一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用

1.本发明属于中药活性成分筛选技术领域，具体涉及一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用。


背景技术：

2.传统中药活性成分研究通常采用生物效应导向的系统分离结合药理实验确定。中药成分复杂，并且有效成分含量往往低微，因此其分离分析操作烦琐，工作量大，周期长，成功率低，而且分解和忽视了中药“多组分-多靶点”整体作用的本质。
3.寻找活性成分快速筛选方法和技术一直是国内外制药公司关注的焦点。迄今为止，已明确的药物靶标超过500个，其中超过50%的药物以膜受体为靶标。因此，以膜受体靶标为核心的药物直接筛选已成为发现先导化合物的有效方法。近年来，以磁性纳米微球为载体，使用细胞膜囊泡作为功能涂层，制备细胞膜功能化磁性纳米微球，在外加磁场的定向控制下，利用其磁响应性和膜表面亲和基团高选择性，从复杂的生物体系中“垂钓”出活性物质，已成功用于中药中细胞膜结合活性成分的筛选。然而，膜受体包覆磁珠的制备是制约该技术发展的瓶颈。
4.传统的细胞膜包覆磁性纳米微球的方法需要通过两步实现：第一步是超声破碎细胞，制备细胞膜碎片；第二步是机械搅拌或超声作用下磁性纳米微球与细胞膜碎片充分混合后静置，通过磁性微球物理吸附细胞膜的磷脂双分子层，进而在其表面形成均匀的细胞膜层。尽管传统的方法可以有效地将细胞膜包覆于磁性纳米微球表面，然而仍然面临以下两方面问题：一是超声处理/机械力作用破坏了细胞膜的完整性，降低了细胞膜的功能，从而可能导致膜蛋白构象的改变甚至变性，降低药物筛选结果的准确性；二是这种物理吸附过程由于无法区分细胞膜内/外表面，导致药物筛选位点不明确，同时由于细胞膜内/外表面受体同时存在，单位面积药物筛选位点减少，降低了相关筛选方法的灵敏度。这些问题限制了细胞膜包覆磁珠垂钓方法的进一步开发和应用。由于细胞膜外表面含有大量药物靶点的配体结合域，因此，建立一种外表面朝外的完整细胞膜包覆纳米磁珠垂钓中药活性成分的方法具有重要意义。
5.细胞膜电穿孔技术（electroporation）是在短时外加电场的作用下，细胞膜出现暂时微孔，通透性增大的物理过程。该过程使得一些原本无法穿过细胞膜的分子可以自由地进出细胞，电场取消后微孔关闭而不会对细胞造成任何影响，这一特性使得电穿孔技术目前广泛用于基因转染和膜伪装纳米递药体系的构建，在细胞膜垂钓中药活性成分研究领域暂时还未广泛涉及。
6.类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, ra）是临床常见的一种以侵蚀性关节炎为主要症状，多种靶细胞参与的自身免疫性疾病。巨噬细胞因分泌促炎因子、趋化因子及组织降解酶等具有多方面作用而处于类风湿关节炎免疫细胞的核心地位。巨噬细胞已成为类风湿性关节炎治疗的重要靶细胞，其膜上受体是抗类风湿性关节炎活性物质发挥作用的
重要靶点。附子能温补肾阳、祛风散寒，具有抗炎、镇痛等药理活性，临床上用于治疗关节炎，然而其抗炎活性成分仍不清楚。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法。该方法制备生物相容性好兼具膜靶向的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒，然后与靶细胞巨噬细胞共培养后进行电穿孔，从而构建完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系并对中药活性成分垂钓筛选，保证了体系中细胞膜的结构完整性和外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，相对增加垂钓载体表面靶点数量，提高了对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、fe3o4@bsa-rdg磁性纳米颗粒的合成步骤101、fe3o4磁性纳米颗粒的合成：在全程氮气保护下，首先将乙酰丙酮铁在磁力搅拌下溶解于油胺与油酸的混合溶液中，得到乙酰丙酮铁溶液，然后将n-甲基吡咯烷酮在机械搅拌下加热回流，再将乙酰丙酮铁溶液逐滴加入到加热回流后的n-甲基吡咯烷酮中进行反应，冷却至室温后经磁分离、洗涤，得到fe3o4磁性纳米颗粒；步骤102、fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的合成：将牛血清白蛋白和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在室温下搅拌得到bsa溶液，然后将步骤101中得到的fe3o4磁性纳米颗粒加入到bsa溶液中继续搅拌反应，再依次经磁分离、洗涤和冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包覆的fe3o4磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa磁性纳米颗粒；步骤103、fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的合成：将步骤102中得到的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散在去离子水中，并加入pbs超声分散，得到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液中在避光条件下搅拌，继续加入n-羟基琥珀酰亚胺在避光条件下搅拌，再加入rgd在室温避光条件下搅拌进行反应，经磁分离、洗涤，得到rgd修饰的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒；步骤二、完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备步骤201、将巨噬细胞接种于dmem培养基中，放入恒温培养箱中培养至细胞密度为70%~80%，弃去培养液后加入到含有步骤一中fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中进行共培养，得到共培养液；步骤202、采用胰酶消化步骤201中得到的共培养液，经磁分离收集负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞，将负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞重悬于含有fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液吸入到电穿孔比色皿中并置于冰块上孵育，再采用电穿孔仪进行电穿孔，并立即转入冰浴中，加入预热的培养基后放入培养箱中进行培养，经dmem培养基洗涤后，得到负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的巨噬细胞，即完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠raw-fe3o4@bsa-rdg；步骤三、垂钓中药活性成分步骤301、制备中药提取物；
步骤302、将步骤二中制备的巨噬细胞膜包覆纳米磁珠悬浮后得到悬浮液，然后将步骤301中制备的中药提取物加入到悬浮液中，并放入培养箱中进行培养，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，沉淀经缓冲液冲洗后采用有机溶剂振摇洗脱，经磁力固液分离得到含有中药活性成分的垂钓液。
9.本发明先制备fe3o4磁性纳米颗粒，然后采用牛血清白蛋白（bsa）进行包覆，得到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒，再依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）搅拌，加入rgd对fe3o4@bsa磁性纳米颗粒进行修饰，利用bsa生物相容性好的特性及rgd易于与细胞膜上受体结合的特性，得到生物相容性好兼具膜靶向的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒；然后将靶细胞即巨噬细胞与含有fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中进行共培养，利用巨噬细胞的吞噬功能使得fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒进入巨噬细胞中，经胰酶消化分散细胞和磁分离后得到负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞，并重悬于含有fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，再置于冰块上孵育，以保持细胞活性，再采用电穿孔仪进行电穿孔，在电脉冲作用下使得细胞膜出现微孔且通透性增加，从而将细胞混悬液中的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒转入细胞内，经培养得到负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒，从而构建完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系，无需预先破碎细胞，保证了体系中细胞膜的结构完整性，避免了细胞膜蛋白构象的改变甚至变性，保证了细胞膜表面受体的结构及活性，同时保证了细胞膜的外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，相对增加垂钓载体表面靶点数量，将其与中药提取物培养，利用该体系中细胞膜对中药活性成分的选择性，从复杂的中药生物体系中垂钓出活性成分，提高了对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度。
10.本发明中的rgd为arg-gly-asp（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）三肽。
11.上述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤101中所述加热回流采用的转速为600rpm，温度为200℃，时间为1h。
12.上述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤103中所述加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后搅拌采用的转速为600rpm，时间为30min，加入n-羟基琥珀酰亚胺搅拌采用的转速为1000rpm，时间为1h，加入rgd后搅拌采用的转速为1000rpm，时间为24h。
13.上述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤201中所述培养的条件为：37℃、5%co2恒温培养箱；所述共培养的条件为：37℃、5%co2恒温培养箱，时间为6h。
14.上述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤202中所述电穿孔的参数为：脉冲电压300v，脉冲时间20ms，脉冲间隔时间5s，连续脉冲4次。
15.另外，本发明还公开了一种如上述的基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法的应用，其特征在于，该方法在垂钓附子活性成分的应用。
16.上述的应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、将附子采用纯净水浸泡后煎煮，趁热经纱布一次过滤得到一次滤液和一次残渣，将一次残渣采用纯净水煎煮，趁热经纱布二次过滤得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液并进行减压浓缩，得到附子提取物浓缩液，将附子提取物浓缩液稀释
后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到附子提取物溶液，对附子提取物溶液中的化学成分进行分析；步骤二、将步骤一中得到的附子提取物溶液加入到巨噬细胞膜包覆纳米磁珠悬浮制得的悬浮液中，并放入培养箱中进行培养，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，沉淀经pbs缓冲液洗脱后采用溶剂甲醇振摇洗脱，经磁力固液分离得到含有附子化学成分的垂钓液，对垂钓液中的化学成分进行分析，并根据步骤一中获得的附子提取物溶液中的化学成分进行提取离子分析，得到附子活性成分。
17.本发明以类风湿性关节炎治疗的重要靶细胞—巨噬细胞为细胞膜原料制备的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠，对与治疗关节炎的中药附子提取物溶液进行培养，使得附子提取物溶液中的抗炎活性成分与完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠中巨噬细胞膜表面的受体靶点发生选择性特异结合即垂钓，经pbs缓冲溶液冲洗后采用溶剂甲醇洗脱，再经磁力固液分离除去完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠，得到含有附子化学成分的垂钓液，最终获得附子活性成分。该方法利用完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠表面巨噬细胞膜的完整性，提高了巨噬细胞膜表面受体靶点对附子化学成分中活性成分的吸附性能，提高了垂钓筛选结果的准确性，同时由于完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠表面巨噬细胞膜的外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，相对增加垂钓载体表面靶点数量，提高了垂钓筛选的灵敏性，实现了对附子中抗炎活性成分的垂钓，从而确定了附子中抗炎活性成分。
18.上述的应用，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱法对步骤一中附子提取物溶液中的化学成分和步骤二中垂钓液中的化学成分进行分析，分别得到附子提取物溶液和垂钓液的化学成分的离子色谱图，然后进行提取离子分析，得到附子活性成分。
19.本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明采用包覆和修饰的方法制备生物相容性好兼具膜靶向的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒，然后与靶细胞巨噬细胞共培养后重悬进行电穿孔，从而构建完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系并对中药活性成分垂钓筛选，通过采用电穿孔对细胞膜的增透性能使得fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒进入巨噬细胞，保证了体系中细胞膜的结构完整性，进而保证了细胞膜表面受体的结构及活性，且同时细胞膜的外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，相对增加垂钓载体表面靶点数量，提高了对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度。
20.2、本发明利用细胞膜电穿孔法的特性联合磁珠垂钓法，构建完整细胞膜包覆纳米磁珠垂钓中药活性成分的方法，特异性高，选择性好，工作量小，周期短，成功率高，适用于中药活性成分的筛选。
21.3、本发明在制备磁性纳米颗粒的过程中增加电穿孔工艺，无需采用超声破碎细胞以及采用机械搅拌下促进磁性纳米颗粒与细胞膜碎片的混合吸附，节省了对应工艺步骤，同时避免了对巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系的破坏。
22.4、本发明将构建的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系应用于对治疗关节炎的中药附子活性成分的垂钓筛选，利用巨噬细胞膜上受体为关节炎治疗活性成分识别载体，实现了对附子中抗炎活性成分的垂钓，从而确定了附子中抗炎活性成分。
23.下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
附图说明
24.图1为本发明实施例1得到的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的透射电镜表征图。
25.图2为本发明实施例1得到的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的磁滞回归线。
26.图3为本发明实施例1得到的荧光共聚焦图。
27.图4为本发明实施例1得到的附子提取物溶液a0、空白对照液a4和垂钓液a5的超高效液相色谱-质谱分析色谱图。
具体实施方式
28.实施例1本实施例包括以下步骤：步骤一、fe3o4@bsa-rdg磁性纳米颗粒的合成步骤101、fe3o4磁性纳米颗粒的合成：在全程氮气保护下，首先将1.0g乙酰丙酮铁在磁力搅拌下溶解于20ml由油胺与油酸等体积配制的混合溶液中，得到乙酰丙酮铁溶液，然后将90ml的n-甲基吡咯烷酮加入到250ml的三口烧瓶中，在转速为600rpm的机械搅拌下加热至200℃回流1h，再采用注射器将乙酰丙酮铁溶液逐滴加入到加热回流后的n-甲基吡咯烷酮中进行反应1h，冷却至室温后经磁分离、洗涤，得到fe3o4磁性纳米颗粒；步骤102、fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的合成：将120mg牛血清白蛋白和70mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到盛有50ml的pbs缓冲溶液的圆底烧瓶中，在室温下搅拌15min得到bsa溶液，然后将100mg步骤101中得到的fe3o4磁性纳米颗粒加入到bsa溶液中继续搅拌反应24h，再依次经磁分离、洗涤和冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包覆的fe3o4磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa磁性纳米颗粒；步骤103、fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的合成：将40mg步骤102中得到的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散在48ml去离子水中，并加入2ml的ph7.4的pbs超声分散10min，得到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液，然后将230mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液中在避光条件下以600rpm的转速搅拌30min，继续加入50mg的n-羟基琥珀酰亚胺在避光条件下以1000rpm的转速搅拌1h，再加入15ml浓度为1mg/ml的rgd溶液在室温避光条件下以1000rpm的转速搅拌进行反应24h，经磁分离、洗涤，得到rgd修饰的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒；步骤二、完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备步骤201、将巨噬细胞（raw264.7）以4
×
105个/皿的密度接种于盛有dmem培养基的直径100mm的培养皿中，共接种10皿，放入37℃、5%co2恒温培养箱中培养至细胞密度为70%~80%，弃去培养液后以150μg/ml的接种量加入到含有步骤一中fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的dmem培养基中在37℃、5%co2恒温培养箱中进行共培养6h，得到共培养液；步骤202、采用胰酶消化步骤201中得到的共培养液，经磁分离收集负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞，将1
×
107个负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞以300μg/ml的浓度重悬于含有fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液吸入到电穿孔比色皿中并置于冰块上孵育10min，再采用电穿孔仪（biorad gene pulser xcell）进行电穿孔，电穿孔的脉冲电压300v，脉冲时间20ms，脉冲间隔时间5s，连续脉冲4次，并立即转入冰浴中，加入预热的培养基并转入直径150mm的培养皿后放入培养箱
中进行培养1h，经dmem培养基洗涤3次后，移除没有结合的fe3o4@bsa-rdg磁性纳米颗粒，得到负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的巨噬细胞，即完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠raw-fe3o4@bsa-rdg；步骤三、垂钓中药附子活性成分步骤301、制备附子提取物：称取20g附子采用200ml纯净水浸泡1h后煎煮2h，趁热经四层纱布一次过滤得到一次滤液和一次残渣，将一次残渣采用200ml纯净水煎煮1h，趁热经四层纱布二次过滤得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液并进行减压浓缩，得到1g/ml的附子提取物浓缩液，取附子提取物浓缩液加灭菌注射用水稀释后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到1mg/ml附子提取物溶液记为a0；采用超高效液相色谱-质谱法对附子提取物溶液a0中的化学成分进行分析，分析的具体条件为：液相色谱为agilent1290 infinity 液相色谱系统，柱温30℃，色谱柱使用acquity uplc hss t3 c
18
柱（2.1mm
ꢀ×ꢀ
100mm，1.7μm）色谱柱，流动相a为0.1%的甲酸水溶液，流动相b为0.1%的甲酸乙腈，采用梯度洗脱，梯度设置如下：第0~2min，5%-5%b，第2min~13min，5%-95%b，第13min~15 min，95%-95%b，平衡色谱柱5 min, 流速400μl/min，进样量为4μl；质谱为agilent公司6530 accurate-mass q-tofms串联四极杆-飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源（esi），质谱采用正离子模式进行检测，检测参数：毛细管电压3500v、干燥气流速11l/min、干燥气温度350℃、喷雾气压45psig、碎裂电压120v、skimmer电压60v、数据采集范围m/z 50~1000；分析得到的附子提取物溶液a0的超高效液相色谱-质谱分析色谱图如图4所示，得到的附子提取物溶液a0中化学成分的分析结果如表1所示，表1
从表1可知，附子提取物溶液a0中共有18种化学成分；步骤302、将1ml步骤一中得到的附子提取物溶液a0加入到9ml步骤二中制备的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠悬浮制得的悬浮液中，并放入培养箱中在37℃进行培养2h，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，收集上清液记为a1，沉淀经1ml的pbs缓冲液冲洗后收集上清液记为a2，重复洗脱两次，对应收集的上清液分别记为a3和a4，由于最后一次冲洗后非特异性吸附都被洗脱，上清液中基本无杂质，将上清液a4视为空白对照液a4，最后加入1ml甲醇轻轻振摇10min，经磁力固液分离得到含有附子化学成分的垂钓液记为a5，将空白对照液a4和垂钓液a5在12000rpm转速下进行离心，得到的上清液分别按照步骤301中超高效液相色谱-质谱法的条件进行分析，得到的空白对照液a4和垂钓液a5中超高效液相色谱-质谱分析色谱图如图4所示，采用agilent mass hunter软件提取离子色谱图的功能（extracted ion chromatography，eic），对步骤301中附子提取物溶液a0的18种化学成分在空白对照液a4和垂钓液a5中化学成分的离子色谱图中进行提取离子分析，质量窗为
±
20 ppm，得到附子活性成分。
29.图1为本实施例得到的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的透射电镜表征图，从图1可知，该fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的平均粒径为41nm
±
3nm。
30.图2为本实施例得到的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的磁滞回归线，通过室温下振动样品磁强计（vsm）测定得到，从图2可知，该完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠呈现出良好的超顺磁性，矫顽力和剩磁均近似为零，其饱和磁化强度约为45.7emu/g，因此，该具有超顺
磁性的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠在外加磁场下会被磁化，产生很大的磁性，一旦撤去外加磁场则无剩磁，这一特性使得完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠在分离垂钓作用于巨噬细胞膜的活性成分具有很大的应用价值。
31.将本实施例得到的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒采用罗丹明b荧光染料处理，使其负载罗丹明b荧光染料，得到负载罗丹明b荧光染料的fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒，然后进行步骤二中巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备工艺，得到完整巨噬细胞膜包覆负载有罗丹明b的纳米磁珠；将完整巨噬细胞膜包覆负载有罗丹明b的纳米磁珠接种于激光共聚焦培养皿中培养1晚，然后取样本采用4%的多聚甲醛固定，再用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）进行细胞核染色，用dio细胞膜绿色荧光探针进行细胞膜染色，并使用激光共聚焦显微镜（leica tcs sp8）记录图像，其中，采用405nm激光对dapi细胞核染色样本进行激发，采用488nm激光对dio细胞膜染色样本进行激发，采用552nm激光对fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒中负载的罗丹明b荧光染料进行激发，分别对相应波长范围的荧光进行收集，得到的荧光共聚焦图如图3所示。
32.图3为本实施例得到的荧光共聚焦图，图中的标尺均为10μm，从图3可以看出，dapi对应的细胞核染色样品激发后显示蓝色荧光，dio对应的细胞膜染色样品激发后显示绿色荧光，fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒中负载的罗丹明b荧光染料激发后显示红色荧光，而完整巨噬细胞膜包覆负载有罗丹明b的纳米磁珠（图中的merge图片）激发后外部呈绿色荧光，内核呈蓝色荧光，且内核夹杂红色荧光，说明本实施例采用电穿孔方法制备的完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠中fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒已经进入巨噬细胞膜的内部，且巨噬细胞膜的结构完整，膜的外表面朝外，从而保证了细胞膜表面受体的结构及活性，增加了细胞膜外表面靶点的配体结合域，有利于提高对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度。
33.图4为本实施例得到的附子提取物溶液a0、空白对照液a4和垂钓液a5的超高效液相色谱-质谱分析色谱图，从图4可知，附子提取物溶液a0对应有18个色谱峰（峰1~峰18），空白对照液a4中没有任何附子化学成分相关的色谱峰，而垂钓液a5中对应提取到3个明显的色谱峰（峰7，峰15，峰16），经与表1结果对比可知，峰7、峰15、峰16代表的宋果灵、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头碱即为附子化学成分中的活性成分。
34.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。