开的嵌合受体包含将靶结合结构域连接到细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。一般而言，人蛋白质序列优选用于本发明嵌合受体的跨膜结构域的目的。在此可以使用已知嵌合抗原受体(car)中常用的各种跨膜结构域。例如，在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包含toll样受体、cd28、cd4、cd8、4-1bb、cd27、icos、ox40、hvem或cd30的跨膜部分。具体的示例性跨膜结构域包括在下表中，但不旨在进行限制。c.细胞内信号传导结构域
63.嵌合受体的细胞内信号传导结构域决定嵌合受体产生的细胞反应。一般而言，人蛋白质序列优选用于本发明嵌合受体的细胞内信号传导结构域的目的。例如，在一些实施方案中，嵌合受体可以包含tlr的细胞内信号传导结构域，所述tlr包括tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11、tlr12和tlr13。各种tlr之间的转换将改变单核细胞的细胞因子反应。tlr4和tlr9的信号传导结构域特别可用于治疗癌症，但是出于本公开文本的目的，嵌合受体可以可替代地包含tlr1、tlr2、tlr3、tlr5、tlr6、tlr7、
tlr8、tlr10、tlr11、tlr12或tlr13的信号传导结构域。
64.在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体可以包含cd3ζ信号传导结构域：(rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr；seq id no:43)。d.接头/铰链
65.所公开的嵌合受体可以任选地包含将靶结合结构域与跨膜结构域连接的接头或铰链。在此可以使用已知嵌合抗原受体(car)中常用的各种接头/铰链。例如，在一些实施方案中，接头或铰链可以包含igg4铰链或其衍生物、igg2铰链或其衍生物、cd28铰链或cd8铰链。具体的示例性跨膜结构域包括在下表中，但不旨在进行限制。e.共刺激结构域
66.所公开的嵌合受体可以任选地包含在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间
的共刺激结构域。一般而言，人蛋白质序列优选用于本发明嵌合受体的共刺激结构域的目的。在此可以使用已知嵌合抗原受体(car)中常用的各种共刺激结构域。例如，在一些实施方案中，共刺激结构域可以包含cd28、4-1bb、cd3、cd27、icos、ox40、hvem、cd30和/或t细胞共刺激分子家族的任何其他成员的一部分。具体的示例性跨膜结构域包括在下表中，但不旨在进行限制。用于表达嵌合受体的载体
67.出于本公开文本的目的，编码嵌合受体的核酸序列可以包含在表达载体内，所述表达载体能够在靶细胞(例如，单核细胞如巨噬细胞)中表达嵌合受体。更具体地，表达载体可以用于在靶细胞表面表达一种或多种嵌合受体。这种载体可以进一步包含调节序列，包括例如可操作地连接到编码序列的启动子、增强子和/或核糖体进入位点。载体可以任选地进一步包含选择性标记序列，例如用于在体外细菌或细胞培养系统中增殖。在一些实施方案中，选择性标记可以是截短的蛋白质或肽，如截短的cd19。
68.优选的表达载体可以包含复制起点、合适的启动子和/或增强子、以及任何必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5
′
侧翼非转录序列中的一种或多种。衍生自sv40或巨细胞病毒(cmv)病毒基因组的dna序列(例如，sv40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点)可以用于提供所需的非转录遗传元件。示例性表达载体示于图2中。在一些实施方案中，启动子可以是t7启动子。
69.嵌合受体的有效翻译和表达也可能需要特定的起始信号。这些信号可以包括atg起始密码子和相邻序列。在一些实施方案中，表达载体可以包含其自身的起始密码子，并且可以将相邻序列插入适当的表达载体中，并且不需要另外的翻译控制信号。然而，在一些实施方案中，可以仅使用开放阅读框(orf)的一部分，并且可以提供外源翻译控制信号，包括例如atg起始密码子。此外，起始密码子可以与所需编码序列(即，编码嵌合受体的核酸序列)的阅读框同相，以确保整个靶序列的翻译。
70.外源翻译控制信号和起始密码子可以具有天然和合成的多种来源。可以通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强表达效率(参见bittner等人,methods in enzymol.153:516-544(1987))。一些适当的表达载体由sambrook等人在molecular cloning:a laboratory manual,第二版,cold spring harbor,n.y.(1989)中描述，将其披露内容通过引入特此并入。如果需要，为了增强表达和促进正确的蛋白质折叠，可以优化序列的密码子背景和密码子配对，如hatfield等人,美国专利号5,082,767所解释。
71.启动子包括但不限于ef-1a启动子、cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、来自逆转录病毒的ltr启动子和小鼠金属硫蛋白-i启动子。示例性载体包括pwlneo、psv2cat、pog44、pxt1、psg(stratagene)、psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。选择性标记包括cat(氯霉素转移酶)。优选的载体还包括细胞质载体，如t7载体系统。参见wagner等人,美国专利号5,591,601(1997年1月7日)。
72.在一些实施方案中，载体可以另外包含其他功能序列，如fsv非结构蛋白基因和/
或fsv亚基因组启动子。
73.在一些实施方案中，启动子可以是诱导型的。诱导型启动子可操作地将靶基因(例如，嵌合受体)的表达与特定信号或特定生物或非生物因子连接。可以用于所公开的表达系统的诱导型启动子的类型包括但不限于化学(即，抗生素、类固醇、金属等)诱导型启动子、光诱导型启动子、热诱导型启动子和低氧诱导型启动子。
74.在一些实施方案中，嵌合受体的转录和表达可以由低氧诱导型启动子控制。低氧下基因表达的转录调节可以由低氧诱导因子1(hif1)介导。hif1与启动子的增强子序列中的hif1应答元件(hre)的结合导致基因表达。已经发现几种基因启动子是低氧诱导型的，包括但不限于促红细胞生成素基因启动子、磷酸甘油酸激酶-1启动子和vegf启动子(the journal of experimental biology 201,1153
–
1162,1998)。
75.由于天然启动子受多种转录因子调节，因此也可以制备对低氧更具特异性的嵌合启动子(gene therapy(2002)9,1403
–
1411)。因此，在一些实施方案中，嵌合启动子可以用无增强子的基础病毒启动子(如sv40启动子和cmv启动子)以及hre的几个拷贝构建。例如，在一些实施方案中，所公开的表达系统可以包含hrex3 基础sv40启动子的嵌合启动子。
76.将低氧诱导型启动子掺入用于表达嵌合受体的表达载体中可以增加可能已吸收所公开的递送载体的肿瘤相关巨噬细胞(tam)的肿瘤靶向。肿瘤的微环境通常是其他方面健康的身体中唯一的低氧环境，并且tam可以定位于低氧肿瘤床。因此，如果将所公开的递送载体全身性地(例如，在肿瘤引流淋巴结附近)施用给受试者并且被淋巴结中或循环中的单核细胞吞噬，则由表达载体编码的嵌合受体将不表达，直到单核细胞已经渗入肿瘤床中并且暴露于低氧条件。这将导致所公开的嵌合受体的肿瘤靶向表达。
77.鉴于上述内容，在一些实施方案中，本公开文本提供了用于通过工程化肿瘤相关巨噬细胞(tam)和其他单核细胞以表达嵌合受体来激活免疫系统的递送载体和表达载体，所述嵌合受体如包含免疫检查点特异性靶结合结构域(例如，抗ctla-4scfv)或ox40特异性靶结合结构域(例如，衍生自9b12、moxr0916、pf-04518600、medi0562、medi6469、medi6383、pf-04518600或bms 986178的scfv)、跨膜结构域(例如，cd8跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如，tlr(如tlr4或tlr9)的细胞内信号传导结构域)的受体。单核细胞全身性地(如在肿瘤相邻淋巴结中)或特异性地在肿瘤床内表达所公开的嵌合受体可以竞争性地阻断免疫检查点(如ctla-4、pd-1和pd-l1)的结合，和/或刺激ox40信号传导，从而激活免疫系统以引发强烈且具肿瘤特异性的抗肿瘤反应，这导致肿瘤的破坏和疾病的治疗。此外，嵌合受体与其靶分子(例如，ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40等)的结合不仅抑制检查点信号传导或激动ox40信号传导，而且刺激嵌合受体的细胞内信号传导结构域(即，tlr的细胞内结构域)。例如，这可以引发细胞因子反应，其通过产生活性免疫环境和传播攻击性免疫反应而进一步攻击和破坏肿瘤。当各种tlr结构域(如tlr4和tlr9)用作嵌合受体的细胞内信号传导结构域时，通过结合靶分子激活嵌合受体将触发细胞因子(包括但不限于il-12、ifn-α、irn-γ、tnf-α、il-6和/或il-1β)的表达，从而克服或绕过肿瘤的免疫抑制环境。
78.在一些实施方案中，单核细胞可以暴露于并因此吞噬包含多于一种表达载体的递送载体，并且表达载体可以编码相同或不同的嵌合受体。例如，单一递送载体可以包含编码抗ctla-4嵌合受体和抗pd-1嵌合受体的表达载体。另外地或可替代地，在一些实施方案中，给定的单核细胞可以暴露于并因此吞噬多于一种递送载体，每种递送载体包含编码不同嵌
合受体的不同表达载体。例如，单核细胞可以吞噬两种不同的递送载体，其中一种包含编码抗ctla-4嵌合受体的表达载体，并且另一种包含编码抗pd-1嵌合受体的表达载体。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了表达1、2、3、4或5种或更多种不同嵌合受体的单核细胞(如肿瘤相关巨噬细胞)，如本文所公开的。递送载体
79.本公开文本提供了用于定向进入单核细胞的基于固体基质的组合物(下文称为“递送载体”)。根据本公开文本的递送载体通常由基础颗粒组成，所述基础颗粒可以被单核细胞吞噬，其中病毒组分附着于所述基础颗粒的表面。病毒组分不仅可以在被单核细胞吞噬时起到帮助逃避溶酶体的作用，而且还可以包含用于编码嵌合受体的表达载体，如上文所讨论。所公开的递送载体对吞噬细胞如单核细胞(包括树突细胞和巨噬细胞)具有高度特异性。对单核细胞的这种显著的选择性使得递送载体对于需要将基因(例如，编码嵌合受体的基因)引入和表达到单核细胞谱系的细胞中的基因疗法和其他基因医学方法极为有用。a.基础颗粒
80.所公开的递送载体通过“看起来”像细菌来利用单核细胞的吞噬活性。因此，基础颗粒的优选尺寸是近似于单核细胞通常摄取的细菌抗原的尺寸的尺寸。通常，载体颗粒将为约0.5至约2.5微米或约0.5至约1微米。因此，载体颗粒可以为约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4或约2.5微米。
81.在一些实施方案中，基础颗粒可以是酵母细胞壁颗粒(ycwp)，如酵母葡聚糖颗粒。在一些实施方案中，基础颗粒可以是珠。i.酵母细胞壁颗粒(ycwp)
82.ycwp可以由酵母细胞壁制备，使得颗粒对于各种大分子的递送是多孔的。在一个实施方案中，ycwp可以由酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)制备。在另一个实施方案中，ycwp可以是酵母聚糖颗粒。在另一个实施方案中，ycwp近似于单核吞噬细胞系统的细胞和其他吞噬细胞通常摄取的微生物结构(例如，细菌)的尺寸。在特定实施方案中，ycwp可以为约1-5μm。
83.在一些实施方案中，ycwp可以通过以下方式来制备：(a)悬浮酵母以产生悬浮液，(b)孵育悬浮液，(c)离心悬浮液并除去上清液以及(d)回收所得的ycwp。在一些实施方案中，将步骤(a)-(d)重复至少1、2、3或4次。
84.在一些实施方案中，ycwp可以通过以下方式来制备：(a)将酵母悬浮在溶液中以产生第一悬浮液，(b)孵育第一悬浮液，(c)离心第一悬浮液并除去上清液，(d)悬浮所得的沉淀以产生第二悬浮液，(e)孵育第二悬浮液，(f)离心第二悬浮液并除去上清液以及(g)洗涤所得的沉淀以回收ycwp。在一些实施方案中，对ycwp进行灭菌。
85.在一些实施方案中，将酵母悬浮在naoh(包括1m naoh)中。在一些实施方案中，将第一悬浮液在约80℃下孵育约1小时或1小时。在一些实施方案中，离心在约2000倍重力下进行约10分钟，或者在2000倍重力下进行10分钟。在一些实施方案中，将沉淀悬浮在水(包括约ph 4.5或ph 4.5的水)中。在一些实施方案中，将第二悬浮液在约55℃下孵育约1小时或者在55℃下孵育1小时。在一些实施方案中，将沉淀在水中洗涤至少1、2、3或4次。在一些实施方案中，将沉淀洗涤一次。
86.在一些实施方案中，在洗涤沉淀后使用异丙醇和/或丙酮对ycwp进行灭菌。在特定实施方案中，其他已知的醇是适当的。在一些实施方案中，允许ycwp在灭菌后完全干燥。在一些实施方案中，将ycwp在允许干燥后再悬浮。在一些实施方案中，将ycwp冷冻干燥并在4℃下储存。
87.ycwp具有至少约30nm的孔径，因此，可以将具有30nm或更小的旋转半径的任何分子/物体负载在酵母细胞壁颗粒内。例如，可以将一些尺寸小于30nm的病毒或病毒颗粒(例如，烟草花叶病毒)以及其他抗原(包括肿瘤裂解物)负载在酵母细胞壁颗粒内。当ycwp用作所公开的递送载体的基础颗粒时，递送载体的抗肿瘤活性可以通过用抗原组分(如肿瘤抗原或肿瘤细胞裂解物)负载ycwp来增强。通过允许递送载体同时起肿瘤疫苗的作用，这可以除嵌合受体的表达之外增加或协同递送载体的免疫刺激。因此，在一些实施方案中，ycwp是在pbs(如1x pbs)中的一些。在一些实施方案中，在将肿瘤裂解物负载到ycwp中之前，允许ycwp干燥，然后冷冻，以便在使用前将其储存。在一些实施方案中，将ycwp冷冻干燥并在约4℃或更低温度下储存。
[0088]“肿瘤裂解物”是指当通过物理或化学方法破坏肿瘤细胞的细胞膜时产生的溶液。在一些实施方案中，由实体瘤制备肿瘤裂解物，所述实体瘤包括但不限于癌和肉瘤。在一些实施方案中，由肿瘤细胞系制备肿瘤裂解物。在一些实施方案中，由与乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、黑素瘤、前列腺癌和眼黑素瘤相关的任何实体瘤或肿瘤细胞系制备肿瘤裂解物。在一些实施方案中，在多种条件下产生肿瘤裂解物，所述条件包括重复冷冻和解冻、均质化、与高渗或低渗溶液接触或与一种或多种非离子型洗涤剂接触。
[0089]
ywcp可以负载有生物材料，如特定蛋白质或其片段、核酸、碳水化合物、肿瘤裂解物或其组合。在一些实施方案中，可以通过将生物材料和ycwp的悬浮液一起孵育并允许生物材料透入颗粒的中空内部来将生物材料负载到ycwp中。
[0090]
在一些实施方案中，在将ycwp与生物材料一起孵育或ycwp负载有生物材料后，将组合冷冻干燥以产生无水颗粒。通过冷冻干燥，将生物材料捕获在颗粒内。在一些实施方案中，冷冻干燥是用于将生物材料捕获在颗粒内的唯一机制。在一些实施方案中，捕获(entrapment)不是由阻断生物材料离开颗粒的单独组分引起的，例如通过物理捕获、疏水结合、任何其他结合。在一些实施方案中，捕获不是由交联或以其他方式将生物材料附着于冷冻干燥时可能发生的任何附着之外的颗粒上引起的。在一些实施方案中，本发明的组合物不包括特别有助于逃避溶酶体的任何另外的组分。生物材料包括例如特定蛋白质或其片段、核酸、碳水化合物、肿瘤裂解物或其组合。在一些实施方案中，ycwp的数量为约1x109，并且生物材料的体积为约50μl。在特定实施方案中，在约4℃下孵育约1小时或少于1小时。在一些实施方案中，将ycwp和生物材料的组合冷冻干燥少于或约2小时的时间。
[0091]
在一些实施方案中，通过以下方式将生物材料负载到颗粒中：(a)孵育生物材料和ycwp的悬浮液，允许生物材料透入颗粒的中空内部并冷冻干燥负载的颗粒的悬浮液；以及(b)任选地再悬浮颗粒，孵育再悬浮的颗粒并冷冻干燥再悬浮的颗粒。
[0092]
在使用ycwp的一些实施方案中，ycwp的数量为约1x109，并且生物材料的体积为约50μl。在一些实施方案中，ycwp的数量为1x109，并且生物材料的体积为50μl。在一些实施方案中，步骤(a)中的孵育在约4℃下进行少于1小时。在特定实施方案中，步骤(a)中的孵育在
4℃下进行约1小时。在一些实施方案中，在步骤(a)中将前述悬浮液冷冻干燥少于2小时的时间或约2小时的时间。在一些实施方案中，将步骤(b)中的ycwp再悬浮于水(包括约50μl水或50μl水)中。在一些实施方案中，在步骤(b)中将再悬浮的ycwp在约4℃下孵育少于或约1小时或者在4℃下孵育少于或约2小时。生物材料包括特定蛋白质或其片段、核酸、碳水化合物、肿瘤裂解物或其组合。
[0093]
在一些实施方案中，负载的ycwp包被有硅酸酯。具体地，在一些实施方案中，负载的ycwp通过在氨存在下使ycwp与硅酸酯(如原硅酸四烷基酯)接触来包被，使得负载的ycwp被硅酸酯覆盖。在优选的实施方案中，负载的ycwp在约60分钟、约45分钟、约30分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约2分钟内被硅酸酯覆盖。原硅酸四烷基酯的反应性使得在由氨介导的水解下，原硅酸四烷基酯与ycwp的β-葡聚糖结构的伯羟基反应。原硅酸四烷基酯还与这些细胞壁硅酸酯的末端自反应以形成“桥”，如-o-si(oh)
2-o-；或呈三维形式，如-o-si(-o-si-o-)(oh)-o-或-si(-o-si-o-)
2-o-。这些桥可以穿过ycwp中的孔，使得增加负载的药物或生物材料在其中的保留。可以将这种覆盖的负载的ycwp冷冻干燥。ii.珠颗粒
[0094]
在当珠用作基础颗粒的那些实施方案中，必须权衡几个因素以确定对于给定需要理想的珠。例如，从摄入的角度来看，范围的较小端是优选的，因为它更接近地近似于细菌的尺寸。另一方面，出于制造的目的，稍大的颗粒可能是优选的，因为它们可能不太可能粘在一起。
[0095]
此外，珠颗粒不受形状或材料的限制。珠颗粒可以具有允许珠载体被单核细胞吞噬的任何形状、尺寸或材料。
[0096]
在一些实施方案中，基础颗粒选自被聚合物包衣覆盖的任何已知的铁磁中心。例如，可以用作基础颗粒的珠包括但不限于微珠、微球体和硅酸酯珠。此类珠在某些应用中可能是优选的，因为磁性分离可以用于在加工过程中分离出珠结合的组分。然而，用于所公开的递送载体的珠颗粒不限于特定类型的材料，并且可以由合成材料(如聚苯乙烯或其他塑料)以及生物材料制成。b.病毒组分
[0097]
除了基础颗粒之外，本公开文本的递送载体还可以包含病毒组分，例如附着或缀合至基础颗粒的逆转录病毒或腺病毒。病毒组分相对于递送载体的作用是有助于载体在被单核细胞吞噬后逃离溶酶体的恶劣环境，并且递送编码嵌合受体的核酸或表达构建体以在靶单核细胞表面进行表达。
[0098]
当单核细胞摄取大抗原时，形成吞食抗原的吞噬囊泡(吞噬体)。接下来，单核细胞中含有的特化溶酶体与新形成的吞噬体融合。融合后，被吞噬的抗原暴露于几种高反应性分子以及溶酶体水解酶的浓缩混合物。这些高反应性分子和溶酶体水解酶消化吞噬体的内容物。通过将病毒组分附着于颗粒，病毒内含有的核酸可以逃离溶酶体中的物质的消化并完整地进入单核细胞的细胞质。现有系统未能认识到此特征的重要性，因此获得比本公开文本的表达系统低得多的表达水平。参见falo等人,wo 97/11605(1997)。
[0099]
因此，本公开文本提供了递送载体，其中一种或多种能够在靶细胞(例如，单核细胞)中表达嵌合受体的病毒附着于基础颗粒(例如，ycwp或珠颗粒)的表面。病毒可以是rna病毒，如逆转录病毒；或dna病毒，如腺病毒。在一些实施方案中，病毒可以是重组的和/或非
复制性的和/或非感染性的。本领域技术人员应知道使病毒成为非复制性和/或非感染性的常用方法。
[0100]
在一些实施方案中，病毒本身可能能够破坏溶酶体。可替代地，病毒可能不能破坏溶酶体。在这种情况下，可以添加单独的溶酶体逃避组分。优选的病毒包括腺病毒(例如，ad5)、慢病毒(例如，hiv衍生的病毒)和腺相关病毒(“aav”；例如，aav5、aav9等)。
[0101]
单一基础颗粒可以具有许多附着或缀合至其表面的病毒组分。每种病毒组分可以编码单一嵌合受体或多于一种(例如，2、3、4、5种或更多种)嵌合受体。因此，在一些实施方案中，基础颗粒可以具有多种附着或缀合至其表面的病毒组分，每种病毒组分编码不同的嵌合受体。因此，吞噬这种递送载体的单核细胞将能够在其表面表达多种不同的嵌合受体，例如一种特异性结合ctla-4的嵌合受体和一种特异性结合pd-1或pd-l1的嵌合受体。因此，在一些实施方案中，本公开文本提供了表达1、2、3、4或5种或更多种不同嵌合受体的单核细胞(如肿瘤相关巨噬细胞)，如本文所公开的。
[0102]
因为病毒感染对于编码嵌合受体的核酸或表达载体到达单核细胞的细胞质不是必需的，所以病毒也可以是复制/感染缺陷型的。例如，一种用于产生复制/感染缺陷型腺病毒的方法可以通过改变病毒纤维蛋白来实现。因此，在一些实施方案中，纤维蛋白通过特定突变工程化以允许纤维蛋白与抗体但不与其同源细胞受体结合的病毒可以用于本公开文本的颗粒中。
[0103]
另一种用于产生复制/感染缺陷型病毒的方法是通过有意引起负责感染性的病毒组分变性。例如，在腺病毒的情况下，纤维蛋白可以在病毒制备过程中被破坏。对于hiv，这可以包括包膜(env)蛋白。因此，在一些实施方案中，用于产生用于附着至所公开的珠颗粒的感染缺陷型病毒的方法包括除去病毒的外膜，使得仅保留病毒核心。
[0104]
在一些实施方案中，编码嵌合受体的表达载体稳定地整合到靶细胞染色体中可能是有益的。例如，一种用于实现稳定整合的方式是通过使用腺病毒杂交体。这种腺病毒杂交体可以包含例如携带侧接编码嵌合受体的核酸组分和逆转录病毒整合酶基因的逆转录病毒5
′
和3
′
长末端重复(ltr)序列的腺病毒载体(参见zheng等人nature biotechnology,18:176-180,2000)。
[0105]
在一些实施方案中，瞬时表达可能是优选的，因此例如，可以采用细胞质病毒，如辛德毕斯病毒。
[0106]
在一些实施方案中，在病毒上天然不存在溶酶体逃避组分的情况下，可以添加溶酶体逃避组分。例如，在辛德毕斯病毒或其他此类病毒的情况下，出于逃避溶酶体的目的，病毒可以被工程化以表达全部或部分腺病毒五邻体蛋白。
[0107]
在一些实施方案中，所公开的递送载体可以包含能够逃避或破坏溶酶体的附着于基础颗粒的另外的溶酶体逃避组分。例如，这种溶酶体逃避组分可以包括蛋白质、碳水化合物、脂质、脂肪酸、仿生聚合物、微生物及其组合。应注意，术语“蛋白质”涵盖包含任何数量的氨基酸的聚合分子。因此，本领域普通技术人员应知道“蛋白质”涵盖肽，其通常被理解为“短”蛋白质。在一些实施方案中，溶酶体逃避组分包括但不限于特定病毒蛋白。例如，腺病毒五邻体蛋白是使病毒能够逃避/破坏溶酶体/吞噬体的复合物。因此，完整的腺病毒或分离的五邻体蛋白或其部分(参见例如，bal等人,eur j biochem267:6074-81(2000))可以用作溶酶体逃避组分。在一些实施方案中，衍生自流感病毒血凝素亚基ha-2的n末端序列的融
合肽也可以用作溶酶体逃避组分(wagner等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:7934-7938,1992)。
[0108]
其他溶酶体逃避组分包括但不限于仿生聚合物，如聚(2-丙基丙烯酸)(ppaac)，其已经显示由于含有目的质粒的缀合物的内体释放的增强而增强细胞转染效率(参见lackey等人,abstracts of scientific presentations:the third annual meeting of the american society of gene therapy,文摘号33,2000年5月31日-2000年6月4日,denver,colo)。stayton等人j.control release,1；65(1-2):203-20,2000讨论了本发明设想的其他溶酶体逃避组分的例子。
[0109]
可以使用常规方法将病毒直接附着于基础颗粒，或者间接附着于基础颗粒。参见hammond等人,virology 254:37-49(1999)。例如，可以用高碘酸钠氧化ycwp以产生醛，醛可以进一步与己二酸二酰肼反应以形成adh颗粒。这些adh颗粒可以用spdp(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸琥珀酰亚胺酯)交联剂衍生化并与spds衍生化的亲和素反应以形成与亲和素缀合的ycwp，即亲和素修饰的ycwp。亲和素修饰的ycwp可以直接用于生物素化的病毒颗粒(例如，生物素化的腺病毒)的缀合，或者它们可以用生物素-聚乙烯亚胺(pei)进一步修饰。可以用pei-g-peg-生物素饱和化亲和素修饰的ycwp以形成pei修饰的颗粒，即pei颗粒。腺病毒(和其他阴离子病毒)可以通过pei与病毒外壳的阴离子电荷之间的电荷相互作用由pei颗粒携带。
[0110]
因此，在一些实施方案中，靶核酸可以在重组腺病毒中递送，所述重组腺病毒经由生物素-链霉亲和素键与基础颗粒缀合。可以修饰基础颗粒以连接包含链霉亲和素的接头，并且可以生物素化重组病毒。
[0111]
也可以使用其他方法或机制将病毒组分附着于基础颗粒。例如，抗体附着可以是将所需病毒附着于基础颗粒的类似有效方式。所涵盖的抗体附着的一个例子可以包括化学固定到珠载体颗粒的单一抗体。抗体对待附着于基础颗粒的组分具有特异性。
[0112]
可替代地，可以使用两种或更多种抗体。在这种情况下，附着于基础颗粒的一种抗体可以对第二抗体具有特异性。第二抗体对待附着于基础颗粒的病毒具有特异性。因此，病毒特异性抗体结合病毒，而该抗体又与基础颗粒结合的抗体结合。例如，山羊或兔抗小鼠抗体可以与珠和用于结合特定病毒的小鼠单克隆抗体结合。或者，在另一种替代形式中，两种或更多种抗体可以各自对待附着于颗粒的不同病毒具有特异性，使得颗粒用两种或更多种不同的组分装饰(即，两种不同的病毒颗粒)。
[0113]
在抗体附着的另一个例子中，采用蛋白a或对抗体具有亲和力的任何类似分子。在此例子中，基础颗粒可以用蛋白a包被，蛋白a与抗体结合，并且又与附着于基础颗粒的病毒结合。
[0114]
在一些实施方案中，将病毒附着于基础颗粒还可以通过工程化病毒以在其表面表达某些蛋白质来实现。例如，hiv env蛋白可以用腺病毒五邻体蛋白或其部分替换。然后，重组病毒可以经由抗五邻体抗体附着，其中附着于基础颗粒例如由另一种抗体或蛋白a介导。在一些实施方案中，五邻体蛋白也可以用作溶酶体逃避组分。药物组合物
[0115]
适用于本文所述方法的药物组合物可以包括所公开的递送载体和药学上可接受的载体或稀释剂。
[0116]
组合物可以被配制用于皮内、静脉内、瘤内、皮下、腹膜内、肌内、口服、鼻、肺、眼、阴道或直肠施用。在一些实施方案中，所公开的递送载体被配制用于皮内、静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用，如呈溶液剂、混悬剂、乳剂等。在一些实施方案中，所公开的递送载体被配制用于口服施用，如呈适于口服施用的片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂或液体剂。
[0117]
在一些实施方案中，所公开的递送载体可以被配制用于通过例如皮内、静脉内、肌内或皮下注射的肠胃外施用。注射用配制品可以以单位剂型呈现，例如在安瓿或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂的形式，并且可以含有配制剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。递送载体也可以使用药学上可接受的赋形剂配制。此类赋形剂是本领域熟知的，但是通常将是生理上可耐受的水性溶液。生理上可耐受的溶液是基本上无毒的那些。优选的赋形剂将是惰性的或增强的。
[0118]
在一些实施方案中，递送载体可以被配制成与另一种治疗剂同时施用。在一些实施方案中，递送载体可以被配制成与另一种治疗剂依次施用。例如，递送载体可以在受试者已经接受化疗方案之前或之后施用。治疗方法
[0119]
本文提供了用所公开的递送载体治疗肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖的方法。更具体地，本公开文本提供了通过在单核细胞上表达嵌合受体来刺激免疫系统以产生抗肿瘤或抗癌反应的方法。免疫刺激的机制可以是多方面的，并且可以根据嵌合受体的组分和递送载体的基础颗粒是否同时负载有用于刺激免疫反应的生物材料(如肿瘤裂解物)而变化。免疫反应也可以根据嵌合受体的特异性(即，受体是否特异性结合ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40或本文公开的任何其他靶标)和在给定单核细胞上表达多少不同的嵌合受体而变化，因为所公开的递送载体可以用于在单一单核细胞上表达多种不同的嵌合受体。
[0120]
在一些实施方案中，所公开的递送载体可以向单核细胞(如巨噬细胞或树突细胞)提供编码至少一种嵌合受体的核酸序列和/或表达载体，所述至少一种嵌合受体能够特异性结合至免疫检查点蛋白，如ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40或表1中公开的任何其他靶蛋白。在一些实施方案中，所公开的递送载体可以向单核细胞提供编码1、2、3、4或5种或更多种不同的嵌合受体的1、2、3、4或5种或更多种核酸序列和/或表达载体，所述嵌合受体具有不同的靶特异性和/或不同的细胞内tlr结构域。当这种嵌合受体在单核细胞(如肿瘤相关巨噬细胞(tam))的表面表达时，细胞本身可以通过结合靶蛋白并阻止原本会下调肿瘤免疫反应的信号传导而起检查点抑制剂的作用。
[0121]
例如，ctla-4(也称为cd152(分化簇152))是通过起免疫检查点的作用来下调免疫反应的蛋白质受体。ctla-4在treg上组成性地表达，但是在激活后仅在常规t细胞中上调。当与抗原呈递细胞表面上的cd80或cd86结合时，它充当“关闭”开关。ctla-4与t细胞共刺激蛋白cd28同源，并且这两种分子均与抗原呈递细胞上的cd80和cd86(也分别称为b7-1和b7-2)结合。ctla-4以比cd28更大的亲和力和亲合力结合cd80和cd86，从而使其能够在其配体方面胜过cd28。ctla-4向t细胞传递抑制信号，而cd28传递刺激信号。ctla-4也在调节性t细胞中发现并有助于其抑制功能。通过t细胞受体和cd28激活t细胞导致ctla-4的表达增加。
[0122]
ctla-4作用于t细胞的机制仍有一些争议。生物化学证据表明，ctla-4将磷酸酶募集到t细胞受体(tcr)，从而减弱信号。最近的工作已经表明，ctla-4可以通过从抗原呈递细胞的膜捕获和除去b7-1和b7-2而在体内起作用，从而使得这些无法用于触发cd28。所公开
的嵌合受体在单核细胞、特别是肿瘤床内的单核细胞(如tam)上的表达可以环绕ctla-4，允许cd28信号传导以传播并刺激免疫系统。当然，这仅是一个例子，并且类似的结果可以通过靶向替代的免疫检查点(如pd-1或pd-l1)来实现。
[0123]
因此，本公开文本提供了用于通过工程化肿瘤相关巨噬细胞(tam)以表达能够结合和/或抑制免疫检查点的嵌合受体来激活免疫系统的方法。所公开的受体在肿瘤床内或在肿瘤相邻淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)中的表达可以竞争性地阻断检查点信号传导并引发强烈且具肿瘤特异性的肿瘤内检查点抑制，其导致肿瘤的破坏和疾病的治疗。
[0124]
这种独特的作用机制是对检查点抑制治疗剂的当前状态的显著改进。目前，检查点抑制剂(如派姆单抗(健痊得(keytruda))、纳武单抗(欧狄沃(opdivo))、阿特珠单抗(泰圣奇(tecentriq))和伊匹单抗(易普利姆玛(yervoy)))有效地治疗各种类型的癌症。然而，这些药物是全身性地施用的，因此引起可能威胁生命的脱靶效应。实际上，已知检查点抑制剂引起称为免疫相关不良事件(irae)的一系列独特副作用，其可以包括皮肤、胃肠、肝、内分泌和其他器官系统效应。所公开的递送载体通过仅在肿瘤微环境内或附近表达编码的嵌合受体来防止或最小化这些脱靶效应，从而通过基于细胞的肿瘤靶向减少副作用。
[0125]
在ox40激动剂(例如，ox40l或抗ox40抗体(如9b12、moxr0916、pf-04518600、medi0562、medi6469、medi6383、pf-04518600或bms 986178)的细胞外结构域)用作靶结合结构域的那些实施方案中，嵌合受体将调节t细胞激活和t细胞效应子功能。激动ox40将使效应t细胞能够在延长的时间段内存活并继续增殖，主要通过传递防止过度t细胞死亡的抗凋亡信号。这最终导致更多数量的t细胞在初次免疫反应中存活并发育成记忆t细胞，然后当以后再次遇到抗原时，这些记忆t细胞可以在二次免疫反应中作出反应。此外，临床前研究还已经表明，ox40激动剂可以通过消耗表达高水平ox40的foxp3 调节性t(treg)细胞的数量来发挥另外的抗癌活性。因此，ox40是所公开的嵌合受体结合的特别有吸引力的靶分子。
[0126]
除了上文讨论的检查点抑制作用机制和/或ox40激动剂作用机制之外，所公开的表达嵌合受体的单核细胞还可以通过刺激细胞因子表达来引发免疫激活和抗肿瘤反应。例如，在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包含tlr细胞内信号传导结构域，如tlr4(参考序列np_003257、np_612564或np_612567；uniprot o00206；entrez 7099)或tlr9(参考序列np_059138；uniprot q9nr96；entrez 54106)的细胞内信号传导结构域。嵌合受体与其靶分子(例如，ctla-4、pd-1、pd-l1、ox40等)的结合将激活细胞内结构域，这意味着当使用tlr的细胞内结构域时，靶结合将触发导致促炎性细胞因子反应的信号传导级联。精确的细胞因子反应将取决于所使用的tlr结构域。在一些实施方案中，嵌合受体将被设计为触发m1型细胞因子(如il-12、ifn-α、irn-γ、tnf-α、il-6和/或il-1β)的表达，以便产生攻击性抗肿瘤免疫反应并克服或绕过通常代表肿瘤微环境的免疫抑制和/或免疫逃避信号。这种机制不同于其他基于细胞的治疗方法，如car t细胞，因为肿瘤/癌症不被直接攻击或吞噬，而是通过在肿瘤周围产生和传播具有免疫活性的背景而被破坏。作为这种新型机制的结果，即使当表达嵌合受体的细胞不与肿瘤或肿瘤细胞直接接触时，也可以治疗癌症或肿瘤。例如，表达嵌合受体的细胞在肿瘤相邻淋巴结(如肿瘤引流淋巴结)中的定位将足以激活免疫系统以破坏肿瘤。因此，如本文所公开的，表达检查点特异性嵌合受体的单核细胞可以以至少两种独特的方式提供抗肿瘤益处。
[0127]
此外，当所公开的递送载体包含ycwp作为基础颗粒时，载体可以通过用生物材料(如肿瘤裂解物)负载ycwp而具有进一步的抗肿瘤活性。当递送载体被单核吞噬细胞系统的抗原呈递细胞(apc)样细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或未成熟树突细胞)吸收时，在ycwp内包含生物材料(如肿瘤裂解物)提供了疫苗样功能。在疫苗接种领域，单核吞噬细胞系统的细胞被认为是“专业”抗原呈递细胞，因此是疫苗递送的理想靶标。众所周知，在apc内呈递抗原在产生强细胞免疫反应方面比在任何其他细胞类型内表达此相同抗原要有效得多。因此，用抗原生物材料(如肿瘤裂解物)负载ywcp将导致肿瘤抗原经由i类mhc和ii类mhc分子呈递在抗原呈递细胞上，从而显著增强由所公开的递送载体引发的免疫反应。
[0128]
由于新的巨噬细胞持续渗入肿瘤床中，因此当所公开的递送载体皮内地、皮下地、全身性地(例如，肠胃外地)施用，或者通过将它们直接注射到肿瘤或靶淋巴结(即，肿瘤引流淋巴结，如肿瘤学家将评估转移迹象的淋巴结)中来施用时，它们可以产生这些改进的效果。在一些实施方案中，将所公开的递送载体皮内地注射到靶淋巴结附近的皮肤中，因为这可以导致吞噬单核细胞的最大摄入量。
[0129]
所公开的递送载体对单核细胞(例如，巨噬细胞、树突细胞或tam)具有高度选择性。因此，它可用于涉及选择性地将表达引入单核细胞中的任何应用。在一些实施方案中，施用所公开的载体以治疗癌症，特别是实体瘤。鉴于对推定作用机制的前述解释，认为所公开的递送载体可以用于治疗几乎任何类型的癌症，特别是包含至少一种实体瘤的癌症，所述实体瘤可以包括但不限于乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、肝癌、胰腺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、头颈癌、食道癌和眼黑素瘤。典型的方法包括使单核细胞与递送载体接触，使得其被单核细胞吞噬，随后嵌合受体在细胞表面表达。
[0130]
如上文所述，递送载体可以直接注射到肿瘤中，或者它们可以皮内地、皮下地或全身性地(即，进入受试者的腹膜)施用。在一些实施方案中，递送载体可以靠近肿瘤或肿瘤引流淋巴结皮内地施用。巨噬细胞持续流入实体瘤中，因此即使是全身性地吞噬递送颗粒的巨噬细胞仍可以渗入肿瘤床并起到治疗肿瘤或防止肿瘤生长的作用。此外，在一些实施方案中，嵌合受体的表达可以在低氧诱导的启动子的控制下，在这种情况下，嵌合受体将仅在吞噬递送载体的单核细胞已经渗入肿瘤床时才表达。
[0131]
可替代地或另外地，一旦被巨噬细胞吞噬，递送载体便可以通过在待治疗的肿瘤或癌症附近的淋巴结中表达而起作用。在这些实施方案中，所公开的递送载体可以在靠近最接近的淋巴结(例如，“靶淋巴结”)的区域中皮内地或皮下地施用至被靶向以治疗的肿瘤。在这种意义上，靠近靶淋巴结施用意味着进入靶淋巴结或尽可能靠近靶淋巴结，但是至少比任何其他淋巴结更靠近靶淋巴结。一旦在靶淋巴结中，吞噬递送载体的巨噬细胞便将表达嵌合受体。以这种方式，所公开的递送载体和方法可以用于修饰靶淋巴结的遗传组成，这将有助于激活抗肿瘤免疫反应并将反应定位于肿瘤部位。
[0132]
在一些实施方案中，单核细胞可以在体内或体外与所公开的递送载体接触。因此，本文考虑了体内和离体治疗方法。靶向单核细胞的现有方法主要依赖于分离患者的单核细胞并在体外操作它们，然后将细胞返回给患者。虽然在本公开文本中考虑了此类实施方案，但所公开的递送载体提供了实质性的改进，因为它们可以用于体内和离体方法。此外，改变施用途径可以改变靶向的单核细胞。例如，在静脉内注射的情况下，可以靶向巨噬细胞，并
且在皮下注射的情况下，可以靶向树突细胞，而在肿瘤引流淋巴结附近皮内施用的情况下，可以靶向tam。
[0133]
在一些实施方案中，体内方法包括肠胃外施用递送载体，例如静脉内、肌内、皮下或皮内施用，优选地靠近靶淋巴结。
[0134]
在一些实施方案中，离体方法包括在体外接触单核细胞，然后将接触的细胞施用给有需要的患者。细胞也可以肠胃外施用，例如经由输注施用。在离体方法中与递送载体接触的单核细胞可以是自体的或同种异体的。用于离体方法的单核细胞可以通过已知的白细胞去除术方法从供体或从患者(即，待与所公开的珠载体接触的单核细胞的最终接受者)分离。
[0135]
已知的是，随着肿瘤(原发性肿瘤和转移瘤)的直径生长超过几毫米并变得缺氧，在肿瘤内产生低氧微环境。当此类肿瘤变得缺氧时，它们分泌信号蛋白，如血管生成因子，以增加进入肿瘤低氧区域的血液供应。
[0136]
作为血管生成诱导机制的一部分，低氧肿瘤分泌将单核细胞吸引到肿瘤的信号传导趋化因子蛋白。然后，被吸引到生长肿瘤部位的单核细胞变成巨噬细胞并有助于诱导肿瘤血管生成。因此，肿瘤靶向的有效方法涉及将治疗有效量的编码嵌合受体的递送载体直接或经由与单核细胞离体接触施用给癌症患者。含有被吞噬的递送载体的单核细胞被吸引到肿瘤部位，并且如果在低氧诱导型启动子控制下表达，将在肿瘤微环境中选择性地表达嵌合受体。
[0137]
在一些实施方案中，递送载体的施用将导致肿瘤相关巨噬细胞表达抗检查点嵌合受体。例如，已经吞噬了递送载体的tam将在肿瘤微环境中表达抗ctla-4、抗pd-1和/或抗pd-l1嵌合受体，导致ctla-4和/或pd-1检查点信号传导的抑制。
[0138]
在一些实施方案中，所治疗的肿瘤或癌症包括但不限于神经系统癌症、乳腺癌、胃肠癌(例如，结肠癌)、肾细胞癌(例如，透明细胞肾细胞癌)或泌尿生殖系统癌症(例如，卵巢癌)。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、头颈癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、膀胱癌或血管癌。实际上，所公开的方法提供了治疗肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖的广谱方法，因此待治疗的疾病的类型不受特别限制。
[0139]
可以调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应，如肿瘤消退或缓解)。例如，在一些实施方案中，可以施用递送载体的单次推注，而在一些实施方案中，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据情况指示按比例减少或增加剂量。例如，在一些实施方案中，所公开的递送载体可以通过皮下或皮内注射每周施用一次或两次。在一些实施方案中，所公开的递送载体可以通过皮内注射每月施用一次或两次。在一些实施方案中，所公开的递送载体可以每周施用一次、每隔一周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每隔一个月施用一次、每三个月施用一次、每四个月施用一次、每五个月施用一次或每六个月施用一次。
[0140]
同样地，可以调整剂量以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应，如肿瘤消退或缓解)。例如，在一些实施方案中，所公开的递送载体的剂量可以包含1.0x108至1.0x10
12
个载体。例如，单次剂量可以包含1.0x108、1.5x108、2.0x108、2.5x108、3.0x108、3.5x108、4.0x108、4.5x108、5.0x108、5.5x108、6.0x108、6.5x108、7.0x108、7.5x108、8.0x108、8.5x108、9.0x108、9.5x108、1.0x109、1.5x109、2.0x109、2.5x109、3.0x109、3.5x109、4.0x109、4.5x109、
5.0x109、5.5x109、6.0x109、6.5x109、7.0x109、7.5x109、8.0x109、8.5x109、9.0x109、9.5x109、1.0x10
10
、1.5x10
10
、2.0x10
10
、2.5x10
10
、3.0x10
10
、3.5x10
10
、4.0x10
10
、4.5x10
10
、5.0x10
10
、5.5x10
10
、6.0x10
10
、6.5x10
10
、7.0x10
10
、7.5x10
10
、8.0x10
10
、8.5x10
10
、9.0x10
10
、9.5x10
10
、1.0x10
11
、1.5x10
11
、2.0x10
11
、2.5x10
11
、3.0x10
11
、3.5x10
11
、4.0x10
11
、4.5x10
11
、5.0x10
11
、5.5x10
11
、6.0x10
11
、6.5x10
11
、7.0x10
11
、7.5x10
11
、8.0x10
11
、8.5x10
11
、9.0x10
11
、9.5x10
11
或1.0x10
12
个载体。在一些实施方案中，剂量可以为约9.5x108、约9.75x108、约9.85x108、约9.95x108、约1.0x109、约1.1x109、约1.15x109、约1.2x109、约1.25x109、约1.3x109、约1.35x109、约1.4x109、约1.45x109或约1.5x109个载体。
[0141]
此外，所公开的治疗方法可以另外包括除了所公开的珠载体之外施用第二治疗化合物。例如，在一些实施方案中，另外的治疗化合物可以是car-t细胞、肿瘤靶向抗体、免疫反应增强模式、检查点抑制剂或小分子药物，如btk抑制剂(例如依鲁替尼)、egfr抑制剂(例如ck-101)、bet抑制剂(例如ck-103)、parp抑制剂(例如奥拉帕尼或ck-102)、pi3kδ抑制剂(例如tgr-1202)、braf抑制剂(例如维罗非尼)或本领域已知的其他化疗剂。
[0142]
特定治疗方案可以根据它们是否将改进给定患者的结果来评价，这意味着治疗将降低给定癌症或肿瘤复发的风险或增加其无进展存活的可能性。
[0143]
因此，出于本公开文本的目的，如果获得一种或多种有益或所需的结果，包括期望的临床结果，则治疗受试者。例如，有益或所需的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少由疾病引起的一种或多种症状、提高患有疾病的患者的生活质量、降低治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病进展和/或延长个体的存活。
[0144]
此外，虽然所述方法的受试者通常是癌症患者，但患者的年龄不受限制。所公开的方法可用于治疗在所有年龄组和队列中具有各种复发和预后结果的肿瘤、癌症、恶性疾病或癌细胞增殖。因此，在一些实施方案中，受试者可以是儿童受试者，而在其他实施方案中，受试者可以是成人受试者。
[0145]
给出以下实施例以说明本公开文本。应当理解，本发明不限于这些实施例中描述的特定条件或细节。实施例实施例1-慢病毒的制备
[0146]
在所公开的颗粒的各种实施方案中，附着于基础颗粒的非感染性病毒可以是慢病毒。然而，其他非感染性病毒(如腺病毒和aav)也适于掺入所公开的颗粒中。本实施例详述了一种示例性慢病毒的制备。
[0147]
根据制造商的方案，使用第三代包装混合物(applied biological materials inc.，加拿大列治文)在293ft细胞中将慢病毒载体(示于图4中)包装成慢病毒颗粒。使用puretro慢病毒纯化试剂盒从上清液中纯化慢病毒颗粒，并且使用qpcr慢病毒滴定试剂盒(applied biological materials inc.，加拿大列治文)测定滴度。实施例2-表达细胞系的建立
[0148]
各种细胞系可以用于表达附着于基础颗粒的非感染性病毒(例如，慢病毒)。本实施例详述了示例性表达细胞系的产生。
[0149]
在12孔板中在补充有10％fbs和抗生素的rpmi培养基1640培养基中培养人单核细胞thp-1细胞。在聚凝胺(8μg/ml)存在下，用moi为10的慢病毒颗粒转导thp-1细胞。用嘌呤
霉素(1ug/ml)选择病毒感染的thp-1细胞以建立thp-1表达细胞系。实施例3-所公开的颗粒对ctla的刺激
[0150]
在24孔板中培养表达包含抗ctla4 scfv、cd8跨膜结构域和tlr4细胞内结构域的嵌合受体(核酸序列示于图1中，并且氨基酸序列示于图2中)的thp-1细胞，并且将重组ctla4蛋白以500ng/ml添加到培养物中。在过夜培养后，收集上清液，通过elisa测量促炎性细胞因子，特别是il-12。脂多糖(lps)是tlr的经典刺激物，并且以10ng/ml的浓度用作阳性对照。此实验的结果示于图5中。
[0151]
如图5所指示，添加重组ctla4导致il-12表达的浓度依赖性增加，表明在表达嵌合受体的细胞中存在强烈的免疫激活反应。这些结果表明嵌合受体与其靶标(ctla4)的结合将同样地刺激其他m1型细胞因子(如ifn-α、irn-γ、tnf-α、il-6和/或il-1β)的产生。实施例4-预测性体内研究
[0152]
向c57 b6小鼠注射1x106个b16鼠黑素瘤细胞。在十二(12)天后，小鼠具有可触及的异种移植肿瘤。
[0153]
在注射b16鼠黑素瘤细胞后12天，用两种递送载体中的一种治疗小鼠。对照小鼠接受含有1x107个绿色荧光蛋白(gfp)表达腺病毒作为载体病毒组分的1x106个递送载体的皮内注射。实验组中的小鼠接受含有1x107个腺病毒的1x106个递送载体的皮内注射，所述腺病毒被设计为表达包含抗ctla4 scfv、接头、cd8α链铰链和跨膜结构域以及细胞质tlr4结构域的嵌合受体。
[0154]
在单次剂量治疗后测量各小鼠肿瘤的体积。预期对照组中的所有小鼠在治疗后第28天或之前死亡。预期实验组中接受表达嵌合受体的递送载体的所有小鼠在治疗后第45天后存活，并且预期它们的肿瘤体积减小。*****
[0155]
本领域技术人员容易理解，本公开文本非常适于实现所提及的目的并获得所提及的目标和优点，以及其中固有的那些。本领域技术人员应想到其中的修改和其他用途。这些修改涵盖在本公开文本的精神内并且由权利要求的范围限定，权利要求阐述了本公开文本的非限制性实施方案。