用于治疗SCA1的转基因和内含子衍生miRNA联合疗法的制作方法

2550至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，内含子在其3’端侧接有hatxn1l的非编码外显子3，该外显子3具有与seq id no：7的核苷酸2434-2550相同的序列。
10.在一些方面，抑制性rna是sirna、shrna或mirna。在一些方面，抑制性rna是mirna。在某些方面中，mirna包含seq id no：1的序列。在一些方面，mirna包含与seq idno：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。在一些方面，mirna可以侧接有人mirna的侧翼序列。在一些方面，mirna可以侧接有mir30的侧翼序列。在一些方面，mirna可以在其5’端侧接有mir305’侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸1937-1970具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些方面，mirna可以在其5’端侧接有mir305’侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸1937-1970相同。在一些方面，mirna可以在其3’端侧接有mir303’侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸2057-2098具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些方面，mirna在其3’端侧接有mir303’侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸2057-2098相同。
11.在一些方面，编码抑制性rna的第二表达盒包含与抑制性rna编码序列可操作地连接的启动子。在一些方面，启动子是组成型启动子、细胞类型特异性启动子或诱导型启动子。在一些方面，启动子是pol iii启动子或u6启动子。在一些方面，启动子是在脑中表达的mirna的启动子。在一些方面，启动子是mir128启动子。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸1754-1931的序列至少90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸1754-1931的序列相同的序列。
12.在编码靶向人ataxin-1 mrna的抑制性rna的第二表达盒存在于编码人ataxin-1样(hatxnll)的第一表达盒的内含子内的方面，抑制性rna可以不与启动子可操作地连接。
13.在一些方面，编码hatxn1l的第一表达盒包含与hatxn1l编码序列可操作地连接的启动子。在一些方面，启动子是组成型启动子、细胞类型特异性启动子或诱导型启动子。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸194-1356的序列至少90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸194-1356的序列相同的序列。
14.在一些方面，第一和/或第二表达盒包含增强子元件。在一些方面，第一和/或第二表达盒包含内含子、填充多核苷酸序列、多聚腺苷酸信号或其组合。
15.在一个实施方案中，本文提供了包含本实施方案中任一项所述的核酸的细胞。
16.在一个实施方案中，本文提供了重组腺相关病毒(raav)载体，包含本实施方案中任一项所述的aav衣壳蛋白和核酸分子。在一些方面，aav载体包含包含有aav衣壳蛋白的aav颗粒，并且其中第一和/或第二表达盒插入在一对aav反向末端重复序列(itr)之间。在一些方面，aav衣壳蛋白衍生自或选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10、和aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白，或与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白具有70％或更多同一性的衣壳蛋白。在一些方面，该对aav itr衍生自、包含或由以下组成：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 itr、或与
aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 itr序列具有70％或更多同一性的itr。
17.在一个实施方案中，本文提供了治疗有需要的患者的1型脊髓小脑性共济失调(sca)的方法，该方法包括向患者施用编码人ataxin-1样(hatxn1l)的第一表达盒和编码靶向人ataxin-1 mrna的抑制性rna的第二表达盒。在一些方面，编码人ataxin-1样(hatxn1l)的第一表达盒和编码靶向人ataxin-1 mrna的抑制性rna的第二表达盒都存在于相同的核酸分子上。在一些方面，编码靶向人ataxin-1 mrna的抑制性rna的第二表达盒存在于编码人ataxin-1样(hatxnll)的第一表达盒的内含子内。在一些方面，内含子在其5’端侧接有hatxn1l的非编码外显子2，该外显子2具有与seq id no：7的核苷酸1364-1425至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，内含子在其5’端侧接有hatxn1l的非编码外显子2，该外显子2具有与seq id no：7的核苷酸1364-1425相同的序列。在一些方面，内含子在其3’端侧接有hatxn1l的非编码外显子3，该外显子3具有与seq id no：7的核苷酸2434-2550至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，内含子在其3’端侧接有hatxn1l的非编码外显子3，该外显子3具有与seq id no：7的核苷酸2434-2550相同的序列。
18.在一些方面，抑制性rna是sirna、shrna或mirna。在一些方面，抑制性rna是mirna。在某些实施方案中，mirna包含seq id no：1的序列。在一些方面，mirna包含与seq id no：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些方面，mirna可以侧接有人mirna的侧翼序列。在一些方面，mirna可以侧接有人mir30的侧翼序列。在一些方面，mirna可以在其5’端侧接有mir305侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸1937-1970具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些方面，mirna可以在其5
′
端侧接有mir305
′
侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸1937-1970相同。在一些方面，mirna可以在其3’端侧接有mir303
′
侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸2057-2098具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些方面，mirna在其3’端侧接有mir303
′
侧翼序列，该侧翼序列与seq id no：7的核苷酸2057-2098相同。在一些方面，抑制性rna降低人ataxin-1的表达。
19.在一些方面，编码抑制性rna的第二表达盒包含与抑制性rna编码序列可操作地连接的启动子。在一些方面，启动子是组成型启动子、细胞类型特异性启动子或诱导型启动子。在一些方面，启动子是pol iii启动子或u6启动子。在一些方面，启动子是在脑中表达的mirna的启动子。在一些方面，启动子是mir128启动子。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸1754-1931的序列至少90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸1754-1931的序列相同的序列。
20.在编码靶向人ataxin-1 mrna的抑制性rna的第二表达盒存在于编码人ataxin-1样(hatxnll)的第一表达盒的内含子内的方面，抑制性rna可以不与启动子可操作地连接。
21.在一些方面，编码hatxn1l的第一表达盒包含与hatxn1l编码序列可操作地连接的启动子。在一些方面，启动子是组成型启动子、细胞类型特异性启动子或诱导型启动子。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸194-1356的序列至少90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。在一些方面，启动子具有与seq id no：7的核苷酸194-1356的序列相同
的序列。
22.在一些方面，第一和/或第二表达盒包含增强子元件。在一些方面，第一和/或第二表达盒包含内含子、填充多核苷酸序列、多聚腺苷酸信号或其组合。
23.在一些方面，这些方法降低ataxin-1的表达。在一些方面，这些方法将小脑、小脑深部核团、脑干和/或丘脑中的atxnl mrna水平降低至少10％。在一些方面，这些方法将小脑、小脑深部核团、脑干和/或丘脑中的atxn1 mrna水平降低至少10％-50％。
24.在一些方面，第一和/或第二表达盒包含在病毒载体中。在一些方面，病毒载体选自腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些方面，aav载体包含包含有aav衣壳蛋白的aav颗粒，并且其中第一和/或第二表达盒插入在一对aav反向末端重复序列(itr)之间。在一些方面，aav衣壳蛋白衍生自或选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10、和aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白，或与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3衣壳蛋白具有70％或更多同一性的衣壳蛋白。在一些方面，该对aavitr衍生自、包含或由以下组成：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 itr、或与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8 itr序列具有70％或更多同一性的itr。
25.在一些方面，施用多种病毒载体。在一些方面，以每千克约1
×
106至约1
×
10
18
个载体基因组(vg/kg)的剂量施用病毒载体。在一些方面，以每千克患者约1x1071x10
17
、约1x1081x10
16
、约1x1091x10
15
、约1x1o
10-1x10
14
、约1x10
10-1x10
13
、约1x1o
10-1x10
13
、约1x10
10-1x10
11
、约1x10
11-1x10
12
、约1x10
12-x10
13
、或约1x10
13-1x10
14
vg的剂量施用病毒载体。在一些方面，以约0.5-4ml的1x10
6-1x10
16
vg/ml的剂量施用病毒载体。
26.在一些方面，该方法还包括施用多个空病毒衣壳。在一些方面，空病毒衣壳与向患者施用的病毒颗粒一起配制。在一些方面，空病毒衣壳以1.0至100倍过量的病毒载体颗粒或空病毒衣壳一起施用或配制。在一些方面，空病毒衣壳与相对于空病毒衣壳1.0至100倍过量的病毒载体颗粒一起施用或配制。在一些方面，空病毒衣壳与相对于空病毒衣壳约1.0至100分之一的病毒载体颗粒一起施用或配制。
27.在一些方面，施用针对中枢神经系统。在一些方面，施用针对大脑。在一些方面，施用针对小脑延髓池、心室内空间、室管膜、脑室、蛛网膜下腔和/或鞘内空间。在一些方面，脑室是头侧脑室，和/或尾侧脑室，和/或右侧脑室，和/或左侧脑室，和/或右头侧侧脑室，和/或左头侧侧脑室，和/或右尾侧侧脑室，和/或左尾侧侧脑室。在一些方面，施用包括脑室内注射和/或脑实质内注射。在一些方面，室管膜细胞、软脑膜细胞、内皮细胞、脑室细胞、脑膜细胞、神经胶质细胞和/或神经元表达抑制性rna和/或人ataxin-1样蛋白。
28.在一些方面，施用是在脑中的单个位置。在一些方面，施用是在脑中的1-5个位置。
29.在一些方面，该方法减少了1型脊髓小脑性共济失调(sca)的不良症状。在一些方面，不良症状包括早期或晚期症状；行为、性格或语言症状；运动功能症状；和/或认知症状。在一些方面，该方法增加、改善、保存、恢复或挽救患者的记忆缺失、记忆缺陷或认知功能。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止协调性丧失、缓慢运动或身体僵硬的恶化。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止痉挛或烦躁运动的恶化。在一些方面，该方法改
善或抑制或降低或防止抑郁或易怒的恶化。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止掉落物品、跌倒、失去平衡、说话困难或吞咽困难的恶化。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止组织能力的恶化。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止共济失调或反射减弱的恶化。在一些方面，该方法改善或抑制或降低或防止癫痫或震颤癫痫或震颤的恶化。
30.在一些方面，患者是人。
31.在一些方面，该方法还包括施用一种或多种免疫抑制剂。在一些方面，在表达盒施用之前或同时施用免疫抑制剂。在一些方面，免疫抑制剂是抗炎剂。
32.如本文所用，“基本上不含”，对于特定组分，在本文中用于指没有特定组分被有意地配制成组合物和/或仅作为污染物存在或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是用标准分析方法检测不到任何量的特定组分的组合物。
33.如本文说明书所用，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如本文权利要求中所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
34.权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代物或替代物相互排斥，尽管本公开支持仅指替代物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多。
35.在整个本技术中，术语“约”用于表示包括设备的固有误差变化的值、用于确定该值的方法、研究对象之间存在的变化或在规定值的10％以内的值。
36.本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应该理解的是，具体实施方式和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅仅作为说明给出，因为根据该具体实施方式，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
37.以下附图为本说明书的一部分，并且用来进一步说明本发明的某些特定方面。通过参考其中一个或多个附图并结合本发明给出的具体实施方式详细描述，可以更好地理解本发明。
38.图1a至图1d.来自hatxn1l内含子2的mir128的表达。图1a示出了在ef1α启动子控制下的hatxn1l的构建体底图；具有内含子并且在ef1α启动子控制下的hatxn1l；具有包括mir128的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l；具有包括mir128与mir128启动子的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l。图1b示出了当瞬时转染到hek293细胞中时构建体的剪接。图1c示出了作为来自构建体的成熟mirna的mir128表达。图1d示出了来自构建体的hatxn1l的表达。
39.图2a至图2d.来自hatxn1l内含子2的mis1的表达。图2a示出了在ef1α启动子控制下的hatxnll的构建体底图；具有内含子并且在ef1α启动子控制下的hatxn1l；具有包括mis1的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxnll；具有包括mis1与mir128启动子的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l；和直接在ef1α启动子的控制下的mis1。图2b示出了来自构建体的mis1表达。图2c示出了来自构建体的hatxn1l表达。图2d示出了用构建体
转染后的hatxn1水平。
40.图3a至图3b.构建体底图。图3a示出了在两个反向末端重复序列(itr)之间驱动人ataxin-1样的ef1α启动子作为对照载体。图3b示出了驱动mirna、mis1的鼠u6启动子，然后是驱动人ataxin-1样的ef1α启动子。还将测试对照引导型病毒。
41.图4.b05 sca1小鼠给药研究的研究设计。
42.图5a至图5c.转棒分析。图5a示出了4天内12周龄的基线转棒性能。有关图例，请参见图5b。图5b示出了20周龄(注射后8周)的转棒性能。图5c示出了每个实验组在20周与12周时的转棒性能差异。*p＜0.05；**p＜0.005；***p＜0.001，基于双向anova，然后是dunnett的多重比较事后分析。
43.图6a至图6c.对来自经治疗的b05小鼠和未经治疗的野生型同窝小鼠的全小脑提取物的qrt-pcr分析。图6a示出了mis1水平的qrt-pcr。图6b示出了人atxn1 mrna水平的qrt-pcr。图6c示出了人atxn1l mrna水平的qrt-pcr。样品取自20周龄(注射后8周)的小鼠。***p＜0.001；****p＜0.0001，相对于盐水，基于单因素方差分析，然后是dunnett的多重比较事后分析。
44.图7a至图7b.对来自经治疗的b05小鼠和未经治疗的野生型同窝小鼠的全小脑提取物的qrt-pcr分析，以评估转录失调。图7a示出了小鼠vegfa mrna水平的qrt-pcr。图7b示出了小鼠grm1 mrna水平的qrt-pcr。样品取自20周龄(注射后8周)的小鼠。****p＜0.0001，相对于野生型，基于单因素方差分析，然后是dunnett的多重比较事后分析。
45.图8a至图8b.对来自经治疗的b05小鼠和未经治疗的野生型同窝小鼠的全小脑提取物的qrt-pcr分析，以评估神经胶质增生。图8a示出了小鼠gfap mrna水平的qrt-pcr。图8b示出了小鼠ibal mrna水平的qrt-pcr。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001，相对于盐水，基于单因素方差分析，然后是dunnett的多重比较事后分析。
46.图9.对来自经治疗的b05小鼠和未经治疗的野生型同窝小鼠的全小脑提取物的qrt-pcr分析，以评估小鼠capicua水平。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001，相对于盐水，基于单因素方差分析，然后是dunnett的多重比较事后分析。
47.图10a至图10f.对来自经治疗的b05小鼠和未经治疗的野生型同窝小鼠的全小脑提取物的qrt-pcr分析，以评估体内转基因加工和功效。图10a示出了mis1表达的qrt-pcr。图10b示出了人atxn1 mrna水平的qrt-pcr。图10c示出了人atxn1lmrna水平的qrt-pcr。图10d示出了相对于人atxnll mrna水平的mis1表达。图10e示出了小鼠gfap mrna水平的qrt-pcr。图10f示出了小鼠iba1 mrna水平的qrt-pcr。*p＜0.05相对于无注射。所有组的n＝4-6。
具体实施方式
48.动物研究对于更好地确定sca1发病机制的细胞和分子机制至关重要(bowman等人，2007；cvetanovic等人，2007；lai等人，2011；lam等人，2006；lambrechts&carmeliet，2006；lim等人，2008；morrison，2009；orr，2012；rodriguez-lebron等人，2013；serra等人，2004；serra等人，2006；tsuda等人，2005；zoghbi和orr，2009)。这种功能获得性疾病得益于减少疾病等位基因表达的方法。例如，多西环素诱导的sca1转基因小鼠模型表明，在持续表达12周后抑制突变蛋白产生显著改善了病理和行为缺陷(zu等人，2004)。
或“shrna”分子或“mirna”是靶向目标核酸序列的核苷酸rna双链体。如本文所用，术语“sirna”是涵盖shrna和mirna的子集的通用术语。“rna双链体”是指由rna分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。sirna被“靶向”至基因，因为sirna的双链体部分的核苷酸序列与靶向基因的核苷酸序列互补。在某些实施方案中，sirna靶向编码亨廷顿蛋白的序列。在一些实施方案中，sirna双链体的长度小于30个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度可以为29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个碱基对。在一些实施方案中，双链体的长度为19至25个碱基对。在某些实施方案中，双链体的长度为19或21个碱基对。sirna的rna双链部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可以包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。环的长度可以不同。在一些实施方案中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在某些实施方案中，环的长度为18个核苷酸。发夹结构还可以包含3
′
和/或5
′
突出端部分。在一些实施方案中，突出端是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3
′
和/或5
′
突出端。
56.shrna由茎环结构组成，其设计为包含5’侧翼区、sirna区片段、环区、3'sirna区和3’侧翼区。大多数rnai表达策略都使用了由基于poliii的强启动子驱动的短发夹rna(shrna )。许多shrna已经在体外以及体内证明了对靶序列的有效敲除，然而，一些证明了对靶基因有效敲除的shrna也被发现在体内具有毒性。
57.mirna是由前体茎环转录物加工而成的小细胞rna(～22nt)。可以修饰已知的mirna茎环以包含目标基因特异性的rnai序列。因为mirna是内源性表达的，所以mirna分子可能优于shrna分子。因此，mirna分子不太可能诱导dsrna应答干扰素途径，它们比shrna的加工效率高，并且已显示它们的沉默效率提高了80％。
58.最近发现的替代方法是将人工mirna(穿梭sirna序列的pri-mirna支架)用作rnai载体。人工mirna更天然地类似于内源性rnai底物，并且更易于pol-ii转录(例如，允许rnai的组织特异性表达)和多顺反子策略(例如，允许递送多个sirna序列)。参见美国专利号10,093,927，其通过引用并入。
[0059]“shrna”的转录单位由通过未配对核苷酸环连接的有义序列和反义序列组成。shrna通过exportin-5从细胞核中输出，一旦进入细胞质，就会被dicer加工以生成功能性sirna。“mirna”茎环由通过未配对的核苷酸环连接的有义序列和反义序列组成，核苷酸环通常表达为较大初级转录物(pri-mirna)的一部分，其被drosha-dgcr8复合物切除，生成称为前mirna的中间体，该中间体随后由exportin-5从细胞核中输出，并且一旦进入细胞质，就被dicer加工以生成功能性sirna。如本文可互换使用的，“人工mirna”或“人工mirna穿梭载体”是指具有被靶基因的sirna序列取代的经由drosha和dicer加工切除的双链体茎环区域(至少约9-20个核苷酸)，同时保留有效drosha加工所需的茎环内的结构元件的初级mirna转录物。术语“人工”衍生自侧翼序列(上游～35个核苷酸和下游～40个核苷酸)衍生自sirna多克隆位点内的限制酶位点的事实。如本文所用，术语“mirna”涵盖天然存在的mirna序列以及人工生成的mirna穿梭载体。
[0060]
sirna可以由核酸序列编码，并且该核酸序列还可以包括启动子。核酸序列还可以包括聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号是合成的最小聚腺苷酸化信号或六个t的序列。
[0061]
在设计rnai时，有若干因素需要考虑，诸如sirna的性质、沉默效应的持久性和递送系统的选择。为了产生rnai效应，引入生物体的sirna通常包含外显子序列。此外，rnai过程是同源依赖性的，因此必须仔细选择序列以最大限度地提高基因特异性，同时最大限度地减少同源序列但非基因特异性序列之间的交叉干扰。优选地，sirna在sirna序列和待抑制基因之间表现出大于80％、85％、90％、95％、98％或甚至100％的同一性。与靶基因低于约80％相同的序列基本上不太有效。因此，sirna与待抑制基因的同源性越高，不相关基因的表达受到影响的可能性就越小。
[0062]
此外，sirna的大小是重要的考虑因素。在一些实施方案中，本发明涉及包括至少约19-25个核苷酸并且能够调节基因表达的sirna分子。在本发明的上下文中，sirna的长度优选小于500、200、100、50或25个核苷酸。更优选地，sirna的长度为约19个核苷酸至约25个核苷酸。
[0063]
sirna靶通常指包含编码多肽的区域，或调节复制、转录或翻译或对多肽的表达重要的其他过程的多核苷酸区域的多核苷酸，或包含编码多肽的区域和与其可操作地连接的调节表达的区域的多核苷酸。可以靶向在细胞中表达的任何基因。优选地，靶基因是参与或与对疾病重要或作为研究对象特别感兴趣的细胞活动进展相关的基因。
[0064]
施用方法
[0065]
可以通过本文所述的方法或用途施用或治疗任何合适的细胞或哺乳动物。通常，被怀疑具有或表达与疾病状态相关的异常或异常蛋白质的哺乳动物需要本文所述的方法。
[0066]
哺乳动物的非限制性实例包括人、非人灵长类动物(例如猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家畜(例如狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在某些实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，哺乳动物是非啮齿类哺乳动物(例如，人、猪、山羊、绵羊、马、狗等)。在某些实施方案中，非啮齿类哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或处于任何发育阶段(例如，成人、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。在某些实施方案中，哺乳动物可以是动物疾病模型，例如，具有或表达与疾病状态相关的异常或异常蛋白质的动物模型或具有导致疾病状态的蛋白质表达不足的动物模型。
[0067]
通过本文所述的方法或组合物治疗的哺乳动物(受试者)包括成年人(18岁或以上)和儿童(小于18岁)。成年人包括老年人。代表性成年人为50岁或以上。儿童的年龄范围为1-2岁，或2-4、4-6、6-18、8-10、10-12、12-15和15-18岁。儿童还包括婴儿。婴儿通常在1-12个月大。
[0068]
在某些实施方案中，方法包括向如本文所述的哺乳动物施用多种病毒颗粒或纳米颗粒，其中疾病状态的一种或多种症状(诸如神经-退化性疾病)的严重性、频率、进展或发作时间得以降低、减少、预防、抑制或延迟。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用多种病毒颗粒或纳米颗粒以治疗疾病状态的不良症状，诸如神经退行性疾病。在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物施用多种病毒颗粒或纳米颗粒以稳定、延迟或防止疾病状态诸如神经退行性疾病的恶化或进展或逆转和不利症状。
[0069]
在某些实施方案中，方法包括向哺乳动物的中枢神经系统或其部分(如本文所述)施用多种病毒颗粒或纳米颗粒，并且疾病状态(诸如神经退行性疾病)的一种或多种症状的严重性、频率、进展或发作时间被降低、减少、预防、抑制或延迟至少约5至约10天、约10至约
25天、约25至约50天或约50至约100天。
[0070]
在某些实施方案中，症状或副作用包括早期、中期或晚期症状；行为、性格或语言症状；吞咽、运动、癫痫、震颤或坐立不安的症状；共济失调；和/或认知症状，诸如记忆力、组织能力。
[0071]
在一些实施方案中，可以使用基于病毒和非病毒的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。此类方法可以用于将编码抑制性rna和/或治疗性蛋白质的核酸施用于培养中的细胞或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括dna质粒、rna(例如本文所述载体的转录物)、裸核酸和与递送载体(诸如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括dna和rna病毒，它们在递送至细胞后具有游离或整合的基因组。关于基因治疗规程的综述，请参见anderson，1992；nabel&feigner，1993；mitani&caskey，1993；dillon，1993；miller，1992；van brunt，1988；vigne，1995；kremer&perricaudet，1995；haddada等人，1995；和yu等人，1994。
[0072]
核酸的非病毒递送方法包括外来体、脂质转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、人工病毒体和药剂增强的dna摄取。脂质转染描述于(例如，美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355)并且脂质转染试剂在商业上出售(例如，transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括feigner的那些，wo 91117424；wo 91116024。可以递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
[0073]
在一些实施方案种，递送是经由使用基于rna或dna病毒的系统来递送核酸。在某些方面，病毒载体可以直接施用于患者(体内)，或者它们可以用于在体外或离体治疗细胞，然后施用于患者。在一些实施方案中，基于病毒的系统包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒载体。
[0074]
术语“载体”是指小媒介核酸分子、质粒、病毒(例如，aav载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体)，或可以通过核酸的插入或掺入进行操纵的其他载体。载体(诸如病毒载体)可以用于将核酸序列引入/转移到细胞中，使得其中的核酸序列被转录，并且如果编码蛋白质，则随后被细胞翻译。
[0075]“表达载体”是含有基因或核酸序列的特化载体，该基因或核酸序列具有在宿主细胞中表达所需的必要调控区。表达载体可以至少含有用于在细胞中繁殖的复制起点和任选的附加元素，诸如异源核酸序列、表达控制元件(例如启动子、增强子)、内含子、itr和聚腺苷酸化信号。
[0076]
病毒载体衍生自或基于一种或多种包含病毒基因组的核酸元件。示例性病毒载体包括腺相关病毒(aav)载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
[0077]
术语“重组”作为载体(诸如重组病毒例如慢病毒或细小病毒(例如，aav)载体)的修饰物，以及序列(诸如重组核酸序列和多肽)修饰物，是指组合物已经以自然界中通常不存在的方式被操纵(即，工程化)。重组载体(诸如aav、逆转录病毒或慢病毒载体)的具体实例是其中将通常不存在于野生型病毒基因组中的核酸序列插入到病毒基因组内。重组核酸序列的实例是其中核酸(例如基因)编码克隆到载体中的抑制性rna，其带有或不带有通常与病毒基因组内相关的基因的5’、3’和/或内含子区。尽管术语“重组”在本文中并不总是用于指代载体(诸如病毒载体)以及诸如多核苷酸的序列，但包括核酸序列、多核苷酸、转基因
等的“重组”形式被明确包括在内，尽管有任何此类遗漏。
[0078]
重组病毒“载体”衍生自病毒的野生型基因组，诸如aav、逆转录病毒或慢病毒，通过使用分子方法从病毒中去除野生型基因组并且用非天然的核酸诸如核酸序列取代。通常，例如，对于aav，aav基因组的一个或两个反向末端重复序列(itr)序列保留在重组aav载体中。“重组”病毒载体(例如，raav)不同于病毒(例如，aav)基因组，因为病毒基因组的全部或部分已经被病毒基因组核酸的非天然序列取代，诸如编码反式激活因子的核酸或编码抑制性rna的核酸或编码治疗性蛋白质的核酸。因此，此类非天然核酸序列的掺入将病毒载体定义为“重组”载体，在aav的情况下可称为“raav载体”。
[0079]
a.腺相关病毒(aav)
[0080]
腺相关病毒(aav)是细小病毒科的一种小的非致病性病毒。迄今为止，已鉴定出许多血清学上不同的aav，并且已从人类或灵长类动物中分离出十几种。aav不同于该家族的其他成员，因为它依赖于辅助病毒进行复制。
[0081]
aav基因组可以以染色体外状态存在而不整合到宿主细胞基因组中；拥有广泛的宿主范围；在体外和体内转导分裂和非分裂细胞，并且保持转导基因的高水平表达。aav病毒颗粒是热稳定的；耐溶剂、清洁剂以及ph值和温度变化；并且可以在cscl梯度上或通过其他方式进行柱纯化和/或浓缩。aav基因组包含单链脱氧核糖核酸(ssdna)，无论是正义还是反义的。aav的大约5kb基因组由一段正负极性的单链dna组成。基因组的末端是短的反向末端重复序列(itr)，其可以折叠成发夹结构并且作为病毒dna复制的起点。
[0082]
aav“基因组”是指最终被包装或包封以形成aav颗粒的重组核酸序列。aav颗粒通常包含用aav衣壳蛋白包装的aav基因组。在重组质粒用于构建或制造重组载体的情况下，aav载体基因组不包括与重组质粒的载体基因组序列不对应的“质粒”部分。重组质粒的该非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，它对于质粒的克隆和扩增很重要，这是繁殖和重组病毒生产所需的过程，但它本身并没有被包装或包封到病毒颗粒中。因此，aav载体“基因组”是指由aav衣壳蛋白包装或包封的核酸。
[0083]
aav病毒体(颗粒)是直径约25nm的无包膜的二十面体颗粒。aav颗粒具有二十面体对称性，由三种相关的衣壳蛋白vp1、vp2和vp3组成，它们相互作用形成衣壳。右旋orf通常编码衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。这些蛋白质通常分别以1∶1∶10的比例被发现，但可能以不同的比例存在，并且都衍生自右旋orf。vp1、vp2和vp3衣壳蛋白通过使用可变剪接和不寻常的起始密码子而彼此不同。缺失分析表明了从选择性剪接的信息中翻译的vp1的去除或改变导致感染性颗粒的产量降低。vp3编码区内的突变导致不能产生任何单链子代dna或感染性颗粒。
[0084]
aav颗粒是包含aav衣壳的病毒颗粒。在某些实施方案中，aav颗粒的基因组编码一种、两种或所有vp1、vp2和vp3多肽。
[0085]
大多数天然aav的基因组通常含有两个开放阅读框(orf)，有时称为左orf和右orf。左orf通常编码非结构性rep蛋白，即rep 40、rep 52、rep 68和rep 78，它们除了产生单链子代基因组外，还参与复制和转录的调节。其中两种rep蛋白与aav基因组优先整合到人类第19号染色体q臂区有关。已显示rep68/78具有ntp结合活性以及dna和rna解旋酶活性。一些rep蛋白具有核定位信号以及几个潜在的磷酸化位点。在某些实施方案中，aav(例如，raav)的基因组编码一些或所有rep蛋白。在某些实施方案中，aav(例如，raav)的基因组
不编码rep蛋白。在某些实施方案中，rep蛋白的一种或多种可以反式递送，因此不包括在包含编码多肽的核酸的aav颗粒中。
[0086]
aav基因组的末端包含短的反向末端重复序列(itr)，其具有折叠成用作病毒dna复制的起点的t形发夹结构的潜力。因此，aav的基因组包含一个或多个(例如一对)itr序列，其位于单链病毒dna基因组的侧翼。itr序列通常每个长度约为145个碱基。在itr区内，已描述了被认为是itr功能的核心的两个元素，gagc重复基序和末端解析位点(trs)。当itr处于线性或发夹构象时，已显示重复基序结合rep。这种结合被认为将rep68/78定位于以位点和链特异性方式发生的trs处的切割。除了它们在复制中的作用之外，这两个元素似乎是病毒整合的核心。含在19号染色体整合位点内的是rep结合位点和相邻的trs。这些元素已被证明是功能性的，并且对于位点特异性整合是必需的。
[0087]
在某些实施方案中，aav(例如，raav)包含两个itr。在某些实施方案中，aav(例如，raav)包含一对itr。在某些实施方案中，aav(例如，raav)包含一对itr，其位于至少编码具有功能或活性的多肽的核酸序列的侧翼(即，在每个5
′
和3
′
末端)。
[0088]
aav载体(例如，raav载体)可以被包装并且在本文中被称为用于随后离体、体外或体内的细胞感染(转导)的“aav颗粒”。当重组aav载体被包封或包装到aav颗粒中时，该颗粒也可以称为“raav颗粒”。在某些实施方案中，aav颗粒是raav颗粒。raav颗粒通常包含raav载体或其一部分。raav颗粒可以是一种或多种raav粒子(例如，多个aav颗粒)。raav颗粒通常包含包封或包装raav载体基因组的蛋白质(例如衣壳蛋白)。应当指出的是，对raav向量的引用也可以用于引用raav颗粒。
[0089]
任何合适的aav颗粒(例如，raav颗粒)可以用于本文的方法或用途。raav颗粒和/或其中包含的基因组可以衍生自任何合适的aav血清型或毒株。raav颗粒和/或其中包含的基因组可以衍生自两种或更多种aav血清型或毒株。因此，raav可以包含aav的任何血清型或毒株的蛋白质和/或核酸或其部分，其中aav颗粒适用于哺乳动物细胞的感染和/或转导。aav血清型的非限制性实例包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10和aav-2i8。
[0090]
在某些实施方案中，多个raav颗粒包含相同毒株或血清型(或亚群或变体)的颗粒或衍生自相同菌株或血清型的颗粒。在某些实施方案中，多个raav颗粒包含两种或更多种不同raav颗粒(例如，不同血清型和/或毒株)的混合物。
[0091]
如本文所用，术语“血清型”是用于指具有在血清学上区别于其他aav血清型的衣壳的aav的区别。血清学特异性是基于一种aav的抗体与另一种aav的抗体之间缺乏交叉反应性来确定的。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列差异)。尽管包括衣壳变体的aav变体可能在血清学上没有区别于参照aav或其他aav血清型，但与参照或其他aav血清型相比，它们至少有一个核苷酸或氨基酸残基不同。
[0092]
在某些实施方案中，raav颗粒排除某些血清型。在一个实施方案中，raav颗粒不是aav4颗粒。在某些实施方案中，raav颗粒在抗原性或免疫学上区别于aav4。可以通过标准方法确定特异性。例如，elisa和蛋白质印迹可以用于确定病毒颗粒在抗原性或免疫学上是否区别于aav4。此外，在某些实施方案中，raav2颗粒保留了区别于aav4的组织嗜性。
[0093]
在某些实施方案中，基于第一血清型基因组的raav载体对应于包装该载体的衣壳
蛋白中的一种或多种的血清型。例如，包含aav载体基因组的一种或多种aav核酸(例如，itr)的血清型对应于包含raav颗粒的衣壳的血清型。
[0094]
在某些实施方案中，raav载体基因组可以基于区别于包装载体的aav衣壳蛋白中的一种或多种的血清型的aav(例如，aav2)血清型基因组。例如，raav载体基因组可以包含aav2衍生的核酸(例如，itr)，而三种衣壳蛋白中的至少一种或多种衍生自不同的血清型，例如，aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh10、rh74或aav-2i8血清型或其变体。
[0095]
在某些实施方案中，与参照血清型相关的raav颗粒或其载体基因组具有多核苷酸、多肽或其子序列，该多核苷酸、多肽或其子序列包含或由以下序列组成：与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh10、rh74或aav-2i8颗粒的多核苷酸、多肽或亚序列至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同。在特定实施方案中，与参照血清型相关的raav颗粒或其载体基因组具有衣壳或itr序列，该衣壳或itr序列包含或由以下序列组成：与aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、rh10、rh74或aav-2i8血清型的衣壳或itr序列至少60％或更多(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)相同。
[0096]
在某些实施方案中本文的方法包括使用、施用或递送raav1、raav2、raav3、raav4、raav5、raav6、raav7、raav8、raav9、raav10、raav11、raav12、rrh10、rrh74或raav-2i8颗粒。
[0097]
在某些实施方案中，本文的方法包括使用、施用或递送raav2颗粒。在某些实施方案中，raav2颗粒包含aav2衣壳。在某些实施方案中，raav2颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如，vp1、vp2和/或vp3)，该衣壳蛋白与天然或野生型aav2颗粒的相应衣壳蛋白至少60％、65％、70％、75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同。在某些实施方案中，raav2颗粒包含vp1、vp2和vp3衣壳蛋白，该衣壳蛋白与天然或野生型aav2颗粒的相应衣壳蛋白至少75％或更多(例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同。在某些实施方案中，raav2颗粒是天然或野生型aav2颗粒的变体。在一些方面，aav2变体的一种或多种衣壳蛋白与天然或野生型aav2颗粒的衣壳蛋白相比具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。
[0098]
在某些实施方案中；raav9颗粒包含aav9衣壳。在某些实施方案中，raav9颗粒包含一种或多种衣壳蛋白(例如，vp1、vp2和/或vp3)，该衣壳蛋白与天然或野生型aav9颗粒的相应衣壳蛋白至少60％、65％、70％、75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同。在某些实施方案中，raav9颗粒包含vpl、vp2和vp3衣壳蛋白，该衣壳蛋白与天然或野生型aav9颗粒的相应衣壳蛋白至少75％或更多(例如80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同。在某些实施方案中，raav9颗粒是天然或野生型aav9颗粒的变体。在一些方面，aav9变体的一种或多种衣壳蛋白与天然
或野生型aav9颗粒的衣壳蛋白相比具有1、2、3、4、5、5-10、10-15、15-20或更多个氨基酸取代。
[0099]
在某些实施方案中，raav颗粒包含一个或两个itr(例如一对itr)，该itr与天然或野生型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10或aav-2i8的相应itr至少75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同，只要它们保留一种或多种所需的itr功能(例如，形成允许dna复制的发夹的能力；将aav dna整合到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要)。
[0100]
在某些实施方案中，raav2颗粒包含一个或两个itr(例如一对itr)，该itr与天然或野生型aav2颗粒的相应itr至少75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同，只要它们保留一种或多种所需的itr功能(例如，形成允许dna复制的发夹的能力；将aavdna整合到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要)。
[0101]
在某些实施方案中，raav9颗粒包含一个或两个itr(例如一对itr)，该itr与天然或野生型aav2颗粒的相应itr至少75％或更多(例如80％、85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％等)，最多100％相同，只要它们保留一种或多种所需的itr功能(例如，形成允许dna复制的发夹的能力；将aavdna整合到宿主细胞基因组中；和/或包装，如果需要)。
[0102]
raav颗粒可以包含具有任何合适数量的“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，aav2颗粒的itr包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个“gagc”重复序列。在某些实施方案中，raav2颗粒包含包含有三个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒包含具有少于四个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒包含具有多于四个“gagc”重复序列的itr。在某些实施方案中，raav2颗粒的itr包含rep结合位点，其中前两个“gagc”重复序列中的第四个核苷酸是c而不是t。
[0103]
示例性的合适长度的dna可以掺入raav载体中，用于包装/包壳到raav颗粒中，长度可以为约5千碱基(kb)或更少。在特别的实施方案中，dna的长度小于约5kb、小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb、小于约3kb或小于约2.5kb。
[0104]
包括指导rnai或多肽表达的核酸序列的raav载体可以使用本领域已知的合适的重组技术生成(例如，参见sambrook等人，1989)。重组aav载体通常被包装成具有转导能力的aav颗粒，并使用aav病毒包装系统进行繁殖。具有转导能力的aav颗粒能够结合并进入哺乳动物细胞，随后将核酸货物(例如异源基因)递送至细胞核。因此，具有转导能力的完整raav颗粒被配置为转导哺乳动物细胞。配置为转导哺乳动物细胞的raav颗粒通常不具备复制能力，并且需要额外的蛋白质机器来自我复制。因此，配置为转导哺乳动物细胞的raav颗粒被工程改造为结合并进入哺乳动物细胞并将核酸递送至细胞，其中用于递送的核酸通常位于raav基因组中的一对aav itr之间。
[0105]
用于产生有转导能力的aav颗粒的合适宿主细胞包括但不限于微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，它们可以或已经用作异源raav载体的受体。可以使用来自稳定的人细胞系hek293的细胞(可通过例如美国典型培养物保藏中心以登录号atcc crl1573轻松获得)。在某些实施方案中，用腺病毒5型dna片段转化的并且表达腺病毒e1a和e1b基因的
经修饰的人胚肾细胞系(例如，hek293)用于生成重组aav颗粒。经修饰的hek293细胞系易于转染，并且提供了一个生产raav颗粒特别方便的平台。生成能够转导哺乳动物细胞的高效价aav颗粒的方法是本领域已知的。例如，aav颗粒可以如wright，2008和wright，2009中所述制备。
[0106]
在某些实施方案中，通过在av表达载体转染a之前或同时用aav辅助构建体转染宿主细胞，将aav辅助功能引入宿主细胞。因此，aav辅助构建体有时用于提供aavrep和/或cap基因的至少瞬时表达，以补充生产性aav转导所需的缺失aav功能。aav辅助构造通常缺少aavitr，既不能复制也不能自行包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体的形式。已经描述了许多aav辅助构建体，诸如编码rep和cap表达产物的常用质粒paav/ad和pim29 45。已知编码rep和/或cap表达产物的若干其他载体。
[0107]
逆转录病毒
[0108]
在本文的方法、组合物和用途中用作递送药剂的病毒载体包括逆转录病毒载体(参见例如miller(1992)nature，357：455-460)。逆转录病毒载体非常适合将核酸递送至细胞中，因为它们能够将未重排的单拷贝基因递送至范围广泛的啮齿动物、灵长类动物和人体细胞中。逆转录病毒载体整合到宿主细胞的基因组中。与其他病毒载体不同，它们只感染分裂细胞。
[0109]
逆转录病毒是rna病毒，因此病毒基因组是rna。当宿主细胞被逆转录病毒感染时，基因组rna被逆转录为dna中间体，该中间体非常有效地整合到被感染细胞的染色体dna中。这种整合的dna中间体被称为前病毒。前病毒转录和组装成传染性病毒发生在合适的辅助病毒存在下或在含有允许包封而不会同时产生污染性辅助病毒的适当序列的细胞系中。如果用于包封的序列是通过与合适的载体共转染提供的，则生产重组逆转录病毒不需要辅助病毒。
[0110]
逆转录病毒基因组和前病毒dna具有三个基因：gag、pol和env，它们的侧翼是两个长末端重复(ltr)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白，env基因编码病毒包膜糖蛋白。pol基因编码的产物包括rna指导的将病毒rna转录成双链dna的dna聚合酶逆转录酶，将逆转录酶产生的dna整合到宿主染色体dna中的整合酶以及用于加工编码的gag和pol基因的蛋白酶。5
′
ltr和3'ltr用于促进病毒体rna的转录和多腺苷酸化。ltr含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。
[0111]
逆转录病毒载体描述于coffin等人，retroviruses，cold spring harbor laboratorypress(1997)。逆转录病毒的示例是莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)或鼠干细胞病毒(mscv)。逆转录病毒载体可以是复制能力型的或复制缺陷型的。通常，逆转录病毒载体是复制缺陷型的，其中额外轮次病毒体复制和包装所必需的基因编码区被删除或被其他基因取代。因此，一旦初始靶细胞被感染，病毒就不能继续其典型的裂解途径。此类逆转录病毒载体和产生此类病毒的必要试剂(例如包装细胞系)是可商购的(参见例如可从clontech(诸如目录号634401、631503、631501等)，clontech，加利福尼亚州山景城获得的逆转录病毒载体和系统)。
[0112]
此类逆转录病毒载体可以通过用待递送的核酸分子取代复制所需的病毒基因来作为递送试剂产生。得到的基因组在每一端都含有ltr，中间有一个或多个所需基因。产生逆转录病毒的方法是本领域技术人员已知的(参见例如国际公开的pct申请号wo1995/
026411)。逆转录病毒载体可以在含有一个或多个辅助质粒的包装细胞系中产生。包装细胞系提供衣壳产生和载体病毒体成熟所需的病毒蛋白(例如，gag、pol和env基因)。通常，使用至少两个单独的辅助质粒(分别含有gag和pol基因；以及env基因)，使得载体质粒之间不会发生重组。例如，可以使用标准转染方法将逆转录病毒载体转移到包装细胞系中，诸如磷酸钙介导的转染。包装细胞系是本领域技术人员熟知的，并且是可商购的。示例性包装细胞系是gp2-293包装细胞系(目录号631505、631507、631512，clontech)。在获得病毒体产品的足够时间后，收获病毒。如果需要，收获的病毒可以用于感染第二个包装细胞系，例如，产生具有不同宿主嗜性的病毒。最终结果是不具备复制能力的重组逆转录病毒，其包括目的核酸但缺少其他结构基因，因此无法在宿主细胞中形成新病毒。
[0113]
说明在基因治疗中使用逆转录病毒载体的参考文献包括：clowesetal.，(1994)j.clin.invest.93：644-651；kiemet al.，(1994)blood 83：1467-1473；salmons and gunzberg(1993)human gene therapy4：129-141；grossman and wilson(1993)curr：opin.ingenetics and devel.3：110-114；sheridan(2011)nature biotechnology，29：121；cassani et al.(2009)blood，114：3546-3556。
[0114]
慢病毒
[0115]
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还含有其他具有调节或结构功能的基因。更高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：hiv-1、hiv-2和猿猴免疫缺陷病毒：siv。慢病毒载体是通过多重减弱hiv毒力基因产生的，例如删除基因env、vif、vpr、vpu和nef，使载体在生物学上是安全的。慢病毒载体是本领域众所周知的(参见，例如，美国专利6,013,516和5,994,136)。
[0116]
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如，美国专利5,994,136(通过引用并入本文)中描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两种或多种携带包装功能的载体转染，即gag、pol和env，以及rev和tat。
[0117]
慢病毒基因组和前病毒dna具有在逆转录病毒中发现的三个基因：gag、pol和env，它们的侧翼是两个长末端重复(ltr)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码rna指导的dna聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5
′
ltr和3
′
ltr用于促进病毒体rna的转录和聚腺苷酸化。ltr含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有额外的基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
[0118]
邻近5
′
ltr的是基因组逆转录所需的序列(trna引物结合位点)和病毒rna有效包壳到颗粒中的序列(psi位点)。如果病毒基因组中缺少包壳(或将逆转录病毒rna包装成感染性病毒体)所必需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组rna的包壳。然而，由此产生的突变体仍然能够指导所有病毒体蛋白的合成。
[0119]
其他病毒载体
[0120]
用于基因递送的病毒载体的开发和应用在不断进行改进和开发。其他病毒载体诸如痘病毒；例如，牛痘病毒(gnant等人，1999；gnant等人，1999)、甲病毒；例如，辛德比斯病毒、semliki森林病毒(lundstrom，1999)、呼肠孤病毒(coffey等人，1998)和甲型流感病毒
(neumann等人，1999)被考虑用于本公开并且可以根据目标系统的必要特性进行选择。
[0121]
e.嵌合病毒载体
[0122]
正在开发嵌合或杂合病毒载体以用于治疗性基因递送，并且考虑用于本公开。已描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(holzer等人，1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(feng等人，1997；bilbao等人，1997；caplen等人，2000)和腺病毒/腺相关病毒载体(fisher等人，1996；美国专利5,871,982)。这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒的有利特征。例如，wilson等人提供了一种嵌合载体构建体，该构建体包含腺病毒的一部分、aav 5
′
和aav 3
′
itr序列和选定的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，具体通过引用并入本文)。
[0123]
药物组合物
[0124]
如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指适用于一种或多种给药途径、体内递送或接触的生物学上可接受的组合物、制剂、液体或固体或其混合物。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物是在生物学或其他方面不是不良的物质，例如，该物质可以施用于受试者而不会引起实质上不良的生物学效应。此种组合物、“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”制剂和组合物可以是无菌的。此类药物制剂和组合物可以用于例如将病毒颗粒或纳米颗粒施用于受试者。
[0125]
此类制剂和组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如，水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散体和悬浮液介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。补充的活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可以掺入制剂和组合物中。
[0126]
药物组合物通常含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括本身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体并且可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、吐温80和液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质，诸如表面活性剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，可以存在于此类载体中。
[0127]
药物组合物可以配制成与特定的施用或递送途径相容，如本文所述或本领域技术人员已知的。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径施用或递送的媒介、稀释剂或赋形剂。
[0128]
适用于注射或输注病毒颗粒或纳米颗粒的药物形式可以包括无菌水溶液或分散体，其适用于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散体，任选包封在脂质体中。在所有情况下，最终形式都应该是无菌流体，并且在制造、使用和储存条件下是稳定的。液体媒介或载体可以是溶剂或液体分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯和其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过脂质体的形成、在分散体的情况下通过保持所需的粒度或通过使用表面活性剂来保持。可以包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或盐(例如氯化钠)。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
[0129]
病毒颗粒或纳米颗粒的溶液或悬浮液可以任选地包括以下组分中的一种或多种：
无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、人工csf、表面活性剂、固定油、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、甘油或其他合成溶剂；抗菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。
[0130]
适用于本发明的组合物、方法和用途的药物制剂、组合物和递送系统是本领域已知的(参见，例如，remington：the science and practice of pharmacy(2003)20
th ed.，mack publishing co.，easton，pa；remington
′
s pharmaceutical sciences(1990)18
th
，mack publishing co.，easton，pa；the merck index(1996)12
th
，merck publishing group，whitehouse，nj；pharmaceutical principles of solid dosage forms(1993)，technonic publishing co.，inc.，lancaster，pa.；ansel和stoklosa，pharmaceutical calculations(2001)11
th
，lippincott williams&wilkins，baltimore，md；和poznansky et al，drug delivery systems(1980)，rl juliano，ed.，oxford，n.y.，pp.253-315)。
[0131]
病毒颗粒和它们的组合物可以配制成剂量单位形式以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算与所需的药物媒介联合产生期望治疗效果。剂量单位形式取决于认为产生期望效果所必需的病毒颗粒或纳米颗粒的数量。必需的量可以配制成单剂量，或可以配制成多个剂量单位。可以将剂量调整到合适的病毒颗粒或纳米颗粒浓度，任选地与抗炎剂组合，并且包装使用。
[0132]
在一个实施方案中，药物组合物将包括足够的遗传物质以提供治疗有效量，即足以减轻或改善所讨论疾病状态的症状或不利影响的量或足以赋予期望益处的量。
[0133]
如本文所用，“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、赋形剂或填充剂)结合，当以一个或多个剂量施用时，旨在产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂型可以在例如安瓿和小瓶内，其可以包括液体组合物，或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可以在体内施用或递送之前加入无菌液体媒介。单个单位剂型可以包括在多剂量试剂盒或容器中。因此，例如，病毒颗粒、纳米颗粒和其药物组合物可以包装在单个或多个单位剂型中，以便于施用和剂量的均匀性。
[0134]
含有病毒颗粒或纳米颗粒的制剂通常含有有效的量，该有效的量可由本领域技术人员容易地确定。病毒颗粒或纳米颗粒通常可占组合物的约1％至约95％(w/w)的范围内，或者如果合适的话甚至更高。待施用的量取决于考虑治疗的哺乳动物或人受试者的年龄、体重和身体状况等因素。本领域普通技术人员可以通过建立剂量反应曲线的常规试验来建立有效剂量。
[0135]
定义
[0136]
术语“多核苷酸”、“核酸”和“转基因”在本文中可互换使用以指代所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)及其聚合物。多核苷酸包括基因组dna、cdna和反义dna，以及剪接或未剪接的mrna、rrna、trna和抑制性dna或rna(rnai，例如小或短发夹(sh)rna、微小rna(mirna)、小或短干扰(si)rna、反式剪接rna或反义rna)。多核苷酸可以包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸(例如，变体核酸)。多核苷
酸可以是单链的、双链的或三链的、线性的或环状的，并且可以是任何合适的长度。在讨论多核苷酸时，特定多核苷酸的序列或结构可以根据在5
′
至3
′
方向提供序列的惯例在本文中描述。
[0137]
编码多肽的核酸通常包含编码多肽的开放阅读框。除非另有说明，特定的核酸序列还包括简并密码子取代。
[0138]
核酸可以包括与开放阅读框可操作地连接的一种或多种表达控制或调控元件，其中一种或多种调控元件被配置为指导由开放阅读框编码的多肽在哺乳动物细胞中的转录和翻译。表达控制/调控元件的非限制性实例包括转录起始序列(例如，启动子、增强子、tata盒等)、翻译起始序列、mrna稳定性序列、聚腺苷酸序列、分泌序列等。表达控制/调控元件可以从任何合适生物的基因组中获得。
[0139]“启动子”是指核苷酸序列，通常位于编码序列的上游(5
′
)，其通过提供对rna聚合酶和正确转录所需的其他因子的识别来指导和/或控制编码序列的表达。pol ii启动子包括最小启动子，该最小启动子是由tata盒和任选的其他用于指定转录起始位点的序列组成的短dna序列，向其中加入调控因子以控制表达。1型pol iii启动子包括转录起始位点下游的三个顺式作用序列元件：a)5
′
序列元件(a块)；b)中间序列元件(i块)；c)3
′
序列元件(c块)。2型pol iii启动子包括转录起始位点下游的两个必需的顺式作用序列元件：a)a盒(5
′
序列元件)；b)b盒(3
′
序列元素)。3型pol iii启动子包括转录起始位点上游的若干顺式作用启动子元件，诸如传统的tata盒、近端序列元件(pse)和远端序列元件(dse)。
[0140]“增强子”是可以刺激转录活性的dna序列，并且可以是启动子的先天元件或增强表达水平或组织特异性的异源元件。它能够在任一方向(5
′‑
》3
′
或3
′‑
》5
′
)运行，并且即使位于启动子的上游或下游也能够发挥作用。
[0141]
启动子和/或增强子可以全部衍生自天然基因，或由衍生自自然界中发现的不同元件的不同元件组成，或甚至由合成dna片段组成。启动子或增强子可以包含参与蛋白质因子结合的dna序列，该蛋白质因子调节/控制响应于刺激、生理或发育条件的转录起始的有效性。
[0142]
启动子的非限制性实例包括sv40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子；腺病毒主要晚期启动子(ad mlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子诸如cmv即刻早期启动子区(cmvie)、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、pol ii启动子、pol iii启动子、合成启动子、杂合启动子等。此外，衍生自非病毒基因的序列，诸如鼠金属硫蛋白基因，也将在本文中找到用途。示例性的组成型启动子包括编码某些组成型或“管家”功能的以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(pgk)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、肌动蛋白启动子、u6和本领域技术人员已知的其他组成型启动子。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成型发挥作用。其中包括：sv40的早期和晚期启动子；莫洛尼氏白血病病毒和其他逆转录病毒的长末端重复序列(ltr)；和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子等。此外，衍生自内含子mirna启动子的序列，诸如mir107、mir206、mir208b、mir548f-2、mir569、mir590、mir566和mir128启动子也将在本文中找到用途(参见例如monteys等人，2010)。因此，任何上述组成型启动子可以用于控制异源基因插入物的转录。
[0143]“转基因”在本文中用于方便地指旨在或已经被引入细胞或生物体的核酸序列/多
核苷酸。转基因包括任何核酸，诸如编码抑制性rna或多肽或蛋白质的基因，并且相对于天然存在的aav基因组序列通常是异源的。
[0144]
术语“转导”是指通过载体(例如，病毒颗粒)将核酸序列引入细胞或宿主生物体。因此，通过病毒颗粒将转基因引入细胞可以称为细胞的“转导”。转基因可以或可以不整合到转导细胞的基因组核酸中。如果引入的转基因整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组dna)中，则它可以稳定地维持在该细胞或生物体中，并进一步传递给受体细胞或生物体的后代细胞或生物体或由其遗传。最后，引入的转基因可能存在于染色体外的受体细胞或宿主生物体中，或仅短暂存在。因此，“转导细胞”是通过转导将转基因引入其中的细胞。因此，“转导”细胞是其中已引入转基因的细胞或其后代。转导细胞可以繁殖、进行转基因转录和抑制性rna编码或蛋白质表达。对于基因治疗用途和方法，转导细胞可以在哺乳动物中。
[0145]
在诱导剂存在下，在诱导型启动子控制下的转基因仅表达或更大程度地表达(例如，在某些金属离子的存在下，在金属硫蛋白启动子控制下的转录大大增加)。诱导型启动子包括在其诱导因子结合时刺激转录的应答元件(re)。例如，有血清因子、类固醇激素、视黄酸和环amp的re。可以选择含有特定re的启动子以获得可诱导的应答，并且在某些情况下，re本身可以连接到不同的启动子，从而赋予重组基因可诱导性。因此，通过选择合适的启动子(组成型与诱导型；强与弱)，可以控制遗传修饰细胞中多肽的存在和表达水平。如果编码多肽的基因在诱导型启动子的控制下，则通过将转基因的细胞原位暴露于允许多肽转录的条件来触发多肽的原位递送，例如通过腹膜内注射控制试剂转录的诱导型启动子的特异性诱导剂。例如，通过将转基因的细胞与含有适当(即诱导)金属离子的溶液原位接触，增强转基因细胞的原位表达在金属硫蛋白启动子控制下的基因编码的多肽。
[0146]
当核酸/转基因与另一个核酸序列形成功能关系时，它是“可操作地连接的”。编码rnai或多肽的核酸/转基因，或指导多肽表达的核酸可以包括诱导型启动子，或用于控制所编码多肽转录的组织特异性启动子。可操作地连接到表达控制元件的核酸也可以称为表达盒。
[0147]
在某些实施方案中，cns特异性或诱导型启动子、增强子等用于本文所述的方法和用途。cns特异性启动子的非限制性实例包括从髓鞘碱性蛋白(mbp)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和神经元特异性烯醇化酶(nse)的基因中分离的那些。诱导型启动子的非限制性实例包括蜕皮激素、四环素、缺氧和干扰素的dna应答元件。
[0148]
在某些实施方案中，表达控制元件包含cmv增强子。在某些实施方案中，表达控制元件包含β肌动蛋白启动子。在某些实施方案中，表达控制元件包含鸡β肌动蛋白启动子。在某些实施方案中表达控制元件包含cmv增强子和鸡β肌动蛋白启动子。
[0149]
如本文所用，术语“修饰”或“变体”及其语法变体是指核酸、多肽或其子序列偏离参照序列。因此，修饰和变体序列可以具有与参照序列相比基本上相同、更大或更少的表达、活性或功能，但至少保留了参照序列的部分活性或功能。一种特定类型的变体是突变蛋白质，它是指由具有突变(例如，错义或无义突变)的基因编码的蛋白质。
[0150]“核酸”或“多核苷酸”变体是指与野生型相比已被基因改变的修饰序列。该序列可以被基因修饰而不改变编码的蛋白质序列。或者，该序列可以被基因修饰以编码变体蛋白质。核酸或多核苷酸变体还可以指组合序列，其已被密码子修饰以编码与参照序列(诸如野生型蛋白质序列)仍保持至少部分序列同一性的蛋白质，并且还已被密码子修饰以编码变
体蛋白质。例如，此种核酸变体的一些密码子将被改变而不会改变由其编码的蛋白质的氨基酸，并且核酸变体的一些密码子将被改变，这反过来又改变了由其编码的蛋白质的氨基酸。
[0151]
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。由本文公开的“核酸”或“多核苷酸”或“转基因”编码的“多肽”包括部分或全长天然序列，如天然存在的野生型和功能性多态性蛋白质、其功能性子序列(片段)和其序列变体，只要多肽保留一定程度的功能或活性。因此，在本发明的方法和用途中，由核酸序列编码的此类多肽不需要与被治疗的哺乳动物中有缺陷的或其活性、功能或表达不足、缺陷或缺失的内源蛋白相同。
[0152]
修饰的非限制性实例包括一个或多个核苷酸或氨基酸取代(例如，约1至约3、约3至约5、约5至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25、约25至约30、约30至约40、约40至约50、约50至约100、约100至约150、约150至约200、约200至约250、约250至约500、约500至约750、约750至约1000或更多个核苷酸或残基)。
[0153]
氨基酸修饰的实例是保守氨基酸取代或缺失。在特定的实施方案中，修饰的或变异的序列保留了未修饰序列(例如，野生型序列)的至少部分功能或活性。
[0154]
氨基酸修饰的另一个实例是引入病毒颗粒的衣壳蛋白的靶向肽。已经鉴定了将重组病毒载体或纳米颗粒靶向中枢神经系统的肽，诸如血管内皮细胞。因此，例如，修饰的重组病毒颗粒或纳米颗粒可以靶向排列脑血管的内皮细胞。
[0155]
如此修饰的重组病毒可以优先结合一种类型的组织(例如cns组织)而不是另一种类型的组织(例如肝组织)。在某些实施方案中，携带修饰的衣壳蛋白的重组病毒可以通过以高于可比较的未修饰衣壳蛋白的水平结合来“靶向”脑血管上皮组织。例如，具有修饰的衣壳蛋白的重组病毒可以以比未修饰的重组病毒高50％至100％的水平结合脑血管上皮组织。
[0156]“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。大多数生物体中的脱氧核糖核酸(dna)是遗传物质，而核糖核酸(rna)参与将dna中包含的信息转移到蛋白质中。本发明还包括所公开的核苷酸序列的片段和变体以及由其编码的蛋白质或部分长度的蛋白质。“片段”或“部分”是指编码多肽或蛋白质的核苷酸序列或氨基酸序列的全长或小于全长。在某些实施方案中，片段或部分具有生物学功能(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的活性或野生型的功能)。
[0157]
分子的“变体”是与天然分子的序列基本相似的序列。对于核苷酸序列，变体包括由于遗传密码的简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。可以使用分子生物学技术鉴定诸如这些天然存在的等位基因变体，例如使用聚合酶链式反应(pcr)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用定点诱变产生的编码天然蛋白质的核苷酸序列，以及编码具有氨基酸取代的多肽的核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体将具有与天然(内源性)核苷酸序列具有至少40％、50％、60％至70％(例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％)，通常至少80％，例如，81％-84％、至少85％(例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％)的序列同一性的序列。在某些实施方案中，变体具有生物学功能(即，保留5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、
95％、99％或100％野生型活性或功能)。
[0158]
特定核酸序列的“保守变异”是指那些编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子cgt、cgc、cga、cgg、aga和agg都编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密码子指定的每个位置，可以将密码子改变为所描述的任何相应密码子而不改变编码的蛋白质。此类核酸变异是“沉默变异”，是“保守修饰变异”的一种。除非另有说明，本文所述的编码多肽的每个核酸序列还描述了每个可能的沉默变异。本领域技术人员将认识到可以通过标准技术修饰核酸中的每个密码子(atg除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个“沉默变异”都隐含在每个描述的序列中。
[0159]
术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指与使用标准参数描述的对齐程序中的一个参照序列相比，多核苷酸包含具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％，或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％或94％、或甚至至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常是指至少70％、至少80％、90％或甚至至少95％的序列同一性。
[0160]
在多肽情况下的术语“基本同一性”表示多肽包含的序列在指定的比较窗口内与参照序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％、或80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，或至少90％、91％、92％、93％、或94％、或甚至95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。两个多肽序列相同的指示是一种多肽与针对第二种多肽产生的抗体具有免疫反应性。因此，一种多肽与第二种多肽是相同的，例如，其中两种肽的区别仅在于保守取代。
[0161]
术语“治疗”(treat、treatment)是指治疗性治疗和预防措施，其中目的是预防、抑制、减少或降低不期望的生理变化或障碍，诸如障碍发展、进展或恶化。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化或进展)疾病的症状或副作用、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态，以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括那些已经患有该病症或障碍的人以及那些易患(例如，通过基因检测确定)的人。
[0162]
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。
[0163]
本文所述的所有方法和用途可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”或“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另有声明。说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必不可少的。
[0164]
本文公开的所有特征可以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征都可以由用于相同、等效或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征(例如，修饰的核酸、载体、质粒、重组载体序列、载体基因组或病毒颗粒)是等价或相似特征的
实例。
[0165]
如本文所用，形式“一”、“一个”和“所述”包括单数和复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，提及“核酸”包括多个此类核酸，提及“载体”包括多个此类载体，提及“病毒”或“aav或raav颗粒”包括多个此类病毒体/aav或raav颗粒。
[0166]
本文使用的术语“约”是指在参考值的10％(加或减)内的值。
[0167]
除非本文另有说明，否则本文中值范围的列举仅旨在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独的值均内含子掺入说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。
[0168]
因此，除非上下文另有明确说明，否则所有数值或数值范围都包括此类范围内的整数和范围内的值或整数的分数。因此，为了说明，提及80％或更多同一性包括8i％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等。
[0169]
提及大于(大于)或小于的整数分别包括大于或小于参考数的任何数字。因此，例如，对小于100的引用包括99、98、97等，一直到数字1(1)；小于10，包括9、8、7等，一直到数字1(1)。
[0170]
如本文所用，所有数值或范围包括该范围内的值和整数的分数以及该范围内的整数的分数，除非上下文另有明确指示。因此，为了说明，提及数字范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等等。因此，提及1-50范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、等，最多并且包括50个，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。
[0171]
提及一系列范围包括组合系列内不同范围的边界值的范围。因此，为了说明参考一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500、4,500-5,000、5,500-6,000、6,000-7,000、7,000-8,000或8,000-9,000，包括10-20、10-50、30-50、50-100、100-300、100-1,000、1,000-3,000、2,000-4,000、4,000-6,000等。
[0172]
试剂盒
[0173]
本发明提供了具有包装材料和其中的一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包括标签或包装插页，其中包括组分的描述或其中组分在体外、体内或离体使用的说明。试剂盒可以包含此类组分的集合，例如核酸、重组载体、病毒颗粒、剪接修饰分子和任选的第二活性剂，诸如另一种化合物、试剂、药物或组合物。
[0174]
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组件的物理结构。包装材料可以保持组件无菌，并且可以由通常用于此类目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成。
[0175]
标签或插页可以包括其中一种或多种组分的识别信息、剂量、活性成分的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学。标签或插页可以包括识别制造商、批号、制造地点和日期、有效期的信息。标签或插页可以包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可以包括关于可以使用试剂盒组件的疾病的信息。标签或插页可以包括临床医生或受试者在方法、用途或处理方案或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的
说明。说明可以包括剂量、频率或持续时间，以及实施本文所述的任何方法、用途、治疗方案或预防或治疗方案的说明。
[0176]
标签或插页可以包括关于组分可提供的任何益处的信息，诸如预防或治疗益处。标签或插页可以包括关于潜在不良副作用、并发症或反应的信息，诸如就不适合使用特定组合物的情况向受试者或临床医生发出警告。当受试者已经、将要或目前正在服用一种或多种可能与组合物不相容的其他药物，或受试者已经、将要或目前正在接受与该组合物不相容的另一种治疗方案或治疗学方案时，也可能发生不良副作用或并发症，因此，说明书可以包括关于此类不相容性的信息。
[0177]
标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或单独或贴在组件、套件或包装材料(例如，盒子)上，或附接包含试剂盒组件的安瓿、管或小瓶上。标签或插页还可以包括计算机可读介质，诸如条形码印刷标签、磁盘、光盘例如cd-或dvd-rom/ram、dvd、mp3，或电存储介质例如ram和rom或这些的混合体，诸如磁/光存储介质、闪存、混合体和存储型卡。
[0178]
实施例
[0179]
包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员应该根据本公开内容理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
[0180]
实施例1-hatxn1l和mis1组合表达
[0181]
表达mis1和atxn1l的单一载体的递送以比单独的任一治疗更低的剂量实现疗效。较低剂量的递送为将这些疗法应用于患者提供了更广泛的安全裕度。为了证明这一点，制备了表达mis1(5
′‑
ucgaucuucaggucguugcuu-3
′
；seq id no：1)和atxn1l的双顺反子载体，并且使用已建立的方法在有症状的sca1小鼠中进行了给药研究。结果测量包括转棒分析和尸检后组织的神经病理学和转录组学(图4)。
[0182]
与未处理的转基因小鼠或野生型同窝小鼠相比，给药研究测试了在b05转基因小鼠(burright等人，1995)中aav.mis1.atxn1l或单独的aav.atxn1l(构建体描绘于图3a-b中)的功效。在通过立体定向手术向b05转基因小鼠以递增剂量两侧施用aav.mis1.atxn1l或aav.atxn1l之前(表1)，在11周龄时通过转棒测定动物。(图4)。在先前的剂量研究中，以8e9 vg递送的aav.mis1被证明是有效的并且耐受性良好(keiser等人，2016)。此外，先前使用以8e9 vg递送的aav1.ataxin-1-like的研究防止了行为发作(keiser等人，2013)。
[0183]
表1 aav.mis1.atxn1l研究设计
[0184][0185][0186]
对于转棒分析，通过在加速的转棒装置上对治疗组进行盲法测试的测试器上对小鼠进行测试。小鼠习惯于转棒四分钟，然后连续四天每天进行3次试验(试验之间至少休息30分钟)。对于每次试验，在5分钟内加速从4至40rpm，然后将速度保持在40rpm。每次试验记录每只老鼠的跌落时间(或者如果老鼠连续两次旋转而不跑步)。试验在500秒时停止，此时留在棒上的小鼠记为500秒。使用双向方差分析和tukey事后分析来评估显著性差异。
[0187]
如图5a所示，在12周龄时(即，在治疗施用之前)，b05转基因小鼠从棒上脱落的时间在统计学上显著短于野生型小鼠的时间。如图5b所示，在20周龄时(即，治疗施用后8周)，对照处理的转基因小鼠在约100秒后不能留在转棒装置上。在用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗的b05小鼠中，只有用8e7 vg的aav.mis1.hatxnll治疗的小鼠从棒上脱落的时间继续在统计学上显著短于野生型小鼠的时间。其余治疗的小鼠与它们的野生型同窝小鼠没有统计学差异。此外，如图5c所示，当每组的表现被分析为第20周和第12周之间跌落时间差异时，只有对照处理的转基因小鼠的表现在统计学上低于野生型小鼠，并且只有对照处理的转基因小鼠的表现随着时间的推移而恶化。因此，用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗防止b05小鼠进一步出现转棒缺陷。此外，对图5c中呈现的数据的进一步分析表明，用8e9 vg剂量的aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗逆转了先前的转棒缺陷。
[0188]
如图6a所示，全小脑裂解物的分析证实mis1表达随着aav.mis1.hatxnll剂量的增加而以剂量依赖性方式增加。此外，图6b示出了mis1表达与敲低atxn1 mrna呈剂量依赖性相关。如图6c所示，随着aav.misl.hatxn1l或aav.hatxn1l的剂量增加，atxn1l mrna水平以剂量依赖性方式增加。
[0189]
如图7a和7b所示，对来自vegfa和代谢型谷氨酸受体1型(grml)(在b05模型中下调的两种转录物)的转录物的评估，证实用aav.mis1.hatxnll或aav.hatxnll治疗的小鼠表达vegfa和grml的水平与野生型小鼠没有显著差异。因此用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗可以挽救有症状的b05小鼠的转录失调。
[0190]
如图8a&8b所示，用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗挽救b05转基因小鼠的
神经胶质增生。用盐水处理的b05小鼠显示出比用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗的那些更高水平的gfap mrna(图8a)。类似地，用盐水处理的b05小鼠显示出比用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l处理的小鼠更高水平的ibal mrna，除了用8e9 vg剂量的aav.hatxnll处理的小鼠和用8e7 vg剂量的aav.mis1.hatxn1l处理的小鼠(图8b)。
[0191]
如图9所示，用aav.mis1.hatxn1l或aav.hatxn1l治疗对b05小鼠中的正常capicua mrna水平没有影响。
[0192]
实施例2-来自hatxn1l内含子2的mir128的表达
[0193]
mir128是天然存在的内含子mirna。近端上游内含子序列(～200bp)足以驱动基于pol iii的mir128表达(monteys等人，2010)。为了测试成熟的mir128是否可以由修饰的(即减少的长度)hatxn1l内含子2加工，如下生成构建体：(1)在ef1α启动子控制下的hatxn1l(seq id no：2)；(2)具有内含子并且在ef1α启动子控制下的hatxn1l(seq id no：3)；(3)具有包括mir128的内含子并且在ef1 α启动子的控制下的hatxn1l(seq id no：4)；和(4)具有包括mir128以及mir128启动子的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l(seq id no：5)(参见图1a)。当瞬时转染入hek293细胞时，修饰的内含子被适当剪接(图1b)并且在有和没有mir128启动子的情况下，mir128都被有效地加工成成熟的mirna(图1c)。还评估了hatxn1l的表达，发现仅存在内含子会增强(图1d)。然而，当mir128单独或mir128与其启动子组合存在于内含子中时，观察到hatxn1l的表达降低(图1d)，表明剪接前mirna的一些加工可能通过去除聚腺苷酸尾导致转录物降解。
[0194]
实施例3-来自hatxn1l内含子2的mis1的表达
[0195]
在验证由修饰的hatxn1l内含子2加工mir128之后，生成构建体以测试是否可以由相同的修饰内含子加工靶向hatxn1的mirna，mis1。为此，如下生成构建体：(1)在ef1α启动子控制下的hatxn1l(seq id no：2)；(2)具有内含子并且在ef1α启动子控制下的hatxn1l(seq id no：3)；(3)具有包括mis1的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l(seq id no：6)；和(4)具有包括mis1以及mir128启动子的内含子并且在ef1α启动子的控制下的hatxn1l(seq id no：7)；和(5)在ef1α启动子的直接控制下的mis1(seq id no：8)(参见图2a)。与mir128结果一致，将内含子掺入hatxn1l转基因导致hatxn1l表达显著增加(图2c)，并且在有和没有mir128启动子的情况下，mis1都被有效地加工成成熟的mirna(图2b)。虽然当mir128启动子位于上游时，成熟mis1没有增加但这可能不表明脑中的功能，因为mir128在hek293细胞中没有高表达。因此，预期mir128启动子的存在可以进一步增强脑中mis1的表达。使用这种瞬时转染试验，其中只有一部分细胞被转染，mis1的表达在降低hatxn1表达方面仅适度有效(图2d)。预期从aav基因转移到非分裂细胞中的mis1的稳定表达将产生足够的沉默。
[0196]
实施例4-来自hatxn1l内含子2的mis1的体内加工和功效
[0197]
为了在体内测试转基因加工和功效，将mis1内含子或mir128启动子 mis1制备为aav2/1并以递增剂量(2e8、2e9和2e10vg/小鼠)注射到6周龄b05小鼠的小脑深部核团(dcn)中。在注射后三周收获小脑半球。增加的病毒剂量与增加的misl表达(图10a)和伴随的体内靶向hatxn1转录物减少相关(图10b)。hatxn1l转录物水平也随着剂量增加而增加(图10c)。在mirna上游包含内含子mir128rnapol iii启动子区段相对于hatxn1l在所有剂量下增加了mis1表达，但仅在两个较高剂量时达到显著性(图10d)。最后，用任一种病毒处理的b05小
鼠显示在所有剂量下gfap表达(星形胶质细胞的标志物)显著增加(图10e)，而ibai表达(小胶质细胞的标志物)仅在最高剂量下显著增加(图10f)。这些结果证明了在体内有效的联合治疗转基因加工，并且支持在随后的长期研究中以较低的剂量施用病毒。
[0198]
***
[0199]
根据本公开，可以在没有过度实验的情况下制作和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，显而易见的是，化学上和生理上相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修饰都被认为在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
[0200]
参考文献
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以下参考文献在一定程度上提供了对本文所述内容的示例性程序或其他细节的补充，这些参考文献通过引用具体并入本文。
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