免疫激活剂、抗原和抗体在制备预防、治疗肿瘤产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及癌症研究领域，具体涉及一种免疫激活剂、抗原和抗体在制备预防、治疗肿瘤产品中的应用。


背景技术：

2.据报道(doi:10.1038/nature14426)，b16-melanoma同源性肿瘤模型中存在m30的新抗原能够激活小鼠免疫反应杀伤肿瘤。
3.恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是由异常黑色素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤,恶性程度极高,占皮肤肿瘤死亡病例的极大部分。多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜,也见于软脑膜和脉络膜。它是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤,也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一,年增长率为3％-5％。一直以来,手术、放疗和化疗是治疗黑色素瘤的主要方式,但是这些方式也存在许多不足,如创伤、副作用较大和患者耐受性低等。伴随着当代肿瘤免疫学的不断进步,针对恶性黑色素瘤的免疫疗法已成为目前的研究的焦点。随着肿瘤生物学以及免疫学知识的发展,肿瘤免疫治疗引起了人们的强烈关注。由于肿瘤疫苗的细胞差别小免疫原性低、主要依赖细胞免疫、复杂的微环境等问题使得肿瘤疫苗的使用收到了诸多限制。多肽疫苗作为免疫疗法的一种,制备简单,储存方便,使用安全,成为免疫疗法治疗肿瘤的热点,近年来得到了广泛的应用,能够针对复杂的非连续天然抗原决定簇构建相应的合成抗原多肽。


技术实现要素：

4.本发明解决的技术问题是如何治疗肿瘤。
5.本发明提供如下任一所述应用：
6.1)免疫激活剂和/或抗原在制备预防、治疗或辅助治疗肿瘤产品中的应用；
7.2)免疫激活剂和/或抗体在制备预防、治疗或辅助治疗肿瘤产品中的应用；
8.3)免疫激活剂和/或抗原在制备抑制肿瘤细胞增殖或生长的产品中的应用；
9.4)免疫激活剂和/或抗体在制备抑制肿瘤细胞增殖或生长的产品中的应用；
10.所述免疫激活剂为cpg寡核苷酸；所述抗原为m30 mrna；所述抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体为pd1；
11.所述m30 mrna是由序列如seq id no.2所示的dna体外转录得到的；
12.所述cpg寡核苷酸为如下1)或2)
13.1)seq id no.1所示的寡核苷酸；
14.2)seq id no.1所示的寡核苷酸经化学修饰后得到的寡核苷酸。
15.可选的，所述化学修饰为寡核苷酸中的一个或者一个以上的磷酸二酯键替换为硫代磷酸二酯键。
16.可选的，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或结直肠癌；所述肿瘤细胞为黑色素瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞或结直肠癌细胞。
17.可选的，所述黑色素瘤细胞为b16黑色素瘤细胞。
18.可选的，cpg核酸的给药方式为皮下注射或瘤内注射；cpg核酸给药时间为2-4天一次；优选为3天一次或每周2次；所述cpg核酸的给药剂量为1mg/kg/次-2.5mg/kg/次；优选为2mg/kg/次-2.5mg/kg/次。
19.pd1的给药方式为静脉注射；pd1的给药时间为2-4天一次；优选为3天一次；所述pd1的给药剂量为6mg/kg/次-10mg/kg/次；优选为8mg/kg/次
20.m30的给药方式为静脉注射；m30的给药时间为2-4次/周；优选为m30的给药时间为2次/周；m30的给药剂量为0.5mg/kg/次-1.5mg/kg/次；优选为0.8mg/kg/次。
21.如下任一所述药物组合物
22.1)一种预防、治疗或辅助治疗肿瘤的药物组合物，包括免疫激活剂和抗原；
23.2)一种预防、治疗或辅助治疗肿瘤药物组合物，包括免疫激活剂和抗体；
24.所述免疫激活剂为cpg寡核苷酸；所述抗原为m30 mrna；所述抗体为单克隆抗体，所述单克隆抗体为pd1；所述m30 mrna是由序列如seq id no.2所示的dna体外转录得到的；
25.所述cpg寡核苷酸为如下1)或2)
26.1)seq id no.1所示的寡核苷酸；
27.2)seq id no.1所示的寡核苷酸经化学修饰后得到的寡核苷酸。
28.本发明的技术方案具有以下优点：
29.1、cpg2018b、pd1及cpg2018b和pd1联合用药能够抑制肿瘤的体积增大；cpg2018b和pd1联合用药效果最好。
30.2、m30 mrna、cpg2018b及m30 mrna和cpg2018b联合用药能够抑制肿瘤的体积增大，且抑制瘤重增加；m30 mrna和cpg2018b联合用药效果最好。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为实施例1动物瘤体体积增长曲线；
33.图2为实施例1各组瘤体图片；图中对照组指的是nc组，2018b指的是单独给cpg-2018；2018b pd1指的是cpg-2018和pd1联合给药；
34.图3为实施例2动物瘤体图片；cpg指的是单独给cpg-2018；mrna指的是单独给药m30 mrna；combo指的是cpg-2018和m30 mrna联合给药；
35.图4为实施例2动物瘤体体积增长曲线；cpg指的是单独给cpg-2018；mrna指的是单独给药m30 mrna；combo指的是cpg-2018和m30 mrna联合给药；
36.图5为实施例2各组瘤重柱状图；m30 mrna cpg指的是m30 mrna和cpg-2018联合给药。
具体实施方式
37.cpg2018b为苏州吉玛基因股份有限公司合成，是一段短链核苷酸序列，其具体序
列为：tcgtcgtttgacgtttcgtttg，所有碱基之间的磷酸二酯键均为硫代磷酸磷酸二酯键。
38.m30 mrna是由如下dna序列通过体外转录方法得到，所述体外转录方法为本领域常规技术方法，dna序列为：taatacgactcactatagggaaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagaccccggcgccgccaccatggactgggagaatgtaagtccagaacttaattctacagatcaaccctaataggctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtaccccctccataaagtaggaaacactacagtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa；
39.信达生物生产的pd-1单抗达伯舒(信迪利单抗注射液)，以下简称pd1。
40.实施例1 cpg核酸和/或pd1抑制肿瘤细胞生长
41.1.1实验材料及试剂
42.pd1人源化小鼠30只(雌雄各15只)，周龄：6-8周；
43.电子天平；
44.移液枪、超净工作台和1ml注射器；
45.标记剪、眼科手术剪、眼科手术镊、游标卡尺和相机；
46.酒精棉球、干棉球、组织培养瓶、封口膜、ep管；
47.b16细胞。
48.1.2动物饲养的步骤
49.1.动物身份鉴定方法
50.每个鼠笼均佩挂有实验编号、实验组别、实验人员姓名、小鼠品种和性别等信息的身份卡片，小鼠用打耳洞法标记。
51.2.环境及适应性
52.动物房环境温度22
±
3℃，相对湿度40-70％，12小时光照/12小时黑暗周期循环。动物每笼5只，垫料为高压灭菌玉米芯垫料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)，笼具每周更换1次。
53.3.食物和水
54.饲料购自江苏协同生物。实验动物用水采用二级反渗透过滤灭菌水。
55.4.动物禁食
56.实验动物必须健康并适应环境，不限制进食和饮水。
57.1.3肿瘤模型的建立及给药
58.1.b16细胞在培养皿中培养至90％融合时，常规胰酶消化，pbs洗2次，制成单细胞悬液。
59.2.1000rpm离心3min，吸弃上清，加入无fbs的dmem完全培养基。血球计数板计数，将细胞稀释至5
×
107细胞/ml，得到单细胞重悬液。(冰盒保存，1h内接种到细胞)。
60.3.试验第1天，用一次性注射器将单细胞重悬液注入实验动物肩胛骨皮下，每只鼠皮下接种0.1ml单细胞重悬液。
61.接种一周后有小包块形成，测量瘤块的长径(a)和短径(b)，肿瘤体积(tumor volume，tv)计算公式为：tv＝1/2ab2，10天后即第11天，瘤体大小达到实验指标，随机分成4组，给药，具体分组如下：
62.表1
[0063][0064][0065]
注：iv：静脉注射；sc:皮下注射；g 1组中的pbs代表pbs缓冲液；g2组中的20μl为cpg2018b溶解于pbs缓冲液，得到20μl药物溶液；g3组中的100μl为pd-1用pbs缓冲液稀释，得到100μl药物溶液；g4组中的20μl为cpg2018b溶解于pbs缓冲液，得到20μl药物溶液，100μl为pd-1用pbs缓冲液稀释，得到100μl药物溶液。g4组中sc iv为：cpg2018b给药方式为sc，pd1给药方式为iv。
[0066]
4.给药期间测量动物体重及瘤块的长径(a)和短径(b)，两天一次观察动物状态，死亡率等，具体测量时间及给药时间见表2。
[0067]
5.实验完成后，处死实验动物并取出瘤体，将瘤体按编号摆好，用游标卡尺测量肿瘤瘤体长径及短径，称重、记录并拍各组成瘤组织带标尺图片。
[0068]
6.瘤体一分为二，一部分福尔马林溶液固定，另一部分-80℃冻存。
[0069]
2实验概况
[0070]
2.1实验流程
[0071]
1)第1天：细胞接种
[0072]
2)第11天：选择合适瘤体，开始正式实验(称为day 0)。如表1所示分4组，5只/组，共20只雌性小鼠。
[0073]
3)第19天(day 8)：结实验，取瘤，测量瘤重、拍照，组织保存。
[0074]
表2.实验操作统计表
[0075][0076][0077]
实验过程中，第三次给药时，个别瘤体破溃，对照组有一只动物死亡，结实验当天(第19天)，所有实验组各有一只死亡。
[0078]
3实验结果
[0079]
3.1结实验图片见附图2，从图2中可以看出：给药3次后，pd1组、2018b组、2018b pd1组的瘤的体积均小于nc组各组小鼠瘤体从大到小的顺序为nc组》2018b组》pd1组》pd1 2018b组。
[0080]
3.3测量各组瘤体体积数据，以第一次注射后的日期为横坐标，以每只小鼠的瘤体体积为横坐标制作曲线图，见图1。从图1中可以看出2018b和pd1联合用药组要好于单独用药。
[0081]
4实验总结
[0082]
本实施例中，以nc组作为对照组，所有实验组，隔三天给药一次，持续给药3次时，均对小鼠b16肿瘤模型有显著的抑制作用，其中2018b pd1组效果最好。
[0083]
实施例2 cpg核酸和/或m30抑制肿瘤细胞生长
[0084]
1实验材料及方法
[0085]
1.1细胞培养
[0086]
b16细胞，常规培养使用含10％fbs(genial)的dmem培养基中，37℃5％co2饱和湿度培养箱中培养。
[0087]
1.2动物实验
[0088]
实验材料及试剂
[0089]
c57小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司合格证编号:11400700381451)30只，周龄：6-8周。
[0090]
b16细胞
[0091]
10％中性福尔马林
[0092]
其他实验材料和试剂见实施例1。
[0093]
1.3动物饲养(见实施例1)
[0094]
1.4肿瘤模型的建立及给药
[0095]
1、b16细胞在培养皿中培养至90％融合时，常规胰酶消化，pbs洗2次，制成单细胞悬液。
[0096]
2、1000rpm离心3min，吸弃上清，加入无fbs的dmem完全培养基。血球计数板计数，将细胞稀释至5
×
107细胞/ml，得到单细胞重悬液(冰盒保存，1h内接种到细胞)。
[0097]
3、试验第1天，用一次性注射器将单细胞重悬液注入实验动物肩胛骨皮下，每只鼠皮下接种0.1ml单细胞重悬液。
[0098]
接种一周后有小包块形成，测量瘤块的长径(a)和短径(b)，肿瘤体积(tumor volume，tv)计算公式为：tv＝1/2ab2，10天后即第11天，瘤体大小达到实验指标，随机分成4组，每组5只，给药，具体分组如下：
[0099]
具体给药方式、剂量及频次如下：
[0100]
a组：cpg-2018，2.5mg/kg/次,day 0,3,5，7,9，it；
[0101]
b组：m30mrna，0.8mg/kg/次，day 0,3,5，7,9,iv；
[0102]
c组：cpg-2018联合m30 mrna；m30mrna0.8 mg/kg/次，cpg-20182.5mg/kg/次；给药时间均为day 0,3,5，7,9；m30 mrna：iv；cpg：it
[0103]
d组：negative control(pbs),it；
[0104]
注：iv：静脉注射；it瘤内注射；cpg-2018每只小鼠注射体积与实施例1相同，即将
cpg-2018溶解于20μlpbs缓冲液，进行注射；m30mrna每只小鼠注射体积为20μl，即将m30mrna溶解于20μlpbs缓冲液，进行注射。
[0105]
2实验流程
[0106]
1)第1天：细胞接种
[0107]
2)第11天：选择合适瘤体，开始正式实验(称为day 0)；分4组，5只/组，共20只小鼠。
[0108]
3)第22天(day 11)：处死并取出瘤体，将瘤体按编号摆好，用游标卡尺测量肿瘤瘤体长径及横径，称重、记录并拍各组成瘤组织带标尺图片。
[0109]
瘤体一分为二，一部分福尔马林溶液固定，另一部分-80℃冻存。
[0110]
表3.实验操作统计表
[0111][0112][0113]
实验过程中，第五次给药时，个别瘤体破溃，对照组有一只动物死亡，第21天m30 mrna和cpg2018b组各有一只动物死亡。
[0114]
3实验结果
[0115]
3.1结实验图片见附图3，从图3中可以看出：给药5次后，mrna单独给药组、cpg2018b单独给药组都能抑制肿瘤的体积；而m30 mrna和cpg2018b联合用药组效果要好于单独用药组。
[0116]
3.3测量各组瘤体体积数据，以日期为横坐标，以各组小鼠的瘤体体积的平均值为纵坐标制作曲线图，见图4。从图4中可以看出m30 mrna和cpg2018b的联合用药组效果最佳。
[0117]
3.5瘤重数据，测量各组瘤重数据，结果表明体重数据nc组》m30 mrna组》cpg2018b组》m30 mrna cpg2018b组(见图5)，实验组与对照组相比，p《0.01。
[0118]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。