一种用于CP4-EPSPS检测的胶体碳检测方法

一种用于cp4-epsps检测的胶体碳检测方法
技术领域
1.本发明涉及转基因检测领域，具体涉及转基因植物中cp4-epsps的检测方法。


背景技术：

2.随着各种各样的转基因食品大量涌入市场，转基因食品的安全性日益备受关注，世界各国对转基因食品的安全性存在较大的争议。欧盟，日本等地区已制定相关法规对转基因食品进行严格的管理。因此，快速检测转基因作物/植物中转基因蛋白的方法具有重要的意义。自1996年孟山都(monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一来，转基因作物的推广应用经历了18年，抗除草剂性状仍然是转基因植物的首要性状。cp4-epsps被应用于多种作物的转基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。
3.随着各种各样的转基因食品通过贸易大量进入国际市场，转基因食品的安全性受到人们的日益关注，世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议，欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。因此，检测转基因作物/植物中转基因蛋白的定量技术逐渐成为研究热点之一。
4.目前常用的cp4-epsps检测方法包括基于dna的pcr检测方法及基于蛋白质的酶联免疫吸附法。pcr法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确检测，不受样品的处理方法的影响，但易出现假阳性和假阴性等问题，且因经高度处理过的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何dna成分，因此pcr方法无法实现对此类转基因食品的检测。酶联免疫吸附法可对样本进行批量处理，但其耗时较长，需要专业技术人员，且需特殊的仪器，因此该种检测方法不利于在无相关专业技术用户市场的推广和使用。
5.申请人在前期的研究中开发过针对cp4-epsps检测的胶体碳免疫层析技术(参见中国专利申请cn106885907a)；但是，上述专利申请cn106885907a中，对转基因植物检测的灵敏度仅能到1％，限制了其在实际应用时的潜力；本发明基于上述用于cp4-epsps检测的胶体碳免疫层析技术，对相关方案进行了优化，从而提高了检测的灵敏度，提高了技术应用的市场潜力。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种具有高灵敏度的检测转基因植物中cp4-epsps的方法；所述方法包括如下步骤：
7.(1)胶体碳的制备；
8.(2)胶体碳标记抗体的制备；
9.(3)抗体包被至反应膜作为t线及二抗包被至反应膜的c线；
10.(4)胶体碳试纸条的制备；
11.(5)从待测植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；
12.(6)将步骤(4)的试纸条插入蛋白提取液中反应并进行结果观察；
13.其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的抗体为抗cp4-epsps的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如seq id no.1所示，所述单克隆抗体的轻链氨基酸序列如seq id no.2所示。
14.进一步的，所述步骤(2)胶体碳标记抗体的制备的适宜ph为8～10，优选，9.0。
15.在一个实施方式中，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，所述二抗羊抗鼠igg抗体。
16.在一个实施方式中，所述步骤(3)中抗体包被的量为100-400ug/1ml碳。
17.在一个实施方式中，所述步骤(6)反应温度为10℃～30℃、反应时间为3-15分钟。
18.在一个实施方式中，所述胶体碳标记抗体采用如下方法制备：向硼酸缓冲液中加入抗cp4-epsps的单克隆抗体，涡旋振荡混匀，在制得的混合液中加入edc溶液，于室温条件下旋转震荡之后加入胶体碳纳米颗粒，之后加入含bsa的硼酸缓冲液，放置一段时间；离心留取沉淀，硼酸缓冲液反复重悬、离心，洗涤；最终，硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪超声一段时间；即得胶体碳标记的cp4-epsps抗体。
19.在一个实施方式中，所述植物选自大豆、油菜、玉米等植物。
20.本发明采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和硝酸纤维素膜的检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定，它具备操作简便，迅速；通过对抗体的优化筛选，提高了反应灵敏度高。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
22.本发明提供的检测转基因植物中cp4-epsps的方法，包括以下步骤：
23.(1)胶体碳的制备；
24.(2)适合ph值条件下胶体碳标记抗体的制备；
25.(3)抗体包被至反应膜作为t线及二抗包被至反应膜的c线；
26.(4)胶体碳试纸条的制备；
27.(5)从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；
28.(6)将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；
29.(7)适当反应时间后，进行肉眼判断结果。
30.在具体的实施方式中，步骤(2)中，所述抗体为cp4-epsps的单克隆抗体或多克隆抗体，优选为，单克隆抗体；优选的，步骤(2)中ph值为8～10。
31.优选的，步骤(3)中所述抗体为cp4-epsps的单克隆抗体或多克隆抗体。
32.优选的，步骤(3)中抗体包被量为100-300ug/1ml碳。
33.优选的，步骤(3)中所述二抗为抗步骤(1)中胶体碳标记抗体的抗体。
34.优选的，步骤(6)中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。
35.优选的，步骤(7)中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。
36.上述步骤(1)胶体碳的制备方法具体为：
37.向100g碳粉中加入超纯水，定容至500ml，搅拌溶解30分钟后离心(12000g，30分钟)，收集上清于干净的烧杯中；向上述溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化铵(ctab)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的终浓度(质量体积比)为20％，ctab的终浓度(质量体积比)为0.1％；将所得溶液进行超声破碎：超声变幅杆φ6，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟，使之成为悬浮状的胶体碳纳米颗粒溶液；电镜下观察，颗粒直径覆盖范围由数十纳米至数百纳米不等；向上述所得溶液中加入100ml的无水乙醇，充分搅匀后，加入10ml硅烷化试剂，搅拌速度200转/分钟，通入氮气情况下，55℃反应8小时；待反应结束后，用无水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02m pbs(ph7.4)缓冲液洗涤3～5次，至此，制备完成表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒。
38.上述步骤(2)适合ph值条件下胶体碳标记抗体的制备具体方法为：
39.1、胶体碳最适ph值确定
40.向一系列不同ph值梯度的硼酸盐缓冲液中先后加入0.1％纳米碳悬液及0.1％tritonx-100。超声处理(300w,超声6秒停4秒，工作80个循环)上述混合液后，200rpm离心10分钟，收集上清并静置24小时后，观察无沉淀者即为最适ph值，最终选择ph9作为标记抗体最适ph值。
41.2、胶体碳标记抗体的制备
42.向800ul 0.02m硼酸缓冲液(ph9.0，下同)中加入200ul抗cp4-epsps的抗体(1mg/ml)，涡旋振荡混匀。向上述混合液中加入20ul 1.5％(质量体积比)edc溶液，于室温条件下旋转震荡20分钟；向上述混合液中加入200ul胶体碳纳米颗粒，于恒温摇床中300转，25℃放置2小时；向上述混合液中加入100ul含20％bsa的硼酸缓冲液，继续于恒温摇床中300转，25℃放置5小时；于12000g离心20分钟，留取沉淀，0.02m硼酸缓冲液反复重悬-离心，洗涤4次；最终，1ml 0.02m硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪中，超声分散输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟；至此，即得胶体碳标记的cp4-epsps抗体，置于4℃保存备用。
43.上述步骤(3)-(4)胶体碳试纸条的制备方法具体为：
44.1、制备用胶体碳标记的cp4-epsps抗体。
45.2、碳标垫及反应膜的制备：
46.按照1：100比例稀释胶体碳标记的cp4-epsps抗体，喷涂于胶体碳垫上，干燥后备用；按照1：8000比例稀释cp4-epsps抗体(初浓度为1mg/ml)及1：10000比例稀释抗胶体碳标记抗体的抗体(初浓度为1mg/ml)后分别包被于硝酸纤维素膜的t线及c线位置，干燥后备用。
47.3、贴膜及切膜：
48.从左向右依次将样品垫，胶体碳垫，硝酸纤维素膜，吸水滤纸依次贴附于pvc底板上且相互之间依附搭接相连。完成之后将试纸切割成宽3mm的试纸条成品。
49.在申请人之前的专利申请cn106885907a中，cp4-epsps抗体选择了兔抗cp4-epsps多克隆抗体e01，最终其检测灵敏度只有1％；在胶体碳免疫检测过程中，抗体的选择对于检测结果的影响至关重要。在本发明中，申请人尝试了不同的cp4-epsps抗体，包括：中国专利cn104497142b中公开的cp4-epsps单克隆抗体(本技术中将其命名为142)，中国专利
cn103848916b中公开的cp4-epsps单克隆抗体(本技术中将其命名为916)以及中国专利申请cn109929034a中的cp4-epsps单克隆抗体(本技术中将其命名为034)。
50.具体的，在实际操作时，各标记抗体的选择如下：
51.实验组碳标记cp4-epsps抗体二抗1142(鼠源单抗)羊抗鼠2916(鼠源单抗)羊抗鼠3034(鼠源单抗)羊抗鼠
52.上述检测试纸条实际使用时的步骤如下：
53.一、待测样本处理：
54.a)称取待测谷物样品至带有盖子的反应容器中；
55.b)利用搅拌机或其它类似设备将谷物打碎成细颗粒状；
56.c)依据样品总质量加入相应体积的超纯水或去离子水，其中水的体积(毫升)为样品总质量(克)的4～6倍；
57.d)拧紧反应容器的盖子，上下振荡至少30～60秒，确保样品与超纯水或去离子水充分混匀；
58.e)静置至反应容器中固体物质沉降；
59.二、样本检测：
60.a)用吸管吸取反应容器中上清液加入样品杯，直至样品杯中上清液加满至基准线，保证样品杯中的上清液中没有颗粒物；
61.b)静置30～60秒后，将样品杯中的上清液滴入快速检测试纸条的加样区，即可开始测试；
62.三、结果判断：
63.当上清液为阴性(-)时：检测线(t线)不显色；当上清液为阳性( )时：检测线(t线)显黑色、肉眼可见；当未出现质控线(c线)，可能操作不当或试纸已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸重新测试。
64.优选的，步骤一c)中加入的超纯水或去离子水为样品总质量的5倍。
65.优选的，步骤一d)中振荡时间为30秒。
66.优选的，步骤二a)进
×
行之前，将反应器中混合液于离心机(日立离心机，cf16rxii)中1000rpm离心5分钟。
67.优选的，步骤二b)中静置时间为30秒。
68.本发明cp4-epsps快速检测试纸条的性能评价：
69.将本发明所述cp4-epsps快速检测试纸条分别检测含有不同量的rrs抗草甘膦转基因大豆(100％、5％、1％、0.5％、0.1％)及非转基因大豆；采用不同的单抗的检测结果如下表所示：
70.转基因含量100％5％1％0.5％0.1％0实验组1
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实验组2
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实验组3 -71.如上表所示，并不是采用任意的单克隆抗体都能提高胶体碳试纸条的检测效率，
实验组1与申请人之前采用的多抗e01效果相当。另外，实验组2采用的单抗916与实验组1相比，检测灵敏度有所提高，但是，比较实验组1的单抗142和实验组2的单抗916，可以发现，尽管142的亲和常数要高于916，但其用在胶体碳试纸条检测时，并没有明显的关联性。实验组3的检测灵敏度最高，检测限可达0.1％，其采用的是单抗034，该单克隆抗体的重链氨基酸序列如seq id no.1所示，其轻链氨基酸序列如seq id no.2所示。
72.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。