一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪

1.本发明属于高分子流变性能的测量装置设计及测量方法技术领域，具体涉及一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪。


背景技术：

2.合成高分子是世界一千年来改变人类生活与面貌的重大发明之一。虽然通用高分子制品的生产能力较强、数量巨大，但是目前高端高分子制品的质量和性能不能满足国防、航天、医疗、信息、能源等重要领域的需求。高分子流变学是研究高分子材料成型加工的基础。通过加工、使分子层面上链取向、链间缠结重整化、最优化，可以提高材料的宏观力学性能。建立高分子熔体或溶液宏观形变(或流动)、物性参数(如应力，应变、粘度和模量)和微观结构三者的本构关系可以为基于分子层面的流变模型的材料设计、模具和设备的构建、及加工工艺条件的优化提供理论基础。大量的国防与民用高分子材料与受限高分子流体动力学相关，如：飞机、高铁、舰船上高分子与金属、金属与金属间的轻量化、超强、超韧黏结。为了开展受限条件下超快速大形变条件下缠结高分子流体动力学的基础研究，实现该时空条件下分子链的原位分析至关重要，而研发出相应的观测仪器，是实现这一目标的基础。
3.经典高分子流变仪(例如毛细管流变仪、扭矩式流变仪和动态旋转式流变仪等)的测试原理都是基于应力-应变响应，结合流变学的经典模型和理论，来研究典型高分子加工技术中的流变学问题。这种研究策略不能直接获得流变过程中的高分子构象，且忽视了流体流速空间的非连续性分布问题。因此，目前的经典流变仪设备难以从分子层面解析高分子非线性流变行为的物理机制，且微观分子层面作用机制与相应宏观力学信号的对应关系也不明晰。光学流变仪的出现使得观测高分子微观流动行为成为可能。光学流变仪将光学显微镜与流变仪联用极大地拓展了流变仪研究流体微观结构与宏观力学响应关系的能力，使得人们真正能从介观尺度研究流体内颗粒分布和颗粒动力学行为。如：美国akron大学的王十庆教授对流变仪进行了改造，发明了粒子示踪测速仪(particletracking velocimetry,ptv)。该仪器可通过在体系中加入少量直径10μm的镀银玻璃微粒，借助激光打在玻璃球上产生散射，然后采用ccd跟踪镀银微粒在流变仪中的运动，来表征高分子溶液或熔体的运动。这突破了传统流变仪只能测量力学响应的限制。王十庆课题组利用粒子示踪测速仪技术研究发现，高分子体系在剪切应力下流场分布表现出剪切非均匀性，包括剪切过程中的剪切断层和剪切停止后的非静态松弛。这项流变仪和光学显微镜联用技术为高分子流变学科发展带来了新思想。最近，奥地利安东帕(anton-paar)公司已经实现了光学显微镜和旋转流变仪联用系统的商业化，其核心思想与王十庆教授搭建的“粒子示踪测速仪”类似。光学显微镜和旋转流变仪的联用极大地拓展了流变仪研究流体微观结构与宏观力学响应关系的能力，使得人们真正能从介观尺度研究流体内颗粒分布和颗粒动力学行为。然而，一方面，传统的光学显微镜通常只研究远离光源或者远离物体的光场分布，在原理上它存在远场衍射极限(瑞利衍射极限)，限制了成像分辨率。因此，即使是最先进的光学流变仪，其空间分辨率仅为700nm，从而不能直接观测高分子的构象信息；另一方面，由于镀
银微粒与高分子链尺度相差很大，颗粒是否影响高分子链的运动还存在争议。除此之外，现有的光散射，x-光散射、中子散射和固体核磁共振等实验技术只能表征高分子链的静态结构，很难描述其动力学演化行为；现有的光学流变学设备可以很好地在线测量材料的宏观和介观流变性质，但是很难同时原位获取高分子链的微观动态结构信息。
4.荧光共振能量转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当给体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即荧光能量共振转移(fret)现象，使得给体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。荧光共振能量转移可以描述电子激发能在适当的荧光给体基团和受体基团间的传递。由于fret效率随给、受体间距离变化非常敏感，因此，可直观、方便、灵敏地实时表征大分子内部结构和分子间相互作用(如图1所示)。根据其fret数据图可以得到分子的均方末端距，其精度可达10nm以内，这使得对高分子流体进行分子水平的原位检测成为可能。但是fret现象的发生必须同时存在分子给体和受体，若在表征过程中，由于合成缺陷，分子两端只存在分子给体或受体，或两端同时存在给体或受体，则会得到不准甚至错误的结果。因此，如何将fret现象应用到高分子构象检测仍是急需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪，该观测仪利用fret现象通过耦合远场显微镜和特定的分子标记，观测在高分子流动过程中的构象演化。
6.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
7.本发明提供一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪，包括：耦合流变仪模块、样品池模块、单分子荧光共振能量转移(smfret)模块和软件终端模块；所述软件终端模块的一端与所述单分子荧光共振能量转移(smfret)模块、耦合流变仪模块连接，所述软件终端模块的另一端与所述耦合流变仪模块的另一端连接；所述样品池模块的一端与耦合流变仪模块连接，另一端与单分子荧光共振能量转移(smfret)模块连接；
8.所述耦合流变仪模块包括旋转流变仪、旋转马达2和力学传感器；所述旋转马达2和力学传感器构成机械测力装置部分实现转动过程中力学测量，所述旋转流变仪用于施加流场于样品池模块，三者配合使用使所述耦合流变仪模块实现施加流场于样品、提供流变性能测试和力学测量的功能；
9.所述样品池模块包括光学玻璃和流变夹具动力板；所述流变夹具动力板和光学玻璃共同构成了所述旋转流变仪的夹取部分，用于实现承载样品的功能；
10.所述单分子荧光共振能量转移(smfret)模块包括激光耦合平台、显微镜主体和ccd相机，实现smfret测试用于高分子构象信息的检测；其中：所述激光耦合平台采用多波长光纤耦合激光系统，输出的激光照射到样品上；所述显微镜主体包括具有双通路分光光路的远场光学显微镜和三维电动位移平台；所述三维电动位移平台用于控制所述样品池模块中光学玻璃相对于显微镜物镜的位置使其用于识别样品池不同区域内荧光分子对的荧光信号；所述ccd相机用于荧光信号的采集；
11.所述软件终端模块包括嵌入式控制卡、控制软件和数据分析算法软件；通过在计
算机控制界面发出指令传输到嵌入式控制卡，控制所述激光耦合平台的调制、滤镜选择，具有双通路分光光路的远场光学显微镜与旋转流变仪的共定位、旋转流变仪应力应变控制、ccd相机荧光信号采集、存储、计算和处理功能；最后，分别将力学传感器采集到的流变结果与ccd相机采集到的荧光结果上传到计算机，所述数据分析算法软件对耦合流变仪的应力应变信号进行计算，对荧光共振能量转移信号进行自定义分析，通过计算荧光给体寿命衰减或荧光给体、受体光强相对变化规律计算相对距离，并得到探针分子的均方末端距以及其在不同条件下的演变规律，最终获得高分子流动过程中力学信号以及高分子链的构象及其时空演化信息。
12.在上述技术方案中，所述高分子流变构象观测仪适用的目标对象为两端分别标记能产生荧光共振能量转移现象的荧光给体和受体的探针高分子。
13.在上述技术方案中，所述旋转流变仪根据显微镜设计为可伸缩型流变仪。
14.在上述技术方案中，所述流变夹具动力板为平板型或锥板型。
15.在上述技术方案中，所述激光耦合平台可耦合2-10种激光发射器，该激光器组可以同时进行输出也可以利用嵌入式控制卡，根据总控命令控制所选定的激光器进行输出。
16.在上述技术方案中，双通路分光光路用于分别接收荧光分子对中给体和受体的荧光信号，当样品产生的荧光信号经过物镜被汇聚后，经过二向色镜，分别被不同的ccd相机记录。
17.在上述技术方案中，所述三维电动位移平台采用三相步进电机的低振动、低噪音的精密电控平移台，主体材料采用经过特殊工艺制备的优质合金铝，通过精密磨削加工技术制得。
18.在上述技术方案中，使用mathematica软件作为辅助的数据分析软件，对fret信号进行用户自定义的数据分析。
19.在上述技术方案中，所述嵌入式控制卡和控制软件为可用计算机语言编制，可对旋转流变仪的部分或所有部件进行控制。
20.在上述技术方案中，所述控制软件以c 为工作语言，整合多种操作程序，对耦合流变仪模块、样品池模块和单分子荧光共振能量转移(smfret)模块进行精准调控，包括激光功率控制、激光切换光路控制、具有双通路分光光路的远场光学显微镜控制、单光子计数器开关和滤镜转换进行控制。
21.本发明的有益效果是：
22.本发明的基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪具有以下的有益效果：
23.(1)可在高分子流体流动过程中直接获得纳米尺度的分子链构象信息；
24.(2)在获得高分子构象信息的同时可获得宏观流变学信号，例如应力、应变、粘度和模量等；
25.(3)实时定位系统得以高精度解析高分子流场内构象分布；
26.(4)运用嵌入式控制卡并编写控制程序，实现整机的一体化控制。
附图说明
27.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
28.图1为fret效率值随给体、受体间距离变化关系图。
29.图2为本发明提供的一种高分子流变构象观测仪的机械结构部分示意图。
30.图3为本发明提供的一种高分子流变构象观测仪配套的平板型流变夹具动力板示意图；
31.图4为本发明提供的一种高分子流变构象观测仪配套的锥板型流变夹具动力板示意图；
32.图5为本发明提供的一种高分子流变构象观测仪配套的用于提供couette拖曳剪切流的流变夹具动力板示意图；
33.图6为本发明提供的一种高分子流变构象观测仪的功能模块结构图。
34.图2-5中的附图标记表示为：
35.1-水平位置调节和固定单元，2-旋转马达，3-流变夹具动力板，4-光学玻璃，5-显微镜主体，6-固定台，7-带有位置调节轨道的水平支撑梁，8-带有位置调节轨道的支撑柱，9-高度调节和固定单元和10-流变仪底座。
具体实施方式
36.本发明的发明思想为：现有光学流变仪可研究流体微观流动行为与宏观力学响应关系的能力，使得人们真正能从介观尺度研究流体内颗粒分布和颗粒动力学行为。但是，光学显微镜由于存在远场衍射极限(瑞利衍射极限)，成像分辨率较低。fret现象可被用来观测高分子的均方末端距，但是由于错误标记产生的错误信号会导致fret现象产生的信号被误读或错读，导致结果不准或错误。因此，需要设计一种直观、准确、灵敏地方法利用fret现象获取高分子在流动过程中的构象信息。本发明为了解决现有技术中的技术问题提供了一种高分子流变构象观测仪，利用fret现象通过耦合远场显微镜和特定的分子标记，观测在高分子流动过程中的构象演化。
37.本发明的技术原理为：荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当给体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即fret现象，使得给体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。本发明利用远场显微镜，使得单个荧光分子对可以被检测。
38.本发明通过将单分子荧光共振能量转移(smfret)技术搭建在具有双通路收光光路的远场显微镜上，提出一种基于单分子荧光共振能量转移技术的高分子流变构象观测仪。该观测仪搭建后可检测宏观流变力学信号，同时实时检测流变过程中的体系的微观形貌，以及探针高分子的均方末端距等信息。
39.本发明提供一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪，按模块功能分包括：耦合流变仪模块、样品池模块、单分子荧光共振能量转移(smfret)模块和软件终端模块；所述软件终端模块的一端与所述单分子荧光共振能量转移(smfret)模块、耦合流变仪模块连接，所述软件终端模块的另一端与所述耦合流变仪模块的另一端连接；所述样品池模块的一端与耦合流变仪模块连接，另一端与单分子荧光共振能量转移(smfret)模块连接；如图6所示。各模块具体描述如下：
40.1、耦合流变仪模块：该模块主要包括旋转流变仪、旋转马达2和力学传感器；上述旋转流变仪根据显微镜设计为可伸缩型流变仪用于施加流场于样品池模块，搭配由旋转马
达2和力学传感器构成的机械测力装置部分、可实现转动过程中力学测量。该模块主要用于施加流场于样品池模块、提供流变性能测试和力学测量等功能。
41.2、样品池模块：该模块主要包括光学玻璃4和流变夹具动力板3；其中具有动力的流变夹具动力板3和光学玻璃4共同构成了旋转流变仪的夹取部分。该模块主要用于实现承载样品的功能。所述流变夹具动力板3为平板型或锥板型。
42.3、单分子荧光共振能量转移(smfret)模块：主要包括激光耦合平台、显微镜主体5和ccd相机，实现smfret测试用于高分子构象信息的检测。其中激光耦合平台采用多波长光纤耦合激光系统，可耦合2-10种激光发射器，该激光器组可以同时进行输出也可以利用嵌入式控制卡，根据总控命令控制所选定的激光器进行输出，输出的激光照射到样品上。显微镜主体5为远场光学显微镜，显微镜需具有双通路分光光路，搭配三维电动位移平台。所述三维电动位移平台采用三相步进电机的低振动、低噪音的精密电控平移台，主体材料采用经过特殊工艺制备的优质合金铝，通过精密磨削加工技术，用于控制所述样品池模块中光学玻璃4相对于显微镜物镜的位置使其用于识别样品池不同区域内荧光分子对的荧光信号。ccd相机用于荧光信号的采集。双通路分光光路用于分别接收荧光分子对中给体和受体的荧光信号，当样品产生的荧光信号经过物镜被汇聚后，经过二向色镜，分别被不同的ccd相机记录。
43.4、软件终端模块：包括嵌入式控制卡、控制软件和数据分析算法软件；所述嵌入式控制卡和控制软件为可用计算机语言编制，可对旋转流变仪的部分或所有部件进行控制。所述控制软件以c 为工作语言，整合多种操作程序，对上述三个模块进行精准调控，包括激光功率控制、激光切换光路控制、具有双通路分光光路的远场光学显微镜控制、单光子计数器开关和滤镜转换进行控制。具体的通过在计算机控制界面发出指令传输到嵌入式控制卡，控制所述激光耦合平台的调制、滤镜选择，具有双通路分光光路的远场光学显微镜与旋转流变仪的共定位、旋转流变仪应力应变控制、ccd相机荧光信号采集、存储、计算和处理功能；最后，分别将力学传感器采集到的流变结果与ccd相机采集到的荧光结果上传到计算机，所述数据分析算法软件对耦合流变仪的应力应变信号进行计算，对荧光共振能量转移信号进行自定义分析，通过计算荧光给体寿命衰减或荧光给体、受体光强相对变化规律计算相对距离，并得到探针分子的均方末端距以及其在不同条件下的演变规律，最终获得高分子流动过程中力学信号以及高分子链的构象及其时空演化信息。同时，我们根据smfret实验的特点，使用mathematica软件作为辅助的数据分析软件，对fret信号进行用户自定义的数据分析。
44.其中：本发明的高分子流变构象观测仪的机械装置部分的一种具体实施方式如图2所示，包括：水平位置调节和固定单元1，旋转马达2，流变夹具动力板3，光学玻璃4，显微镜主体5，固定台6，带有位置调节轨道的水平支撑梁7，带有位置调节轨道的支撑柱8，高度调节和固定单元9和流变仪底座10；其中流变夹具动力板3与光学玻璃4共同组成旋转流变仪的夹具部分，并且显微镜主体5包括具有双通路分光光路的的远场荧光显微镜，内部应涵盖激光器，分光系统，光子计数器等部分。
45.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
46.实施例一：
47.结合图6具体说明本发明提供的一种基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪，通过系统协调控制软件模块来实现仪器的控制、数据采集与存储的同步、数据上传到数据采集软件并进行处理等工作，包括：耦合流变仪模块、样品池模块、单分子荧光共振能量转移(smfret)模块和软件终端模块；所述软件终端模块的一端与所述单分子荧光共振能量转移(smfret)模块、耦合流变仪模块连接，所述软件终端模块的另一端与所述耦合流变仪模块的另一端连接；所述样品池模块的一端与耦合流变仪模块连接，另一端与单分子荧光共振能量转移(smfret)模块连接；
48.所述耦合流变仪模块包括旋转流变仪、旋转马达2和力学传感器；所述旋转马达2和力学传感器构成机械测力装置部分实现转动过程中力学测量，所述旋转流变仪根据显微镜设计为可伸缩型流变仪、用于施加流场于样品池模块，三者配合使用使所述耦合流变仪模块实现施加流场于样品、提供流变性能测试和力学测量的功能；
49.所述样品池模块包括光学玻璃4和流变夹具动力板3；所述流变夹具动力板3和光学玻璃4共同构成了所述旋转流变仪的夹取部分，用于实现承载样品的功能；
50.所述单分子荧光共振能量转移(smfret)模块包括激光耦合平台、显微镜主体5和ccd相机，实现smfret测试用于高分子构象信息的检测；其中：所述激光耦合平台采用多波长光纤耦合激光系统，具有易于集成、操作简便等特点。整个激光光源单元将两个皮秒激光器光束合成一路高稳定光束进行输出；球面镜准直器与光纤之间距离可调，从而补偿焦距变化，准直某一特定波长在特定距离下的光束。激光器矩阵输出单元波长分别为488纳米和/或514纳米和/或640纳米；该激光器组可以同时进行输出也可以利用嵌入式控制卡，根据总控命令控制所选定的激光器进行输出。同时对每一路光束都可以独立控制开关调制时间。高精度光斑自适应位置调整单元主要是由高精度快速振镜完成。因此可以实现不同激光对于同一位置的交替激发，输出的激光照射到样品上；所述显微镜主体5包括具有双通路分光光路的经典的远场光学显微镜和三维电动位移平台；搭建双通路分光光路用于识别荧光分子对中不同荧光分子的荧光信号。当荧光经过物镜被汇聚后，根据波长不同分为两路荧光，分别被不同的单光子计数器记录，然后根据寿命的衰减和强度用于计算fret效率值和高分子的构象。所述三维电动位移平台采用三相步进电机的低振动、低噪音的精密电控平移台，主体材料采用经过特殊工艺制备的优质合金铝，通过精密磨削加工技术制得，保证每100mm行程范围内直线度小于10μm、平直度小于15μm，每一步的最小行程为100纳米，样品池模块中光学玻璃4相对于显微镜物镜的位置使其用于识别样品池不同区域内荧光分子对的荧光信号；所述ccd相机用于荧光信号的采集；
51.所述软件终端模块包括嵌入式控制卡、控制软件和数据分析算法软件；所述嵌入式控制卡和控制软件为可用计算机语言编制，可对旋转流变仪的部分或所有部件进行控制；所述控制软件以c 为工作语言，整合多种操作程序，对耦合流变仪模块、样品池模块和单分子荧光共振能量转移(smfret)模块进行精准调控，包括激光功率控制、激光切换光路控制、具有双通路分光光路的远场光学显微镜控制、单光子计数器开关和滤镜转换进行控制。具体的通过在计算机控制界面发出指令传输到嵌入式控制卡，控制所述激光耦合平台的调制、滤镜选择，具有双通路分光光路的远场光学显微镜与旋转流变仪的共定位、旋转流变仪应力应变控制、ccd相机荧光信号采集、存储、计算和处理功能；最后，分别将力学传感器采集到的流变结果与ccd相机采集到的荧光上传到计算机，所述数据分析算法软件对耦
合流变仪的应力应变信号进行计算，对荧光共振能量转移信号进行自定义分析，通过计算荧光给体寿命衰减或荧光给体、受体光强相对变化规律计算相对距离，并得到探针分子的均方末端距以及其在不同条件下的演变规律，最终获得高分子流动过程中力学信号以及高分子链的构象及其时空演化信息。
52.实施例二：
53.本发明的高分子流变构象观测仪的机械装置部分的一种具体实施方式如图2所示(图中未全部表示出各个模块的所有部分，如软件控制部分等)，包括：水平位置调节和固定单元1，旋转马达2，流变夹具动力板3，光学玻璃4，显微镜主体5，固定台6，带有位置调节轨道的水平支撑梁7，带有位置调节轨道的支撑柱8，高度调节和固定单元9和流变仪底座10；其中流变夹具动力板3与光学玻璃4共同组成旋转流变仪的夹具部分，并且显微镜主体5为具有双通路分光光路的荧光显微镜，内部应涵盖激光器，分光系统，光子计数器等部分。所述高分子流变构象观测仪，可主要分成流变仪和显微镜两个机械装置主体的耦合，其中流变仪机械装置包含组成部件水平位置调节和固定单元1，旋转马达2，流变夹具动力板3，带有位置调节轨道的水平支撑梁7，带有位置调节轨道的支撑柱8，高度调节和固定单元9和流变仪底座10，显微镜装置包含组成部件光学玻璃4，显微镜主体5和固定台6。具体连接关系为，所述流变仪底座10固定在实验平台，起到固定位置和防止振动的作用。所述带有位置调节轨道的支撑柱8固定在流变仪底座10上，提供带有位置调节轨道的水平支撑梁7上下运动的滑轨，并在带有位置调节轨道的水平支撑梁7达到调控的目标高度后起到支撑作用。所述高度调节和固定单元9连接在带有位置调节轨道的水平支撑梁7上，监控带有位置调节轨道的水平支撑梁7在带有位置调节轨道的支撑柱8上的运动，在确定带有位置调节轨道的水平支撑梁7达到目标高度且保持稳定后，固定位置。所述水平位置调节和固定单元1与带有位置调节轨道的水平支撑梁7连接，用于调控旋转马达2的水平位置，在确定旋转马达2达到目标位置且保持稳定后，固定位置。所述流变夹具动力板3连接在旋转马达2上，根据需要设计为可拆卸的夹具便于适用不同的几何结构。所述显微镜主体5固定在固定台6上，其位置需保证物镜能够与夹具动力板中心轴在同一垂直法线上，即夹具动力板中心在物镜的正上方的位置。所述光学玻璃4放置在显微镜主体5三维电动位移平台上，与流变夹具动力板3组成样品池模块，用于实现承载样品的功能；
54.测试初始，首先将待测样品置于光学玻璃4上，通过显微镜主体5上的三维电动位移平台，移动调整光学玻璃4的位置，便于物镜观测待测样品；调整过程中，可以通过图6单分子荧光共振能量转移(smfret)模块中的激光耦合平台输出一个波长的激光照射到样品上激发高分子链一端连接的染料分子，基于ccd相机采集到的荧光信号，判定位置是否适宜。基于调整好的光学玻璃4的位置，设定水平位置调节和固定单元1的水平移动距离，定位到流变夹具板3的中心轴与物镜在同一垂直法线上，达到目标位置且固定水平位置；再设定高度调节和固定单元9的进距，进距大小由流变夹具板3下表面与光学玻璃4上表面间的目标距离决定，进距方式可设置为自动和或手动，为防止在下降临近待测样品时引起对待测样品引起扰动，提供多个进距速度档位，达到目标高度且固定。
55.以上机械装置组件达到目标位置且固定后，开始施加流场于样品，由软件终端模块中控制软件设置流变参数，如旋转速度、旋转扭矩、旋转时长等，输入到旋转流变仪中的控制卡，控制旋转马达2的旋转，带动流变夹具板3的旋转施加流场于样品，这个过程中，通
过嵌入的力学传感器检测施加流场后，样品的应力-应变响应信号，检测到的响应信号回传给数据分析软件分析后作出流变曲线，根据流变性能初始测试判定施加流场是否达到稳定；待施加流场稳定后，荧光共振能量转移(smfret)模块开始工作，由软件终端模块中控制软件设置激光光路参数，包括激发波长、激光功率、单光子计数器开关频率及滤镜选择。激发光由激光耦合平台输出照射到由流变夹具动力板3和光学玻璃4承载的样品上，探针高分子一端的荧光给体吸收激光能量后，发射出荧光光子，或经过物镜汇聚，或发生fret现象被临近的高分子另一端的荧光受体吸收，发射出更长波长的荧光。这样体系会发射出两种波长的荧光，在通过物镜被汇聚后，经过smfret模块中双通路分光光路识别后，根据波长不同分为两路，分别被不同的单光子计数器记录，然后根据寿命的衰减和强度用于计算fret效率值和高分子的构象。
56.实施例三：
57.本实施例和实施例二的区别在于：区别1，根据目前旋转流变仪不同几何构造夹具适应测试范围不同，可选择平板(图3)、锥板(图4)。例如，具有倒锥结构的锥板测试适宜特别少量的样品测试，具有极好的温度控制，剪切速率恒定，且不需预设流变学模型，但却不适合多相体系测试，也不适宜用来进行温度扫描实验。平板的夹具适宜测量聚合物共混物和多相聚合物体系，且板间距离易调节，能够在更高的剪切速率下使用，但可能造成末端效应影响。所以可根据测试样品需求选择适宜的夹具。此外，根据引入流动的方式也可由机械测力装置选择两种模式，应力控制型施加一定力矩测量产生旋转速度和应变控制型驱动夹具测量产生的力矩。区别2，目前测试使用流变仪主要是旋转流变仪，产生与夹具中心轴距离有关的剪切力或剪切速率，而对于施加流场的分类，最易理论解析的是couette拖曳剪切流，即通过平行地移动流变夹具动力板3施加剪切流场(图5)，产生只与纵向位置有关的剪切力或剪切速率。这里我们可以利用可运动的机械臂，光学校正其水平位置与光学玻璃4保持平行，由机械测力装置施加恒定力或恒定速度使其左右移动，从而施加简单的couette剪切流。
58.综上所述，本发明的基于远场显微镜的高分子流变构象观测仪运用能量转移随荧光给体和受体距离衰减的物理特性，可精准测量高分子在流动、形变过程中的构象信息，结合力学传感器，可在高分子流动、形变过程中同时检测高分子的构象和流变学信号例如应力、应变、粘度和模量等。
59.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。