一种氟比洛芬及其杂质的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，涉及一种氟比洛芬及其杂质的检测方法，具体涉及一种氟比洛芬及其杂质的高效液相色谱检测方法。


背景技术：

2.氟比洛芬，又名氟联苯丙酸、氟布洛芬、风平片。氟比洛芬是一种优秀的非甾体消炎镇痛药，主要用于治疗类风湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎、外伤疼痛和其他疼痛。
3.氟比洛芬的化学名称为(
±
)-2-(2-氟-4-联苯基)-丙酸，化学式为c
15h13
fo2，结构式如下：
[0004][0005]
在氟比洛芬的合成中，杂质可能来源于起始物料和反应中间产物，起始物料是2-氟苯胺，中间体为4-溴-2-氟苯胺、4-溴-2-氟联苯、4-溴-2-氟乙酰苯胺，它们均是致基因突变杂质。目前，已公开的氟比洛芬有关物质的分析方法包括：进口注册标准(标准号：jx20130017)与《欧洲药典9.0版》中此品种项下控制的杂质为2-(4-联苯基)-丙酸、顺式-2-(2-氟-4-联苯基)-2,3-二甲基丁二酸、2-(2-氟-4-联苯基)-2-羟基丙酸、4-乙酰基-2-氟联苯、2-氟联苯基-4-羧酸；《中国药典2015年版二部》控制杂质2-(4-联苯基)-丙酸；《美国药典40版》控制杂质2-(4-联苯基)-丙酸。但上述已公开的杂质分析方法均未对潜在致基因突变杂质2-氟苯胺、4-溴-2-氟乙酰苯胺、4-溴-2-氟苯胺、4-溴-2-氟联苯进行控制，这些杂质可能是造成氟比洛芬副作用的原因，因此提供一种能够检测致基因突变杂质2-氟苯胺、4-溴-2-氟乙酰苯胺、4-溴-2-氟苯胺和4-溴2氟联苯的方法成为一个亟待解决的问题。对这些杂质进行检测可以使杂质控制在非致突变性的可接受水平，提高了该药物的安全性。因此，对该药物的致基因突变杂质的分析检测具有重大的实际意义。
[0006]
氟比洛芬的致基因突变杂质的结构如下：
[0007]
1)2-氟苯胺
[0008][0009]
2)4-溴-2-氟乙酰苯胺
[0010][0011]
3)4-溴-2-氟苯胺
[0012][0013]
4)4-溴-2-氟联苯
[0014][0015]
以上杂质与氟比洛芬在结构上非常相似，但是从极性角度考虑，部分杂质与氟比洛芬存在着较大的极性差异，因此在同一色谱柱上达到各组分的完全有效分离是非常困难的。为此，需要寻找一种既要求相似结构的化合物的有效分离，又兼顾不同极性物质能够被有效检出的色谱条件。


技术实现要素：

[0016]
鉴于此，本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱法分离和测定氟比洛芬及其相关致基因突变杂质的方法。本发明的方法可以有效地将氟比洛芬及其相关致基因突变杂质分开，且具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。
[0017]
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
[0018]
一种氟比洛芬及其杂质的高效液相色谱检测方法，其中所述高效液相色谱的条件包括：采用5氟苯基键合硅胶色谱柱，采用冰乙酸水缓冲液与有机溶剂的混合溶液作为流动相a、相同的有机溶剂作为流动相b进行梯度洗脱；其中，所述洗脱梯度设置如下：
[0019]
时间(分钟)流动相a的体积比流动相b的体积比050-1000-501550-1000-503530-7030-705030-7030-70
[0020]
优选地，所述洗脱梯度设置如下：
[0021]
时间(分钟)流动相a的体积比流动相b的体积比095515955355050505050
[0022]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述杂质可以选自2-氟苯胺(杂质a)、4-溴-2-氟乙酰苯胺(杂质b)、4-溴-2-氟苯胺(杂质c)和4-溴-2-氟联苯(杂质d)中的一种或多种。所述杂质具体结构式如下所示：
[0023][0024][0025]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述有机溶剂可以选自乙腈、乙醇、四氢呋喃和甲醇中的一种或多种；优选地，所述有机溶剂为乙腈。
[0026]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述冰乙酸水缓冲液中的冰乙酸的体积分数可以为1％～11％；优选地，所述冰乙酸水缓冲液中冰乙酸的体积分数为3％～8％；更优选地，所述冰乙酸水缓冲液中冰乙酸的体积分数为5％。
[0027]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述流动相a中冰乙酸水缓冲液与有机溶剂的体积比为95～50：5～50；优选地，所述流动相a中冰乙酸水缓冲液与有机溶剂的体积比为80～60：20～40；更优选地，所述流动相a中冰乙酸水缓冲液与有机溶剂的体积比为70：30。
[0028]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述梯度洗脱的流速可以为0.5～1.5ml/min，优选为1.0ml/min。
[0029]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述5氟苯基键合硅胶色谱柱的填料颗粒粒径可以为3～6μm，优选为5μm。
[0030]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述高效液相色谱的柱温可以为25℃～40℃，优选为35℃。
[0031]
根据本发明的高效液相色谱检测方法，所述高效液相色谱的检测器检测波长可以为240～260nm，优选为254nm。
[0032]
根据本发明的一个具体实施方案，所述高效液相色谱检测方法包括以下步骤：
[0033]
(1)取氟比洛芬供试样品溶解于稀释剂，制得供试品溶液；
[0034]
(2)取4种杂质2-氟苯胺、4-溴-2-氟乙酰苯胺、4-溴-2-氟苯胺和4-溴-2-氟联苯对照品溶解于稀释剂，制成对照品溶液；
[0035]
(3)分别取所述供试品溶液和对照品溶液，按照上述高效液相色谱的条件进行检测。
[0036]
优选地，上述高效液相色谱检测方法还包括：根据高效液相色谱图，确定氟比洛芬及其杂质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试品溶液中4种杂质的含量；更优选地，按
照如下公式计算供试品溶液中4种杂质的含量：
[0037][0038]at
：供试品溶液中杂质的峰面积；w
t
：供试品溶液的浓度(mg/ml)；as：对照品溶液中杂质的峰面积；ws：对照品溶液的浓度(mg/ml)。
[0039]
杂质a、杂质b、杂质c和杂质d的线性关系如下表所示：
[0040]
名称浓度范围(μg/ml)回归方程相关系数(r)杂质a0.01996～2.235y＝2.8863x 0.52070.9991杂质b0.01966～2.387y＝19.7940x 0.62470.9992杂质c0.02136～2.392y＝11.2585x-0.91750.9999杂质d0.1066～2.388y＝35.6721x 1.00300.9998
[0041]
在上述高效液相色谱检测方法中，优选地，所述稀释剂为乙腈、乙醇和甲醇中的一种或多种，优选为乙腈。
[0042]
氟比洛芬的分析研究及质量控制对保证该药品的质量至关重要。本发明的方法可以有效地将氟比洛芬及其相关致基因突变杂质分开，且具有很高的灵敏度及分离度，重复性及耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。运用本发明的方法进行分离和检测，杂质a、杂质b、杂质c和杂质d组分之间的分离度均＞2.0，各组分与氟比洛芬峰的分离度均＞2.0。
[0043]
具体地，本发明的有益效果在于：
[0044]
1)本发明提供了一种以hplc法分离测定氟比洛芬及其相关致基因突变杂质的方法，可以有效地将氟比洛芬及其相关致基因突变杂质分开，且具有很高的灵敏度和分离度，重复性和耐用性好，操作简单，结果稳定可靠。
[0045]
2)本发明对氟比洛芬的杂质的分析研究直接促进产品的质量控制，所以该方法对于实现有效的氟比洛芬的有效质量控制具有极其重要的意义。
附图说明
[0046]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0047]
图1为实施例1的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
[0048]
图2为实施例2的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
[0049]
图3为实施例3的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
[0050]
图4为实施例4的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
[0051]
图5为对比实施例1的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
[0052]
图6为对比实施例2的混合溶液hplc色谱图；其中，1-杂质a，2-杂质b，3-杂质c，4-氟比洛芬，5-杂质d。
具体实施方式
[0053]
以下将对本发明的实施例进行详细描述，所举实施例仅是为了更好地对本发明的技术内容进行说明。但不应将此理解为本发明的内容仅限于所举实施例，凡基于本发明的上述内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0054]
实施例1
[0055]
1.色谱条件：
[0056]
色谱柱：5氟苯基键合硅胶柱；规格4.6
×
250mm，5μm，流动相a：5％体积分数的冰乙酸水缓冲液和乙腈的混合溶液(体积比为70：30)，流动相b：乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下：
[0057]
表1洗脱梯度的设置
[0058]
时间(min)流动相a的体积比流动相b的体积比09551595535505050505050.195565955
[0059]
流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测波长：254nm，进样体积：10μl。
[0060]
2.方法与结果
[0061]
2.1溶液配制
[0062]
取杂质a、杂质b、杂质c和杂质d适量，用乙腈溶解并稀释制成每1ml约含每种杂质各2μg的溶液，即得对照品溶液。
[0063]
2.2专属性
[0064]
称取氟比洛芬400mg，置100ml量瓶中备用；称取杂质a 10mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用乙腈溶解，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。稀释制成混合溶液，精密量取10μl，注入液相色谱仪中，记录色谱图，混合溶液的结果见图1。混合溶液中的氟比洛芬峰与各杂质峰完全分离，其分离度为60.321，保留时间为22.142min(图1)。
[0065]
2.3系统适用性
[0066]
取对照品溶液，精密量取10μl，注入液相色谱仪中，连续进样6次，记录色谱图，计算各杂质峰面积及保留时间相对标准偏差(rsd)，结果见表2～表5。
[0067]
表2杂质a溶液系统适用性测定结果
[0068]
次数保留时间(min)峰面积理论塔板数13.59135.2611188423.59235.2391186433.59235.2601187543.59235.2691182853.59335.2541184763.59235.26511901
平均值3.59235.25811866rsd％0.020.200.2
[0069]
杂质a的理论塔板数为11866，大于5000；峰面积的rsd为0.20％，小于2.0％。
[0070]
表3杂质b溶液系统适用性测定结果
[0071]
次数保留时间(min)峰面积理论塔板数16.02134.3611134626.02134.1601134936.02134.3511134646.02234.2851133656.02234.2861134866.02234.28711366平均值6.02234.28811348rsd％0.010.210.09
[0072]
杂质b的理论塔板数为11348，大于5000；峰面积的rsd为0.21％，小于2.0％。
[0073]
表4杂质溶液c系统适用性测定结果
[0074][0075][0076]
杂质c的理论塔板数为16309，大于5000；峰面积的rsd为0.29％，小于2.0％。
[0077]
表5杂质d系统适用性溶液测定结果
[0078]
次数保留时间(min)峰面积理论塔板数133.49762.707440147233.49461.794442847333.49562.208443411433.49461.730442470
533.49361.615444762633.48061.507448612平均值33.49261.760443708rsd％0.020.720.64
[0079]
杂质d的理论塔板数为443708，大于5000；峰面积的rsd为0.72％，小于2.0％。
[0080]
2.4精密度
[0081]
取氟比洛芬约200mg，精密称定，共6份。分别置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液与对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。按外标法以峰面积计算6份供试品溶液中总杂质含量及rsd。含量计算公式如下：
[0082][0083]at
：供试品溶液中杂质的峰面积；w
t
：供试品溶液的浓度(mg/ml)；as：对照品溶液中杂质的峰面积；ws：对照品溶液的浓度(mg/ml)。
[0084]
6份供试品的总杂分别为0.025％、0.025％、0.025％、0.026％、0.025％、0.025％，rsd为小于2％，符合高效液相色谱法对有关物质检查的要求。
[0085]
2.5线性和范围
[0086]
取杂质a、杂质b、杂质c和杂质d对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成1ml中约含各杂质为80μg的线性混合贮备液，分别移取贮备液0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml置于50ml量瓶。记录峰面积a，以浓度c为横坐标，a为纵坐标，建立标准曲线。得线性方程(见表6)，各杂质在线性范围内具有良好的线性关系。
[0087]
表6线性测定结果
[0088]
名称浓度范围(μg/ml)回归方程相关系数(r)杂质a0.01996～2.235y＝2.8863x 0.52070.9991杂质b0.01966～2.387y＝19.7940x 0.62470.9992杂质c0.02136～2.392y＝11.2585x-0.91750.9999杂质d0.1066～2.388y＝35.6721x 1.00300.9998
[0089]
2.6定量限和检测限
[0090]
称取杂质a、杂质b、杂质c和杂质d对照品各10mg，加乙腈溶解并稀释制成1ml中约含2μg的混合溶液，分别移取，加乙腈稀释至刻度，得定量限和检测限溶液，进行测定。各杂质的定量限和检测限结果见表7。
[0091]
表7定量限和检测限结果
[0092][0093][0094]
3.结论：
[0095]
在该色谱条件下，氟比洛芬及其杂质可以完全分离，结果均符合中国药典规定的限度内，所得结果可靠。
[0096]
实施例2
[0097]
色谱柱：同实施例1
[0098]
流速：1.2ml/min
[0099]
柱温：35℃
[0100]
进样体积：10μl
[0101]
流动相a：2％体积分数的冰乙酸水缓冲液和乙腈的混合溶液(体积比为60：40)，流动相b为乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱参数如下表8所示：
[0102]
表8梯度洗脱参数
[0103]
时间(min)流动相a的体积比流动相b的体积比0604015604035307050307050.16040656040
[0104]
称取氟比洛芬400mg，置于100ml量瓶中备用；称取杂质a 10mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用乙腈溶解杂质，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。样品中氟比洛芬浓度为4mg/ml，各杂质浓度为2μg/ml。设置流速1.2ml/min，检测波长为240nm，柱温为35℃，取乙腈溶液与供试样品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定结果见下表9：
[0105]
表9测定结果
[0106]
检测物质保留时间(min)分离度含量(％)乙腈峰2.107
‑‑‑‑
杂质a3.5893.1070.03杂质b5.9352.8960.03杂质c8.98049.3220.05氟比洛芬22.20057.108
‑‑
杂质d33.108100.2790.04
[0107]
该条件下，乙腈峰不干扰杂质a的检测，保留时间最长的色谱峰保留时间为33.108min(图2)，该方法可有效检出并计算各杂质含量。
[0108]
实施例3
[0109]
色谱柱：同实施例1
[0110]
流速：1.0ml/min
[0111]
柱温：35℃
[0112]
进样体积：10μl
[0113]
流动相a：10％体积分数的冰乙酸水缓冲液和四氢呋喃的混合溶液(体积比为70：30)，流动相b为四氢呋喃，进行梯度洗脱，梯度洗脱参数如下表10所示：
[0114]
表10梯度洗脱参数
[0115][0116][0117]
称取氟比洛芬400mg，置于100ml量瓶中备用；称取杂质a10 mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用乙腈溶解杂质，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。样品中氟比洛芬浓度为4mg/ml，各杂质浓度为2μg/ml。设置流速1.0ml/min，检测波长为240nm，柱温为35℃，取乙腈溶液与供试样品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定结果见下表11：
[0118]
表11测定结果
[0119]
检测物质保留时间(min)分离度含量(％)乙腈峰2.686
‑‑‑‑
杂质a3.92013.7890.03
杂质b6.47911.9390.04杂质c9.81247.2010.04氟比洛芬23.85487.234
‑‑
杂质d34.231101.9600.05
[0120]
该条件下，乙腈峰不干扰杂质a的检测，保留时间最长的色谱峰保留时间为34.231min(图3)，该方法可有效检出并计算各杂质含量。
[0121]
实施例4
[0122]
色谱柱：同实施例1
[0123]
流速：1.4ml/min
[0124]
柱温：30℃
[0125]
进样体积：10μl
[0126]
流动相a：5％体积分数的冰乙酸水缓冲液和甲醇的混合溶液(体积比为80：20)，流动相b为甲醇，进行梯度洗脱，梯度洗脱参数如下表12所示：
[0127]
表12梯度洗脱参数
[0128]
时间(min)流动相a的体积比流动相b的体积比0100015100035505050505050.11000651000
[0129]
称取氟比洛芬400mg，置于100ml量瓶中备用；称取杂质a 10mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用乙腈溶解杂质，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。样品中氟比洛芬浓度为4mg/ml，各杂质浓度为2μg/ml。设置流速1.4ml/min，检测波长为240nm，柱温为30℃，取乙腈溶液与供试样品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定结果见下表13：
[0130]
表13测定结果
[0131]
[0132][0133]
该条件下，乙腈峰不干扰杂质a的检测，保留时间最长的色谱峰保留时间为38.879min(图4)，该方法可有效检出并计算各杂质含量。
[0134]
对比实施例1
[0135]
色谱柱：5氟苯基硅胶柱；规格4.6
×
250mm，5μm；
[0136]
流速：1.6ml/min
[0137]
柱温：35℃
[0138]
进样体积：10μl
[0139]
流动相a：5％体积分数的冰乙酸水缓冲液和乙腈的混合溶液(体积比为70：30)，流动相b为乙腈，进行梯度洗脱，梯度洗脱参数如下表14所示：
[0140]
表14梯度洗脱参数
[0141]
时间(min)流动相a的体积比流动相b的体积比0901015901035307050307050.19010659010
[0142]
称取氟比洛芬400mg，置于100ml量瓶中备用；称取杂质a 10mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用乙腈溶解杂质，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。样品中氟比洛芬浓度为4mg/ml，各杂质浓度为2μg/ml。设置流速1.6ml/min，检测波长为250nm，柱温为35℃，取乙腈溶液与供试样品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定结果见下表15：
[0143]
表15测定结果
[0144]
检测物质保留时间(min)分离度乙腈峰2.001
‑‑
杂质a2.0150.213杂质b5.89711.347杂质c8.99350.281氟比洛芬22.70058.104杂质d32.791103.878
[0145]
该条件下，乙腈峰干扰杂质a的检测，无法准确计算杂质a的含量，故该方法无法有效检出杂质a(图5)。
[0146]
对比实施例2
[0147]
使用ep9.0《欧洲药典》的氟比洛芬有关物质方法进行检测，方法如下：
[0148]
色谱柱：辛烷键合硅胶；规格3.9
×
150mm，5μm；
[0149]
流速：1.0ml/min
[0150]
柱温：35℃
[0151]
进样体积：10μl
[0152]
检测波长：254nm
[0153]
流动相：乙腈-水-冰醋酸(体积比35：60：5)，等度洗脱，记录色谱图至氟比洛芬保留时间的3倍。
[0154]
溶剂：乙腈-水(体积比45：55)
[0155]
称取氟比洛芬400mg，置于100ml量瓶中备用；称取杂质a 10mg、杂质b 10mg、杂质c 10mg、杂质d 10mg，将其置于50ml量瓶中，用溶剂[乙腈-水(45：55)]溶解杂质，精密量取杂质溶液各1ml至上述备用100ml量瓶中，加乙腈溶解样品并稀释至刻度，摇匀。样品中氟比洛芬浓度为4mg/ml，各杂质浓度为2μg/ml。设置流速1.0ml/min，检测波长为254nm，柱温为35℃，取溶剂[乙腈-水(45：55)]溶液与供试样品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定结果见下表16：
[0156]
表16测定结果
[0157][0158]
该条件下，杂质d未出峰，杂质a、b、c仅出一个峰，故该方法无法有效检出杂质a、b、c和d(图6)。
[0159]
最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应该涵盖在本发明的权利要求范围当中。