一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法及其应用

技术特征：
1.一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、fe3o4@bsa-rdg磁性纳米颗粒的合成步骤101、fe3o4磁性纳米颗粒的合成：在全程氮气保护下，首先将乙酰丙酮铁在磁力搅拌下溶解于油胺与油酸的混合溶液中，得到乙酰丙酮铁溶液，然后将n-甲基吡咯烷酮在机械搅拌下加热回流，再将乙酰丙酮铁溶液逐滴加入到加热回流后的n-甲基吡咯烷酮中进行反应，冷却至室温后经磁分离、洗涤，得到fe3o4磁性纳米颗粒；步骤102、fe3o4@bsa磁性纳米颗粒的合成：将牛血清白蛋白和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在室温下搅拌得到bsa溶液，然后将步骤101中得到的fe3o4磁性纳米颗粒加入到bsa溶液中继续搅拌反应，再依次经磁分离、洗涤和冷冻干燥，得到牛血清白蛋白包覆的fe3o4磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa磁性纳米颗粒；步骤103、fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的合成：将步骤102中得到的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散在去离子水中，并加入pbs超声分散，得到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液，然后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到fe3o4@bsa磁性纳米颗粒分散液中在避光条件下搅拌，继续加入n-羟基琥珀酰亚胺在避光条件下搅拌，再加入rgd在室温避光条件下搅拌进行反应，经磁分离、洗涤，得到rgd修饰的fe3o4@bsa磁性纳米颗粒即fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒；步骤二、完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠的制备步骤201、将巨噬细胞接种于dmem培养基中，放入恒温培养箱中培养至细胞密度为70％～80％，弃去培养液后加入到含有步骤一中fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中进行共培养，得到共培养液；步骤202、采用胰酶消化步骤201中得到的共培养液，经磁分离收集负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞，将负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的细胞重悬于含有fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的培养基中得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液吸入到电穿孔比色皿中并置于冰块上孵育，再采用电穿孔仪进行电穿孔，并立即转入冰浴中，加入预热的培养基后放入培养箱中进行培养，经dmem培养基洗涤后，得到负载fe3o4@bsa-rgd磁性纳米颗粒的巨噬细胞，即完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠raw-fe3o4@bsa-rdg；步骤三、垂钓中药活性成分步骤301、制备中药提取物；步骤302、将步骤二中制备的raw-fe3o4@bsa-rdg悬浮后得到悬浮液，然后将步骤301中制备的中药提取物加入到悬浮液中，并放入培养箱中进行培养，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，沉淀经缓冲液冲洗后采用有机溶剂振摇洗脱，经磁力固液分离得到含有中药活性成分的垂钓液。2.根据权利要求1所述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤101中所述加热回流采用的转速为600rpm，温度为200℃，时间为1h。3.根据权利要求1所述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤103中所述加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐后搅拌采用的转速为600rpm，时间为30min，加入n-羟基琥珀酰亚胺搅拌采用的转速为1000rpm，时间为1h，加入rgd后搅拌采用的转速为1000rpm，时间为24h。
4.根据权利要求1所述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤201中所述培养的条件为：37℃、5％co2恒温培养箱；所述共培养的条件为：37℃、5％co2恒温培养箱，时间为6h。5.根据权利要求1所述的一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，其特征在于，步骤202中所述电穿孔的参数为：脉冲电压300v，脉冲时间20ms，脉冲间隔时间5s，连续脉冲4次。6.一种如权利要求1～5中任一权利要求所述的基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法的应用，其特征在于，该方法在垂钓附子活性成分的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一、将附子采用纯净水浸泡后煎煮，趁热经纱布一次过滤得到一次滤液和一次残渣，将一次残渣采用纯净水煎煮，趁热经纱布二次过滤得到二次滤液和二次残渣，合并一次滤液和二次滤液并进行减压浓缩，得到附子提取物浓缩液，将附子提取物浓缩液稀释后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌得到附子提取物溶液，对附子提取物溶液中的化学成分进行分析；步骤二、将步骤一中得到的附子提取物溶液加入到raw-fe3o4@bsa-rdg悬浮制得的悬浮液中，并放入培养箱中进行培养，再将培养液经磁力固液分离获得沉淀，沉淀经pbs缓冲液洗脱后采用溶剂甲醇振摇洗脱，经磁力固液分离得到含有附子化学成分的垂钓液，对垂钓液中的化学成分进行分析，并根据步骤一中获得的附子提取物溶液中的化学成分进行提取离子分析，得到附子活性成分。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用超高效液相色谱-质谱法对步骤一中附子提取物溶液中的化学成分和步骤二中垂钓液中的化学成分进行分析，分别得到附子提取物溶液和垂钓液的化学成分的离子色谱图，然后进行提取离子分析，得到附子活性成分。

技术总结
本发明公开了一种基于电穿孔的细胞膜包覆磁珠垂钓中药活性成分的方法，该方法包括：一、采用包覆和修饰合成Fe3O4@BSA-RDG磁性纳米颗粒；二、采用电穿孔制备完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠；三、垂钓中药活性成分；本发明还公开了上述方法在垂钓附子活性成分的应用。本发明通过合成生物相容性好兼具膜靶向的Fe3O4@BSA-RGD磁性纳米颗粒，并与靶细胞巨噬细胞共培养后进行电穿孔，构建完整巨噬细胞膜包覆纳米磁珠体系，保证了细胞膜的结构完整性和外表面朝外，相对传统包覆方法不区分膜外/内表面朝向，增加垂钓载体表面靶点数量，提高了对中药活性成分筛选的准确性和灵敏度；本发明的应用实现了对附子中抗炎活性成分的垂钓。用实现了对附子中抗炎活性成分的垂钓。用实现了对附子中抗炎活性成分的垂钓。


技术研发人员：张雅 谭光国 周倩 廖文婷 王超丽
受保护的技术使用者：中国人民解放军空军军医大学
技术研发日：2022.02.25
技术公布日：2022/5/31