试剂盒及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及免疫检测分析技术领域，特别涉及一种试剂盒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.sflt-1(可溶性fms样酪氨酸激酶-1)是血管内皮生长受体-1(fms-like tyrosine kinase receptor 1，flt-1)的稀有剪接形式，仅保留了配体结合区域，而不具有酪氨酸激酶活性，分子量63.6kd，在妊娠过程中，由滋养细胞产生。国内外的医学研究表明，sflt-1通过影响促血管形成因子vegf(血管内皮生长因子)和pigf(胎盘生长因子)的作用抑制血管生成；pe(先兆子痫)患者胎盘中vegf及pigf表达降低，并推断由于vegf家族蛋白表达减少影响胎盘滋养细胞的分化、侵袭，甚至导致胎盘缺氧反应，由此推断，sflt-1通过拮抗vegf及pigf的生物学作用，参与pe的发病。与正常孕妇比较，sflt-1血液浓度在pe症状出现5周前即显著升高，而pigf浓度则于妊娠13～16周出现下降。因此，孕妇血清中sflt-1及pigf浓度对pe的预测作用即成为研究热点。目前的研究表明，sflt-1/plgf可做为诊断和预测pe的一项有效参数。sflt-1/plgf的增加与临床需要分娩密切相关。sflt-1/plgf适用于高风险子痫前期患者的密切监测，帮助临床决策。
3.sflt-1含量的测定方法有多种，目前主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、化学发光免疫反应法等。免疫比浊法此方法对样本要求较高，抗干扰能力差，对于溶血样本、血脂样本会出现较大测试偏差，且灵敏度比较低；荧光免疫层析法简便高效易操作，不需要大型仪器，但由于膜介质的限制，存在着测试偏差大，易受环境影响，且灵敏度较低等缺陷。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种试剂盒及其制备方法和应用，旨在提供一种灵敏度高、稳定性和重复性好、抗干扰能力强的用于检测可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的试剂盒。
5.为实现上述目的，本发明提出一种试剂盒，用于检测可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量，所述试剂盒包括：
6.第一试剂，包括链霉亲和素磁珠和第一稀释液；
7.第二试剂，包括酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体和第二稀释液；
8.第三试剂，包括标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素和第三稀释液；
9.校准品以及发光底物。
10.可选地，所述第一稀释液包括缓冲剂、表面活性剂、蛋白质、防腐剂、盐类、氨基酸、糖类和高分子聚合物。
11.可选地，所述缓冲剂为2-吗啉乙磺酸，所述第一稀释液中2-吗啉乙磺酸的浓度为20mm～100mm；和/或，
12.所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100和曲拉通x405中的任意一种，所述
第一稀释液中表面活性剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)；和/或，
13.所述蛋白质为牛血清白蛋白，所述第一稀释液中牛血清蛋白的浓度1％～3％(w/v)；和/或，
14.所述防腐剂为proclin300；和/或，
15.所述盐类为nacl；和/或，
16.所述氨基酸为甘氨酸，所述第一稀释液中甘氨酸的浓度为0.05％～0.2％(w/v)；和/或，
17.所述糖类为海藻糖或者蔗糖，所述第一稀释液中糖类的浓度为0.1％～2％(w/v)；和/或，
18.所述高分子聚合物为经bsa修饰的peg，所述第一稀释液中高分子聚合物的浓度为0.01％～2％(w/v)。
19.可选地，所述第一稀释液包括：50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、1％牛血清白蛋白(w/v)、0.1％甘氨酸(w/v)、0.5％海藻糖(w/v)和0.05％经bsa修饰的peg(w/v)，所述第一稀释液的ph值为6.5。
20.可选地，所述第二稀释液包括：50mm～100mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％～0.2％吐温20(v/v)、0.1％的proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1％～3％牛血清白蛋白(w/v)；和/或，
21.所述第一稀释液的ph为6.5～8.0；和/或，
22.所述第二稀释液的ph为6.5～7.2；和/或，
23.所述第三稀释液包括50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，所述第三稀释液的ph值为6.8。
24.可选地，所述第二稀释液包括：50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，所述第二稀释液的ph值为6.8；和/或，
25.所述第一试剂中，链霉亲和素磁珠的浓度为0.05mg/ml～0.2mg/ml；和/或，
26.所述第一试剂中，所述链霉亲和素磁珠的粒径为1.5μm。
27.可选地，所述第二试剂中，酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的酶为碱性磷酸酶；和/或，
28.所述第三试剂中，标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素的浓度为0.1ug/ml～0.3ug/ml。
29.可选地，所述校准品为添加可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗原的缓冲液；和/或，
30.所述发光底物为amppd。
31.本发明进一步提出一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
32.将链霉亲和素磁珠加入到第一稀释液中混合均匀后，磁分离清洗，再重悬于第一稀释液中，得第一试剂；
33.将可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体活化后，与酶溶液混合反应并纯化后，制得酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，将酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与第二稀释液混合均匀，得第二试剂；
34.将nhs-lc-生物素溶解至二甲基亚砜中形成nhs-lc-生物素溶液，将可溶性fms样
酪氨酸激酶-1加入pbs缓冲液中混合均匀，并与所述nhs-lc-生物素溶液混合反应后，提纯得标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素，将标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素与第三稀释液混合均匀，得第三试剂。
35.本发明进一步提出一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测方法，采用如上所述的试剂盒，所述可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测方法包括以下步骤：
36.将待测样本与第二试剂混合均匀，并加入第一试剂和第三试剂，混和孵育，得到混合物；
37.将所述混合物磁分离并清洗后，加入发光底物，混合均匀，得到待测液；
38.检测所述待测液的发光强度；
39.根据发光强度计算可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量。
40.本发明提供的技术方案中，使用酶促化学发光免疫分析法，并且采用一步法反应模式，根据双抗体夹心法的原理，在外加磁场作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗磁微粒复合物，加入发光底物，通过发光仪检测反应的发光强度，发光强度与待测抗原含量呈正比，使用相应的计算方法即可计算出样本中待测抗原的浓度。通过这种酶促化学发光免疫分析法，提供一种具有很高的检测灵敏度，检测结果稳定、重复性好、灵敏度高、抗干扰能力强的检测试剂盒。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
42.图1为本发明实施例一步法封闭和二步法封闭对比图；
43.图2为本发明实施例1试剂盒的线性范围检测结果图；
44.图3为本发明实施例1试剂盒的临床样本测试比对图。
具体实施方式
45.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
47.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
48.sflt-1含量的测定方法有多种，目前主要有免疫比浊法、荧光免疫层析法、化学发光免疫反应法等。免疫比浊法此方法对样本要求较高，抗干扰能力差，对于溶血样本、血脂样本会出现较大测试偏差，且灵敏度比较低；荧光免疫层析法简便高效易操作，不需要大型
仪器，但由于膜介质的限制，存在着测试偏差大，易受环境影响，且灵敏度较低等缺陷。
49.鉴于此，本发明提出一种试剂盒及其制备方法和应用，旨在提供一种灵敏度高、稳定性和重复性好、抗干扰能力强的用于检测可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的试剂盒。
50.在本发明提供的试剂盒的一实施例中，所述试剂盒，用于检测可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量，所述试剂盒包括：第一试剂，包括链霉亲和素磁珠和第一稀释液；第二试剂，包括酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体和第二稀释液；第三试剂，包括标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素和第三稀释液；校准品以及发光底物。
51.本发明提供的技术方案中，使用酶促化学发光免疫分析法，并且采用一步法反应模式，根据双抗体夹心法的原理，在外加磁场作用下，将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离。去上清后清洗磁微粒复合物，加入发光底物，通过发光仪检测反应的发光强度，发光强度与待测抗原含量呈正比，使用相应的计算方法即可计算出样本中待测抗原的浓度。本发明采用的是链霉亲和素-nhs-lc-生物素系统，放大信号值，能有效提高试剂的灵敏度。通过这种酶促化学发光免疫分析法，提供一种具有很高的检测灵敏度，检测结果稳定、重复性好、灵敏度高、抗干扰能力强的检测试剂盒。
52.酶促化学发光法相对于其他类型发光来说，反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果，有利于信号的检测，提供了试剂盒的灵敏度和特异性性能。本发明的试剂盒结构简单，成本低廉，大大降低了生产成本。且其操作简单，更能提高检测效率。此外，亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白水解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，在此应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。
53.对于第一稀释液、第二稀释液及第三稀释液的成分，本发明不做限制，优选地，第一稀释液包括缓冲剂、表面活性剂、蛋白质、防腐剂、盐类、氨基酸、糖类和高分子聚合物。第一稀释液中包括以上物质，能有效提升试剂盒的灵敏度、稳定性、重复性及抗干扰能力。
54.具体地，所述缓冲剂为2-吗啉乙磺酸(mes)，所述第一稀释液中2-吗啉乙磺酸的浓度为20mm～100mm；所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通100和曲拉通x405中的任意一种，所述第一稀释液中表面活性剂的浓度为0.01％～0.1％(v/v)；所述蛋白质为牛血清白蛋白(bsa)，所述第一稀释液中牛血清蛋白的浓度1％～3％(w/v)；所述防腐剂为proclin300；所述盐类为nacl；所述氨基酸为甘氨酸，所述第一稀释液中甘氨酸的浓度为0.05％～0.2％(w/v)；所述糖类为海藻糖或者蔗糖，所述第一稀释液中糖类的浓度为0.1％～2％(w/v)；所述高分子聚合物为经bsa修饰的peg，其分子量为5000～20000，所述第一稀释液中高分子聚合物的浓度为0.01％～2％(w/v)。上述物质的选择可以只满足其中一个，也可以同时满足，而作为本发明的优选实施例，上述物质同时满足，得到的试剂盒的灵敏度最高。
55.需要说明的是，v/v表示体积的比，例如表面活性剂的浓度为0.01％，表示100ml的第一稀释液中包括0.01ml的表面活性剂；w/v表示质量体积比，单位为g/ml，例如牛血清蛋白的浓度1％，表示100ml的第一稀释液中包括1g的牛血清蛋白，下文中类似，不再详述。
56.优选地，所述第一稀释液包括：50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、1％牛血清白蛋白(w/v)、0.1％甘氨酸(w/v)、0.5％海
藻糖(w/v)和0.05％经bsa修饰的peg(w/v)。
57.上述物质及配比下，得到的试剂盒测试效果更佳，其中0.05％peg(w/v)为带氨基基团的，分子量为5000～20000，根据peg是聚乙二醇，高分子聚合物，经过也是一种分散剂，其有一定的促聚性，可以促进反应中的抗原和抗体的结合，因其带有氨基基团，在经过bsa修饰后，其在该试剂盒中，该物质可以明显提高其信号值，对其灵敏度的提高起到比较明显的作用。设计试验验证得到其稀释液添加0.05％经bsa修饰的peg和未添加，测试其试剂盒的反应性，数据如下表1。其添加0.05％经bsa修饰的peg对其信号值的提升有近一倍，试剂盒灵敏度得到了明显的提高。
58.表1经bsa修饰的peg的添加对试剂盒灵敏度的影响
59.稀释液未添加经bsa修饰的peg添加0.05％经bsa修饰的peg浓度(pg/ml)发光值(rlu值)发光值(rlu值)0141316951005287010338910006247261176959
60.对于第二稀释液，优选地，所述第二稀释液包括：50mm～100mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％～0.2％吐温20(v/v)、0.1％的proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1％～3％牛血清白蛋白(w/v)。上述物质及配比下，得到的试剂盒测试效果更佳。
61.进一步地，所述第二稀释液包括：50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％的proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，上述物质及配比下，得到的试剂盒测试效果最佳。
62.对于第三稀释液，优选地，所述第三稀释液包括50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)。上述物质及配比下，得到的试剂盒测试效果更佳。
63.本发明对于第一稀释液和第二稀释液的ph也不做限制，优选地，所述第一稀释液的ph为6.5～8.0；所述第二稀释液的ph为6.5～7.2，更优选地，所述第一稀释液的ph为6.5；所述第二稀释液的ph为6.8，所述第三稀释液的ph为6.8，上述ph值有利于提高可溶性fms样酪氨酸激酶-1含量检测的准确性。
64.对于第一试剂中链霉亲和素磁珠的浓度和粒径，本发明不做限制，优选地所述第一试剂中，链霉亲和素磁珠的浓度为0.05mg/ml～0.2mg/ml，上述浓度下，检测结果准确。优选地，所述第一试剂中，所述链霉亲和素磁珠的粒径为1.5μm。上述粒径下，较易形成双抗体夹心结构。
65.此外，优选地，第二试剂的酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的酶为碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如atp，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的alp来说，其最适ph是8.0，而对来源于牛的alp则是8.5。
66.对于第三试剂中，nhs-lc-生物素为琥珀酰亚胺-6-(生物素酰氨基)-己酸，标记可
溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素的浓度，本发明也不做限制，所述第三试剂中，标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素的浓度为0.1ug/ml～0.3ug/ml。上述浓度下，检测结果准确。
67.此外，优选地，在制备标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素时，可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与nhs-lc-生物素的摩尔比为1:10，上述配比下，检测结果准确。
68.进一步地，本发明实施例中，所述校准品为添加可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗原的缓冲液，采用上述校准品，测试结果准确。
69.此外，优选地，所述发光底物包括amppd。amppd为1，2-二氧环已烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。在通常情况下，这种化合物很稳定。
70.本发明进一步提出一种如上所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
71.s10、将链霉亲和素磁珠加入到第一稀释液中混合均匀后，磁分离清洗，再重悬于第一稀释液中，得第一试剂。
72.本步骤用以制备第一试剂，以下给出本步骤的一具体实施方式：
73.取10mg链霉亲和素磁珠，加入1ml第一稀释液(50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、1％牛血清白蛋白(w/v)、0.1％甘氨酸(w/v)、0.5％海藻糖(w/v)和0.05％经bsa修饰的peg(w/v)，ph值为6.5)，磁分离清洗，重复清洗3次，再重悬第一稀释液中，使用第一稀释液稀释为链霉亲和素磁珠浓度为0.05mg/ml～0.2mg/ml，即为第一试剂。
74.s20、将可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体活化后，与酶溶液混合反应并纯化后，制得酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，将酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与第二稀释液混合均匀，得第二试剂。
75.具体地，在本发明实施例中，步骤s20的操作如下：
76.取100ul的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，加入250ul浓度为0.1m，ph值为7.0的pbs缓冲液，混匀，加入20ul新配置的10.0mg/ml edc水溶液，活化30分钟，然后加入200ul浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用含1％bsa的0.1m，ph值为7.4的tris缓冲液室温封闭反应30min，再加入0.5％磷酸二乙脂于室温下继续反应30min，用30kd的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20度备用，制得酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体。取酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，用第二稀释液(50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8)按1:2000倍稀释，即为第二试剂。
77.其中，磷酸二乙脂作为二次修饰封闭剂，作用是修饰封闭反应，因其磷酸根离子对其第二试剂酶标试剂的稳定性有很明显的帮助，但其溶液中的磷酸根离子会影响碱性磷酸酶与底物的反应，第二试剂的稀释液一般选择mes缓冲液作为缓冲剂，而非pbs缓冲液。但其磷酸根离子对其稳定性有益，所以选择在碱性磷酸酶标记抗体时加入磷酸二乙酯进行磷酸
化封闭处理，以达到稳定性增强作用，而又不会对其与底物反应的影响
78.本发明采用一步法封闭(tris缓冲液)和二步法封闭(tris缓冲液 磷酸二乙酯)进行对比实验进行标记抗体，标记后制备成第二试剂。将第二试剂均分为5份，其中一份置于2～8℃保存至冰箱，另外4份分别置于37℃恒温箱加速1天、3天、5天、7天。待加速结束后拿出平衡至室温，使用相同的第一试剂、第三试剂，测试3个浓度水平样本，评价其稳定性的差异。
79.试验结果见图1，其二步法封闭(tris缓冲液 磷酸二乙酯)加速衰减率明显低于一步法封闭(tris缓冲液)，其稳定性明显要优于一步法封闭，其二步法封闭信号值要稍低于一步法封闭，但其影响不是很大，能满足性能要求。
80.s30、将nhs-lc-生物素溶解至二甲基亚砜中形成nhs-lc-生物素溶液，将可溶性fms样酪氨酸激酶-1加入pbs缓冲液中混合均匀，并与所述nhs-lc-生物素溶液混合反应后，提纯得标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素，将标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素与第三稀释液混合均匀，得第三试剂。
81.以下给出本步骤的一具体实施方式：
82.称量1mgnhs-lc-生物素，加入二甲基亚砜(dmso)溶解至10mm，取100ug可溶性fms样酪氨酸激酶-1，使用20mm pbs缓冲液(0.05％triton x-100)稀释至1mg/ml，加入1.4ul 10mmnhs-lc-生物素溶液(抗体、nhs-lc-生物素摩尔比为1:20)，混匀后置于常温反应30min，反应结束后加入1％体积的0.1m的tris-hcl进行终止反应30min，反应结束后，透析去除多余的nhs-lc-生物素。回收透析液，添加等体积的甘油保存，得标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素。将标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素用第三稀释液稀释至浓度为0.1ug/ml-0.3ug/ml，即为第三试剂。
83.所用的nhs-lc-生物素及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同，选择不当则影响标记的效率，应先用几个不同的分子比来筛选最适条件，得表2。过量的nhs-lc-生物素也是不利的，抗原的结合位点可能因此被封闭，导致抗体失活。本实例优选的抗体、nhs-lc-生物素比例为1:20，其随着比例的提高，信号值也在提高，在1:20的摩尔比到达平台期，再往上提高摩尔比，其由于空间位阻受限，其信号值呈降低趋势。故本实例优选抗体、nhs-lc-生物素比例为1:20。
84.表2不同抗体、nhs-lc-生物素摩尔比对发光值的影响
[0085][0086][0087]
由于抗体的氨基不易接近可能造成nhs-lc-生物素化不足，此时可加入表面活性剂triton x-100，triton x-100在溶液中可以加速抗体分子和nhs-lc-生物素分子的碰撞，
这对nhs-lc-生物素化反应的偶联效率有很明显的提高。本实施方案选择几个表面活性剂对进行比较筛选，得表3。其结果显示偶联缓冲液添加0.05％triton x-100对其偶联效率有明显提高，信号值得到明显增强。
[0088]
表3不同表面活性剂对偶联效率的影响
[0089]
偶联缓冲液pbs缓冲液pbs缓冲液 0.05％triton x-100浓度(pg/ml)发光值(rlu值)发光值(rlu值)01389152410052763822461000652257928135
[0090]
可以理解的是，上述第一试剂、第二试剂及第三试剂的制备步骤不分先后顺序，也即本发明对于步骤s10、s20及s30的先后顺序不做限制。
[0091]
本发明提出的试剂盒的制备方法，简单便捷，且具备了上述试剂盒的全部有益效果，在此不再一一赘述。
[0092]
本发明进一步提出一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测方法，采用如上所述的试剂盒，所述可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测方法包括以下步骤：
[0093]
s100、将待测样本与第二试剂混合均匀，并加入第一试剂和第三试剂，混和孵育，得到混合物；
[0094]
s200、将所述混合物磁分离并清洗后，加入发光底物，混合均匀，得到待测液；
[0095]
s300、检测所述待测液的发光强度；
[0096]
s400、根据发光强度计算可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量。
[0097]
以下给出本发明实施例可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测方法的一实施例：
[0098]
取血清为待测样本，以全自动化学发光仪(cl-2000)为检测工具，加入20μl的待测样本与100μl第二试剂、再加入50μl第一试剂、50ul第三试剂孵育5min，进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入发光底物300μl后，将反应杯移到光电模块中采集光电值，仪器自动转换为浓度，显示测试结果。
[0099]
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0100]
实施例1试剂盒
[0101]
第一试剂：链霉亲和素磁珠和第一稀释液[50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、1％牛血清白蛋白(w/v)、0.1％甘氨酸(w/v)、0.5％海藻糖(w/v)和0.05％经bsa修饰的peg(w/v)，ph值为6.5]，链霉亲和素磁珠的浓度为0.05mg/ml，链霉亲和素磁珠的粒径为1.5μm；
[0102]
第二试剂：酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体和第二稀释液[50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8]，酶为碱性磷酸酶；
[0103]
第三试剂：标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素和第三稀释液[50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8]，标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的
nhs-lc-生物素的浓度为0.1ug/ml，可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与nhs-lc-生物素的摩尔比为1:20；
[0104]
发光底物：amppd；
[0105]
校准品：添加可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗原的缓冲液。
[0106]
实施例2试剂盒
[0107]
第一试剂：链霉亲和素磁珠和第一稀释液[100mm 2-吗啉乙磺酸、0.01％吐温80(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、3％牛血清白蛋白(w/v)、0.05％甘氨酸(w/v)、0.1％蔗糖(w/v)和0.01％经bsa修饰的peg(w/v)，ph值为8.0]，链霉亲和素磁珠的浓度为0.2mg/ml，链霉亲和素磁珠的粒径为1.5μm；
[0108]
第二试剂：酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体和第二稀释液[100mm 2-吗啉乙磺酸、0.2％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.5]，酶为碱性磷酸酶；
[0109]
第三试剂：标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素和第三稀释液[50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8]，标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素的浓度为0.3ug/ml，可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与nhs-lc-生物素的摩尔比为1:20；
[0110]
发光底物：amppd；
[0111]
校准品：添加可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗原的缓冲液。
[0112]
实施例3试剂盒
[0113]
第一试剂：链霉亲和素磁珠和第一稀释液[20mm 2-吗啉乙磺酸、0.1％曲拉通100(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、2％牛血清白蛋白(w/v)、0.2％甘氨酸(w/v)、2％海藻糖(w/v)和2％经bsa修饰的peg(w/v)，ph值为8.0]，链霉亲和素磁珠的浓度为0.1mg/ml，链霉亲和素磁珠的粒径为1.5μm；
[0114]
第二试剂：酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体和第二稀释液[75mm 2-吗啉乙磺酸、0.1％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和3％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为7.2]，酶为碱性磷酸酶；
[0115]
第三试剂：标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素和第三稀释液[50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8]，标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素的浓度为0.2ug/ml，可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体与nhs-lc-生物素的摩尔比为1:20；
[0116]
发光底物：amppd；
[0117]
校准品：添加可溶性fms样酪氨酸激酶-1抗原的缓冲液。
[0118]
实施例4试剂盒的制备
[0119]
根据实施例1的配比的物质制备试剂盒，包括以下步骤：
[0120]
(1)第一试剂的制备：取10mg链霉亲和素磁珠，加入1ml第一稀释液(50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)、1％牛血清白蛋白(w/v)、0.1％甘氨酸(w/v)、0.5％海藻糖(w/v)和0.05％经bsa修饰的peg(w/v)，ph值为
6.5)，磁分离清洗，重复清洗3次，再重悬第一稀释液中，使用第一稀释液稀释为链霉亲和素磁珠浓度为0.05mg/ml，即为第一试剂。
[0121]
(2)第二试剂的制备：取100ul的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，加入250ul浓度为0.1m，ph值为7.0的pbs缓冲液，混匀，加入20ul新配置的10.0mg/ml edc水溶液，活化30分钟，然后加入200ul浓度为5mg/ml的碱性磷酸酶溶液混匀，室温避光保存2小时后取出，用含1％bsa的0.1m，ph值为7.4的tris缓冲液室温封闭反应30min，再加入0.5％磷酸二乙脂于室温下继续反应30min，用30kd的超滤柱除盐纯化，收集的剩余体积溶液加一半甘油，保存于-20度备用，制得酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体。取酶标记的可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体，用第二稀释液(50mm 2-吗啉乙磺酸、0.05％吐温20(v/v)、0.1％proclin300(v/v)、0.9％nacl(w/v)和1.5％牛血清白蛋白(w/v)，ph值为6.8)按1:2000倍稀释，即为第二试剂。
[0122]
(3)第三试剂的制备：称量1mgnhs-lc-生物素，加入二甲基亚砜(dmso)溶解至10mm，取100ug可溶性fms样酪氨酸激酶-1，使用20mm pbs(0.05％triton x-100)缓冲液稀释至1mg/ml，加入1.4ul 10mmnhs-lc-生物素溶液，混匀后置于常温反应30min，反应结束后加入1％体积的0.1m的tris-hcl进行终止反应30min，反应结束后，透析去除多余的nhs-lc-生物素。回收透析液，添加等体积的甘油保存，得标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素。将标记可溶性fms样酪氨酸激酶-1单克隆抗体的nhs-lc-生物素用第三稀释液稀释至浓度为0.1ug/ml，即为第三试剂。
[0123]
实施例2和3的试剂盒的制备方法类似，在此不再赘述。
[0124]
实施例5可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测
[0125]
取血清为待测样本，以全自动化学发光仪(cl-2000)为检测工具，加入20μl的待测样本与100μl第二试剂、再加入50μl第一试剂、50ul第三试剂孵育5min，进行磁分离清洗，清洗完后仪器自动加入发光底物300μl后，将反应杯移到光电模块中采集光电值，仪器自动转换为浓度，显示测试结果。
[0126]
1、灵敏度的检测
[0127]
参照clsi ep17-a文件推荐的实验方案，计算实施例1的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)酶促测定试剂盒的灵敏度，取浓度为零的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)校准品为检测样本进行检测，重复测定20次，计算其均值m和标准差sd值，取一相邻校准品重复测试3次，计算其均值，根据零浓度检测样本与相邻校准品之间的浓度-rlu值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将m 2sd的rlu值带入上述方程中，得出可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sflt-1)测定试剂盒的灵敏度为10pg/ml。
[0128]
2、线性范围
[0129]
将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为50000pg/ml(
±
20％)、40000pg/ml(
±
20％)、30000pg/ml(
±
20％)、20000pg/ml(
±
20％)、10000pg/ml(
±
20％)、10pg/ml(
±
40％)6个浓度梯度，其中低值浓度样本须接近线性范围下限。将每一浓度样本用实施例1的试剂盒重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，分别得表4和图2所示。
[0130]
表4实施例1试剂盒的线性范围检测结果
[0131][0132]
计算得线性相关系数r＝0.9995，该试剂盒的线性范围为10～50000pg/ml，具体地，图2中横坐标为理论浓度值(pg/ml)，纵坐标为测试浓度值(pg/ml)，线性方程为y＝1.014x-224.09，线性良好。
[0133]
3、临床样本测试比对
[0134]
用实施例1的试剂盒与罗氏公司试剂盒同时检测66例临床血清。其检测结果见图3。以罗氏试剂盒测得的结果为横坐标x，浓度为pg/ml，以本发明实施例1的试剂盒测定的结果作为纵坐标y，浓度单位为pg/ml，作回归方程，相关方程为：y＝0.9801x 15.169，相关系数为0.9986，k值为0.9801，其相关性很好。
[0135]
4、重复性测定
[0136]
取实施例1的试剂盒在已经用校准品成功校准的测试仪器上按操作程序检测浓度分别为2500pg/ml(
±
20％)和10000pg/ml(
±
20％)的重复性样本，各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值m和标准差sd，根据公式cv＝sd/m
×
100％得出变异系数cv，测试结果如下表5。
[0137]
表5实施例1的试剂盒的重复性测定
[0138][0139]
由表5可以看出，实施例1的试剂盒的标准差sd和变异系数cv较小，说明试剂盒测试的重复性较好。
[0140]
5、抗干扰能力测定
[0141]
取实施例1的试剂盒，参考clsi有关标准，对甘油三脂、胆红素、血红蛋白、总蛋白、
rf、hama等内源性干扰物质以及不同抗凝剂对检测的影响进行评估，根据评估，其结果如下表6所示。
[0142]
表6实施例1的试剂盒的抗干扰能力测定
[0143]
干扰物添加浓度测试结果的相对偏差胆红素10mg/dl
±
10％以内血红蛋白500mg/dl
±
10％以内甘油三酯1000mg/dl
±
10％以内总蛋白10g/dl
±
10％以内类风湿因子1000iu/ml
±
10％以内hama40ng/ml
±
10％以内
[0144]
由表6可以看出，本发明实施例1的试剂盒对于甘油三脂、胆红素、血红蛋白、总蛋白、rf、hama等内源性干扰物质的抗干扰能力较强。
[0145]
综上所述，本发明提出的试剂盒，在检测可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量时，灵敏度和准确度高、稳定性和重复性好，抗干扰能力强，可广泛应用于可溶性fms样酪氨酸激酶-1的含量的检测中。
[0146]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。