一种伏立康唑中N-溴代丁二酰亚胺的检验方法与流程

一种伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检验方法
技术领域
1.本发明涉及医药分析技术领域，具体涉及一种伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检验方法。


背景技术：

2.伏立康唑2002年在美国首次上市，是对氟康唑进一步结构修饰的产物，属于第三代三唑类抗真菌药，具有抗菌谱广、生物利用度高、安全且组织分布广，可通过血脑屏障等特点，临床用量逐年增加，其对念珠菌、隐球菌、曲霉菌等均具有较好抗菌活性，并且对临床上难以治疗的烟曲霉菌感染具有较好疗效，对曲霉菌疗效与两性霉素b相当，是指南中治疗肺曲霉病的首选，也是中性粒细胞减少伴发热患者的经验性治疗药物。伏立康唑在人体内主要经由cyp2c19酶代谢，由于cyp2c19基因具有多态性，其作用机制是通过竞争性抑制真菌14-α
–
固醇去甲基酶，使细胞膜重要组成成分麦角甾醇（由羊毛固醇转化）的生物合成受阻，影响细胞膜的流动性、通透性和细胞膜上许多酶的活性，而发挥抗真菌作用。
3.n-溴代丁二酰亚胺是伏立康唑合成工艺中所使用的物料，可能会残留在伏立康唑成品中，为控制其在成品中的含量，研发人员对伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检测进行方法研究；本发明首次提出了伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检验方法，该方法是使用lc-ms检测而实现的，同时为了验证此方法的有效性和可行性，参考ich q2指导原则对此方法进行验证。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一种伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检验方法，该方法简便、高效、准确，能够在不影响检测结果的前提下，缩短检测时间，达到更高的效率，并参考ich q2指导原则对此方法进行验证，可以用于伏立康唑原料药的质量控制。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检验方法，包括以下步骤：（1）配制溶液，分别配制空白溶液、对照品储备液、对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液；所述空白溶液为稀释液1和稀释液2；所述对照品储备液和对照品溶液中包括n-溴代丁二酰亚胺、稀释液1和稀释液2；所述灵敏度溶液中包括n-溴代丁二酰亚胺、稀释液1和稀释液2；所述供试品溶液中包括伏立康唑、稀释液1和稀释液2；（2）测定方法：分别将空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；进样量：20μl；柱温：30℃；流速：0.4ml/min；洗脱剂为流动相a-流动相b体系；流动相a为10mm乙酸铵溶液（含0.1%冰醋酸）；流动相b为：乙腈；流动相a与流动相b的梯度表如下：
离子源参数如下：进一步地，所述空白溶液的配制步骤为：空白溶液即为稀释液1和稀释液2，所述稀释液1为乙腈：丙酮=1:1（v/v，体积比），所述稀释液2为水；所述对照品储备液的配制步骤为：取n-溴代丁二酰亚胺对照品，精密称定，置于容量瓶中，加稀释液1溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液，置于容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀即得对照品储备液；所述对照品溶液的配制步骤为：精密量取对照品储备液，置于容量瓶中，加稀释液1稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液，置于容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液；所述灵敏度溶液的配制步骤为：精密量取对照品溶液，置于容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得灵敏度溶液；所述供试品溶液的配制步骤为：取供试品，精密称定，置于容量瓶中，加稀释液1超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液，置于容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀，使样品析出，用滤膜过滤即得供试品溶液；所述冰醋酸、乙酸铵为ar及以上；所述乙腈、超纯水和丙酮为hplc；所述n-溴代丁二酰亚胺对照品为外购；所述色谱柱可为thermo acclaim
tm 120 c18 120
åꢀ
4.6
×
150mm，5
µ
m，或效能相当的色
谱柱。
6.所述n-溴代丁二酰亚胺含量的测定方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：
有益效果由以上技术方案可知，本发明所述的检测方法对伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的色谱峰分离度高、具有较高的系统适用性，同时在专属性、精密度、定量限、检测限、准确度、线性和范围和耐用性都符合标准。为确认伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的残留量，本发明利用方便快捷的液相色谱-质谱联用法，并为证明此方法的有效性和可行性，对本方法进行了验证。对伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检测，可用于监测伏立康唑原料药及制剂的质量。本发明首次提出了使用气相色谱-质谱联用法对伏立康唑中n-溴代丁二酰亚胺的检测，具有准确度高、精密度高、重现性好、稳定性好、专属性强等特点，同时本发明的测定方法耗时短，操作简单，成本低等优点。
附图说明
7.图1为实施例2、3、4、5中空白溶液的液相色谱图；图2为实施例2、5中灵敏度溶液的液相色谱图；图3为实施例2、3、4中对照品溶液的液相色谱图；图4为实施例3中供试品溶液的液相色谱图；图5为实施例3中选择性溶液的液相色谱图；图6为实施例4中供试品溶液（加标）的液相色谱图；图7为实施例5中loq溶液的液相色谱图；图8为实施例5中lod溶液的液相色谱图；图9为n-溴代丁二酰亚胺线性关系。
具体实施例
8.实施例1(1)实验材料与仪器条件实验材料：乙腈，生产厂家：merck；冰醋酸，生产厂家：广东光华科技股份有限公司；乙酸铵，生产厂家：sigma-aldrich；丙酮，生产厂家：西陇科学股份有限公司；n-溴代丁二酰亚胺，生产厂家：上海麦克林生化科技有限公司；伏立康唑，生产厂家：珠海润都制药股份有限公司；水，生产厂家：watsons。
9.仪器：液相色谱质谱联用仪：agilent infinity 1290 uhplc agilent 6470qqq-ms；电子分析天平:xse205du、me204e；色谱柱：acclaim
tm 120 c18 120a 4.6
×
150mm，5
µ
m。
10.分别将空白溶液、灵敏度溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；进样量：20μl；柱温：30℃；流速：0.4ml/min；洗脱剂为流动相a-流动相b体系；流动相a为10mm乙酸铵溶液（含0.1%冰醋酸）；流动相b为：乙腈；流动相a与流动相b的梯度表如下：
离子源参数如下：（2）实验步骤
①
空白溶液的制备：取20ml容量瓶，加入8ml稀释液1，加稀释液2稀释至刻度摇匀即得空白溶液；
②
对照品储备液的制备：取n-溴代丁二酰亚胺对照品约21mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加稀释液1溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液250μl，置100ml容量瓶中，加稀释液1稀释至刻度，摇匀即得对照品储备液（浓度：2.625μg/ml）；
③
对照品溶液（n-溴代丁二酰亚胺定位溶液）的制备：精密量取对照品储备液1.0ml，置5ml容量瓶中，加稀释液1稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液4.0ml，置10ml容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液（浓度：210ng/ml）；
④
灵敏度溶液的制备：精密量取对照品溶液5.0ml，置10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得灵敏度溶液（浓度：105ng/ml）；
⑤
供试品溶液（伏立康唑定位溶液）的制备：取供试品约1.4g，精密称定，置5ml容量瓶中，加稀释液1超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液4.0ml，置10ml容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀，使样品析出，用0.22μm滤膜过滤即得供试品溶液（浓度：112mg/ml）；
⑥
选择性溶液的制备：取供试品约1.4g，精密称定，置5ml容量瓶中，精密量取对照品储备液1.0ml，置该容量瓶中，加稀释液1超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液
4.0ml，置10ml容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀，使样品析出，用0.22μm滤膜过滤即得选择性溶液（浓度：伏立康唑112mg/ml、n-溴代丁二酰亚胺210ng/ml）；
⑦
供试品溶液（加标）的制备：取供试品约1.4g，精密称定，置5ml容量瓶中，精密量取对照品储备液1.0ml，置该容量瓶中，加稀释液1超声溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液4.0ml，置10ml容量瓶中，加稀释液2稀释至刻度，摇匀，使样品析出，用0.22μm滤膜过滤即得供试品溶液（加标）（浓度：伏立康唑112mg/ml、n-溴代丁二酰亚胺210ng/ml）；
⑧
loq溶液的制备：根据灵敏度溶液所得的n-溴代丁二酰亚胺的s/n值，调节稀释比例至n-溴代丁二酰亚胺的s/n值不小于10。同法配制6份。
11.⑨
lod溶液的制备：精密量取loq溶液3.0ml，置10ml容量瓶中，加空白溶液稀释至刻度，摇匀即得lod溶液。
12.待系统稳定后，进空白溶液1针，灵敏度溶液1针、对照品溶液6针、并记录色谱图。
13.实施例2本发明所述检测方法系统适用性试验系统适用性是通过测定灵敏度溶液中n-溴代丁二酰亚胺的s/n值及6针对照品溶液中n-溴代丁二酰亚胺峰面积的rsd而实现的。要求灵敏度溶液中n-溴代丁二酰亚胺的s/n值应≥10；6针对照品溶液中n-溴代丁二酰亚胺峰面积的rsd应不大于10.0%。为确认序列运行过程中的系统适用性，在验证过程中每隔约8小时及序列的最后，进1针对照品溶液，要求后连续6针对照品溶液中n-溴代丁二酰亚胺峰面积的rsd应不大于10.0%；如超出该范围，应做评估调查。
14.如实施例1所述配制空白溶液、灵敏度溶液和对照品溶液，在实施例1所述色谱条件下，进空白溶液1针，灵敏度溶液1针、对照品溶液6针，得到色谱图，如图1、图2和图3，根据公式换算结果如下表所示：
实施例3 本发明所述检测方法专属性试验方法的专属性是通过测定空白溶液对检测无干扰；选择性溶液中n-溴代丁二酰亚胺与相邻峰之间的分离度而实现的，要求空白溶液对检测应无干扰，选择性溶液中n-溴代丁二酰亚胺与相邻峰之间的分离度应不小于1.5。
15.如实施例1所述配制空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液，在实施例1所述色谱条件下，进空白溶液1针，对照品溶液1针、供试品溶液1针、选择性溶液1针，得到色谱图，如图1、图3、图4和图5，根据公式换算结果如下表所示：
实施例4 本发明所述检测方法的精密度试验重复性是通过测试6份供试品溶液（加标）测定结果的rsd而实现的，要求6份供试品溶液（加标）中n-溴代丁二酰亚胺测定结果的rsd应不大于10.0%。
16.如实施例1所述配制空白溶液、对照品溶液、供试品溶液（加标），待系统平衡后，进空白溶液1针、对照品溶液6针、空白溶液1针、6供试品溶液（加标）各1针，记录色谱图，如图1、图3和图6，得出专属性检测结果如下：实施例5 本发明所述检测方法的定量限和检测限定量限和检测限是通过检测响应信号与噪声之比而实现的，定量限的信噪比（s/n）应不小于10：1，检测限的信噪比（s/n）应不小于3：1；在定量限浓度水平下，重复考察6份定量限溶液，要求6份loq溶液中n-溴代丁二酰亚胺单位浓度峰面积的rsd应不大于20.0%；loqn-溴代丁二酰亚胺应不大于0.9ppm，s/n≥10；lod溶液中n-溴代丁二酰亚胺的s/n≥3，且lod＜loq。
17.如实施例1所述配制空白溶液、灵敏度溶液、loq溶液和lod溶液。待系统平衡后，进空白溶液1针、灵敏度溶液1针，6份loq溶液各1针、lod溶液1针，记录色谱图，如图1、图2、图7和图8。得到结果如下表所示：
实施例6 本发明所述检测方法的准确度准确度是通过被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率及回收率的总rsd（n=9）而实现的，要求加入loq浓度、100%限度浓度、150%限度浓度的准确度溶液中，n-溴代丁二酰亚胺的回收率应在70.0%～130.0%之间，回收率的总rsd（n=9）应不大于20.0%。
18.实施例7 本发明所述检测方法的溶液稳定性考察对照品溶液、供试品溶液和选择性溶液在室温下放置一段时间后进样，检测结果随时间变化的规律，为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供参考。
19.要求：与0hr对照品溶液相比较，对照品溶液在室温考察期间，n-溴代丁二酰亚胺的回收率在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则对照品溶液在室温考察期间稳定；若供试品溶液0hr有检出n-溴代丁二酰亚胺，供试品溶液在室温下放置一段时间内，测定结果变化值在n-溴代丁二酰亚胺限度的20%以内，且无明显的变化趋势，则供试品溶液在室温考察期间稳定；若供试品溶液0hr未检出n-溴代丁二酰亚胺，供试品溶液在室温下放置一段时间内，仍无n-溴代丁二酰亚胺检出，则供试品溶液在室温考察期间稳定；选择性溶液在室温下放置一段时间内，n-溴代丁二酰亚胺的回收率在80.0%～120.0%之间，且无明显的变化趋势，则选择性溶液在室温考察期间稳定。