融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒

融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒
1.本技术是pct申请号为pct/us2016/041639的pct国际申请进入中 国国家阶段后申请号为201680047665.5、申请日为2016年7月8日、发 明名称为“融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒”的中国发明专利申请的分 案申请。
[0002][0003][0004]
技术领域
[0005]
本发明涉及递送系统，并且更具体来说，用于向靶细胞或靶组织递送 药物、核酸以及肽的融合脂质体纳米颗粒组合物。


背景技术：

[0006]
体内基因递送由于低效率或细胞毒性而仍是一项挑战。细胞内吞是大 部分的纳米平台的主要摄取途径，这会引起遗传物质的溶酶体降解和低的 治疗功效。


技术实现要素：

[0007]
本公开提供了一种可生物降解的脂质体多孔硅纳米颗粒系统，所述系 统可以经由脂质体-质膜融合而绕过内吞摄取。不同于大部分目前研究的允 许内吞摄取其所有的有效负载的纳米颗粒递送系统，膜融合允许亲水性有 效负载从脂质体的核心直接释放到细胞质中；疏水性分子从脂质体双层转 移到细胞膜双层；以及脂质体的外表面上缀合的部分(抗体、小分子、肽等) 转移到细胞膜表面。
[0008]
公开了脂质体多孔硅颗粒以及它们的合成方法和应用。脂质体可以负 载亲脂性有效负载，并且被聚(乙二醇)(peg)和其它表面部分(靶向肽、抗 体、适体等)官能化以经由融合将它们转移到细胞膜中和细胞膜上。基于多 孔硅的核心可以截留大量的有效负载(小分子、蛋白质、核酸)，并且将它 们直接递送到靶细胞的细胞质中；绕过细胞内吞可以增加治疗的递送和治 疗功效。已经证实了与lipofectamine(脂质体)相当的体外敲低效率。
[0009]
本公开提供了一种融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒，所述纳米颗粒 包含具有多个孔的纳米结构的含硅核心材料，所述材料包含(a)含硅核心； (b)与所述核心化学连接的多孔表面；(c)与含硅核心材料物理缔合的多个被 运载分子；和(d)金属硅酸盐；以及所述含硅核心材料周围的融合脂质体包 被。在一个实施方案中，所述融合脂质体包含1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3
‑ꢀ
磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙 二醇)-2000](dspe-peg)、以及1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)。 在另一个实施方案中，所述含硅核心是基本上氧化的硅或完全氧化的硅。 在前述实施方案中的任一个的又另一个实施方案中，所述金属硅酸盐包括 硅酸钙或硅酸镁。在另一个实施方案中，所述金属硅酸盐在所述含硅核心 上形成壳。在又另一个实施方案中，在含硅核心与硅酸钙或硅酸镁壳层之 间不存在间隙。在另一个实施方案中，所述多个孔被化学或物理配置成容 纳被运载分子。在又另一个实施方案中，孔表面的化学氧化结合硅酸钙或 硅酸
镁壳的形成使得物理截留多个被运载分子。在再另一个实施方案中， 所述多个孔容纳药物。在另一个实施方案中，所述多个孔容纳非药物物质。 在另一个实施方案中，所述含硅核心包含这样的分子，所述分子通过使用 所述多个孔被物理吸附或共价截留、或附着到所述多个孔，并且其中所述 含硅核心由含钙或镁的壳包被，所述壳是通过在所述分子存在下被添加到 所述主体材料(host material)中的钙离子或镁离子的水溶液的作用形成的。 在又另一个实施方案中，所述融合脂质体包含dmpc、dotap、以及 dspe-peg(甲氧基)的混合物。在另一个实施方案中，所述融合脂质体包含 dmpc、dotap、以及dspe-peg(羧基)的混合物。在另一个实施方案中， 所述融合脂质体包含dmpc、dotap、以及dspe-peg(顺丁烯二酰亚胺) 的混合物。在又另一个实施方案中，所述含硅核心材料具有约10nm-100 nm范围的流体动力学直径。在另一个实施方案中，所述融合脂质体具有 约100nm-400nm范围的流体动力学直径。在再又另一个实施方案中，靶 向分子与融合脂质体包被缀合。在一个实施方案中，抗体与融合脂质体包 被缀合。在另一个实施方案中，疏水性被运载分子被负载在融合脂质体包 被中。在又另一个实施方案中，亲水性被运载分子被截留在含硅核心的多 个孔内。在再另一个实施方案中，疏水性试剂/被运载分子存在于融合包被 中并且亲水性试剂/被运载物存在于含硅核心的多个孔中。在另一个实施方 案中，核酸被运载分子被截留在含硅核心的多个孔内。在另一个实施方案 中，小分子被运载分子被截留在多孔含硅核心的多个孔内。
[0010]
本公开还提供了一种向细胞递送核酸有效负载的方法，所述方法包括 使所述细胞与含有核酸的本公开的融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒接 触。
[0011]
本公开还提供了一种治疗眼睛的疾病或病症的方法，所述方法包括向 眼睛中或在眼睛的表面上递送本公开的融合脂质体包被的多孔硅纳米颗 粒。
[0012]
本公开还提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向体内递送 本公开的融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒。
[0013]
本公开还提供了一种用于治疗细菌感染的方法，所述方法包括向体内 递送本公开的融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒。
[0014]
本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于附图和以下的说明中。根 据所述说明和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的以及优势将 是显而易见的。
附图说明
[0015]
图1a-h示出了代表本公开的实施方案的示意图。(a)示出了本公开的 融合脂质体包被的多孔硅纳米颗粒的作用的示意图。(b)示出了使钙包被的 多孔硅(psi)负载阴离子有效负载。阴离子有效负载和阳离子金属硅酸盐沉 积的psinp通过静电相互作用形成簇。(c)示出了将“负载的”psi加载到阳 离子脂质体中。有效负载-psi簇经由静电相互作用和机械挤出被封装到阳 离子融合脂质体中。(d)描绘了用靶向肽修饰脂质体。靶向肽或抗体可以经 由化学结合与功能性peg缀合。(e)示出了颗粒的低倍放大图。使用tecnaitem成像。通过乙酸铀酰进行负染色。比例尺表示500nm。(f)示出了颗 粒的高倍放大图，显示浑浊脂质体包被在深色和致密的基于多孔硅的核心 的周围。使用jeol 1200ex tem成像。通过2％pta负染色。比例尺表 示200nm。(g)通过dls测量的粒度和ζ-电位的表(n＝3)。(h)示出了本公 开的颗粒的示意图。
[0016]
图2示出了多孔硅纳米颗粒的药物负载的示意图。
[0017]
图3示出了负载被运载物的硅酸钙包被的多孔硅纳米颗粒(ca-psinp) 的示意图。
[0018]
图4a-i示出了共聚焦显微镜术和透射电子显微镜术。(a-f)j771a.1的 共聚焦显微镜术；(a)在与负载dii的f-psi一起孵育10分钟之后的 j771a.1；(b)在与lysotracker red(溶酶体红色示踪探针)一起孵育1小时并 且与具有钙黄绿素的f-psi一起孵育10分钟之后的j774a.1；(c)在与负载 dii的、与mtp-fam缀合的f-psi一起孵育5分钟之后的j774a.1；(d)在 与负载dii的nf-psi一起孵育10分钟之后的j771a.1；(e)在与lysotrackerred一起孵育1小时并且与具有钙黄绿素的nf-psi一起孵育10分钟之后 的j774a.1；(f)在与负载dii的、与mtp-fam缀合的nf2-psi一起孵育5 分钟之后的j774a.1。(g-i)在与颗粒一起孵育1小时之后的hela细胞的透 射电子显微镜术(tem)；(g)非融合脂质体包被的颗粒位于囊泡(内体/溶酶 体)中。插图示出了颗粒的胞饮摄取。比例尺表示1μm；(h)融合脂质体包 被的颗粒位于细胞质中。比例尺表示500nm；以及(i)融合脂质体包被的颗 粒位于细胞质中。比例尺表示1μm。
[0019]
图5a-b示出了在与颗粒一起孵育1小时之后的neuro2a细胞的共聚 焦显微镜术；(a)融合脂质体在细胞膜中显示出dii信号，这表明融合摄取； (b)非融合脂质体以明显的集中点在细胞质中显示出dii信号，这表明内吞 摄取。
[0020]
图6示出了与融合脂质体包被的颗粒一起孵育长达8小时的hela细 胞的共聚焦显微镜术。
[0021]
图7示出了与非融合脂质体包被的颗粒一起孵育长达8小时的hela 细胞的共聚焦显微镜术。
[0022]
图8a-b示出了(a)在第0天感染后和在第1天注射治疗剂(pbs、 nf-siirf5-mtp、f-siluc-mtp、以及f-siirf5-mtp)后的小鼠存活率。每 一组具有n＝6只小鼠。(b)在第0天感染后和在第1天注射治疗剂后小鼠的 平均存活天数。误差棒表示标准偏差。单因素方差分析和图凯氏hsd事 后检验(tukey's hsd post hoc test)(α＝0.05)揭示了f-siirf5-mtp与三个对 照组(pbs、nf-siirf5-mtp、以及f-siluc-mtp)之间的显著性差异。
[0023]
图9示出了通过dls对融合脂质体包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒 (f-capsi)和rvg缀合的融合脂质体包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒 (rvg-f-capsi)的平均流体动力学直径进行的长达一个月的观测。
[0024]
图10示出了融合脂质体包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒(f-ca-psi)和未 包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒(ca-psi)中负载的钙黄绿素的吸光度(虚线) 和发射(实线)光谱。
[0025]
图11示出了在psinp和cacl2(或mgcl2)溶液的反应时间期间获得的 光致发光光谱。
[0026]
图12示出了在与颗粒一起孵育之后的neuro2a细胞和hela细胞的共 聚焦显微镜术；左上图：在与负载亲脂性荧光染料dii的融合脂质体包被 的颗粒一起孵育1小时之后的neuro2a细胞；右上图：在与负载细胞不可 渗透染料钙黄绿素的融合脂质体包被的颗粒一起孵育8小时之后的hela 细胞；左下图：在与负载亲脂性荧光染料dii的非融合脂质体包被的颗粒 一起孵育1小时之后的neuro2a细胞；右下图：在与负载细胞不可渗透染 料钙黄绿素的非融合脂质体包被的颗粒一起孵育8小时之后的hela细胞。
[0027]
图13a-b示出了在与颗粒一起孵育1小时之后的neuro2a细胞的共聚 焦显微镜术；
(a)rvg缀合的融合脂质体(rvg-f)显示出rvg成功地靶向 细胞和高水平的融合染色；(b)与rvg缀合的颗粒相比，没有缀合rvg的 融合脂质体(f)以相对更低的水平显示出融合。
[0028]
图14示出了来自将颗粒在neuro2a小鼠成神经细胞瘤细胞中孵育48 小时的sirna基因敲低结果。f-ca-psi-sippib：负载针对ppib的sirna 的融合脂质体包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒；nf-ca-psi-sippib：负载针 对ppib的sirna的非融合脂质体包被的硅酸钙多孔硅纳米颗粒； f-ca-psi-siluc：负载针对荧光素酶的sirna的融合脂质体包被的硅酸钙 多孔硅纳米颗粒。
[0029]
图15a-k示出了在匀浆的金黄色葡萄球菌(staph.aureus)感染的 balb/c肺中钙黄绿素积聚的facs分析。(a)pbs相比于负载钙黄绿素(cal) 并且与靶向肽(mtp)缀合的nf-psi；(b)pbs相比于负载钙黄绿素而没有靶 向肽的f-psi。(c)pbs相比于负载钙黄绿素并且与mtp缀合的f-psi。(d-k) 被成像用于荧光检测负载dii的颗粒的、未染色的健康或受感染的肺组织 切片。
具体实施方式
[0030]
除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所用的单 数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。因此，举例来说，提到“一 孔”时，包括多个这样的孔，并且提到“所述抗原”时，包括提到本领域技术 人员已知的一种或多种抗原，诸如此类。
[0031]
此外，除非另外说明，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含 (comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包 括(includes)”以及“包括(including)”是可互换的并且不意图具限制性。
[0032]
应当进一步了解的是，在对各种实施方案的说明使用术语“包含”的情 况下，本领域技术人员应当了解，在一些特定情况下，可以替代地使用语 言“基本上由
……
组成”或“由
……
组成”来描述一个实施方案。
[0033]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含 义与本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。尽管在实施 所公开的方法和组合物时可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同 的方法和材料，但在本文中描述了示例性方法、装置以及材料。
[0034]
提供上文以及贯穿全文所论述的出版物仅仅是因为其在本技术的申 请日之前公开。本文的任何信息并不被理解为承认本技术的发明人无权因 在先的公开而先于所述公开。
[0035]
用于体内治疗的基因递送系统由于低效率或细胞毒性而仍是一项挑 战。细胞内吞是大部分的纳米平台的主要摄取途径，这会引起遗传物质的 溶酶体降解和低的治疗功效。
[0036]
多孔硅和氧化硅已经因它们的无机和可生物降解的性质而被研究作 为许多应用中的候选药物递送载体材料。多孔纳米结构可以容纳治疗剂、 诊断剂、或其它有益的物质(在本文有时被称作“有效负载”)。然而，这些 有效负载在施用之前或施用后的提前释放对于预期目的来说可能是不期 望的。此外，多孔硅或多孔氧化硅在除目标位点以外的位点处在水性条件 下降解对于持续药物递送、体内或体外成像、以及生物传感器应用已经引 起了显著的问题，这可以从多孔硅核心周围的保护性包被受益。
[0037]
基于脂质的纳米颗粒最初是在三十年前以(封装多柔比星的脂 质体)的形式获得食品和药物管理局(food and drug administration，fda) 批准的。用于急性成淋巴细胞性白血病的硫酸长春新碱的脂质体制剂 最近在2012年获得批准，并且几种紫杉醇(paclitaxel)和顺铂 (cisplatin)制剂，例如endotag-1和spi-077正处在临床试验中。这样的连 续投资脂质体制剂的原因归因于它们的主要优势：生物相容性、易于合成、 以及表面可修饰性。
[0038]
脂质纳米颗粒由于低的负载效率和高溶酶体降解率而难以递送遗传 物质。负载小干扰rna(sirna)的脂质纳米颗粒在质子泵、mtor、以及 组织蛋白酶激活的情况下经由网格蛋白介导的内吞和巨胞饮/微胞饮而由 细胞摄取。在摄取之后，在包括纳米颗粒的脂质在晚期内体/溶酶体阶段经 由c1型尼曼-匹克蛋白(niemann-pick type c1，npc1)调节被再循环之后， 约70％的内化的sirna从细胞中被胞吐出。只有1％-2％的sirna能够从 早期内体中逃逸到胞质中。因此，绕过晚期内体/溶酶体中的脂质再循环的 递送系统在实现高治疗功效方面是至关重要的。
[0039]
通过电化学手段或化学手段制备纳米多孔硅、微孔硅、中孔硅以及大 孔硅是业已成熟的，将所述材料部分或完全转化成相应的纳米多孔氧化 硅、微孔氧化硅、中孔氧化硅、以及大孔氧化硅也是成熟的。此外，脂质 体是本领域已知的和认可的。
[0040]
本公开提供了一种可生物降解的脂质体多孔硅(psi)纳米颗粒系统，所 述系统可以经由脂质体-质膜融合而绕过内吞摄取(参见例如图1a)。膜融合 允许亲水性有效负载从脂质体的核心直接释放到细胞质中以及疏水性分 子从脂质体双层转移到细胞膜双层中。此外，脂质体多孔硅纳米颗粒系统 允许脂质体的外表面上缀合的部分(抗体、小分子、肽等)转移到细胞膜表 面。多孔硅核心具有光致发光特性，从而允许这些颗粒通过使用时间门控 发光成像被用作追踪工具。此外，多孔硅允许高度阴离子遗传物质凝聚成 小的簇，从而允许脂质体容易地封装颗粒和容纳在所述颗粒的孔中的任何 有效负载。本公开证实了融合脂质体包被的psi颗粒与细胞膜融合并且将 各种有效负载转移到细胞中。举例来说，本公开证实了融合脂质体包被的 psi颗粒成功地与neuro2a小鼠成神经细胞融合，并且将亲脂性dii染料从 脂质体膜转移到细胞膜。相反，非融合psi颗粒在细胞中的小群组中被发 现，所述小群组指示内体摄取和溶酶体定位。此外，neuro2a靶向部分狂 犬病病毒糖蛋白(rvg)的表面缀合允许脂质体psi的加速融合速率。总体 而言，脂质体多孔硅纳米颗粒表现出作为高度有效的递送载体的潜力。
[0041]
如本文所用的术语“微粒”或“纳米颗粒”、“微粒和/或纳米颗粒”、
ꢀ“
lpsinp”以及“psinp”指的是至少部分地包含二氧化硅并且尺寸范围为数 纳米至数百微米的多孔硅材料。通常，所述尺寸是约10nm-20nm至1微 米。多孔硅材料/颗粒的几何形状可以是球形、椭圆形、正方形、矩形、立 方形等。
[0042]
应当了解的是，在此，“多孔氧化硅”指的是含有通用化学计量式为 siox的硅和氧的物质，其中x可以小到0.01以及大到2，并且“多孔硅”指 的是由元素硅(呈它的结晶状态或无定形状态)构成的物质，所述物质具有 包含含氢、含氧、或含碳物质的表面。在此，术语“多孔硅”或“多孔氧化硅
”ꢀ
指的是含有微孔(孔径通常小于约2nm)、中孔(孔径通常在约2nm-50nm 的范围)、或大孔(孔径大于约50nm)、或任何两种或全部三种孔类型的组 合的材料。此外，应当了解的是，多孔材料的表面，包括内孔壁的表面， 可以包含含氢、含氧、或含
碳的物质。
[0043]
本公开提供了可以携带待递送到细胞或组织中的一种或多种分子的 多孔硅微粒和/或纳米颗粒(psinp)。所述分子可以是诊断剂和/或治疗剂。 在一些实施方案中，所述分子是抗癌剂、抗炎剂、小分子药物、肽、多肽、 核酸(例如sirna)等。
[0044]
此外，与许多微材料和纳米材料(例如碳纳米管(cnt)、金纳米颗粒 (gn)、以及量子点(qd))相反，psinp在相对短的时间内降解成肾清除组分 而有很少或没有毒性迹象。此外，与许多生物源性递送系统相反，纳米颗 粒单独(无添加的激活复合物或分子)不诱导免疫应答。
[0045]
含有所期望的有效负载(例如核酸、肽、小分子等)的多孔硅微粒和/或 纳米颗粒可以被封装到脂质体(融合或非融合)中。脂质体可以被修饰成具 有靶标特异性或可以是未修饰的(参见例如图1)。
[0046]
因此，本公开提供了一种可生物降解的多孔微结构和/或纳米结构，其 包含被封装在脂质体囊泡中的硅材料。在一个实施方案中，所述硅材料包 括二氧化硅材料。在另一个实施方案中，所述硅材料包括硅材料和二氧化 硅材料这两者。在另一个实施方案中，所述可生物降解/生物相容的多孔纳 米结构包括约0.01μm至1μm的粒度。在又另一个实施方案中，所述可生 物降解/生物相容的多孔结构可以被表征为无毒的。在又另一个实施方案 中，所述多孔硅材料负载有“有效负载”材料。所述有效负载材料可以是药 物、小分子、诊断剂、治疗剂、肽、抗体、抗体片段、多肽、核酸(例如sirna) 等。
[0047]
本公开还提供了一种制备多孔硅颗粒的方法，所述方法包括(1)电化学 蚀刻硅晶片以产生多孔结构的膜；(2)将所述多孔结构的膜从所述硅晶片衬 底上剥离；(3)使所述多孔膜破碎以产生10纳米至1000纳米尺寸的微粒和 /或纳米颗粒；以及(4)在水溶液中活化所述结构。在一个实施方案中，所述 水溶液包含纯水。在一个实施方案中，所述水溶液包含氢氧化钠、过氧化 氢或硼酸盐。
[0048]
举例来说，多孔硅纳米颗粒(psinp)可以如qin等(part.part.syst. charact.31(2):252-256,2014；其公开内容以引用的方式并入本文)所述来制 备。简单地说，通过恒电流阳极蚀刻结晶硅晶片来制备多孔硅。通过在长 时间的低电流蚀刻期间高电流的短周期性脉冲引入沿蚀刻平面的穿孔，产 生高孔隙度和低孔隙度交替的层。通过在稀hf水溶液中施加低电流密度 脉冲从晶片上去除多孔硅层，并且通过超声处理使所得的独立膜破碎。这 产生具有预定孔隙度和平均孔径的多孔纳米颗粒。孔隙度和孔径的可调性 可用于确定后续有效负载加载过程的效率。
[0049]
在具有有效负载的实施方案中，可以将多孔硅颗粒放置在含有有效负 载和1m或更大浓度的例如氯化钙(cacl2)溶液的水溶液中。将溶液混合并 且通过离心纯化，从而产生负载被运载物的硅酸钙包被的多孔硅纳米颗粒 (ca-psinp-被运载物)。作为对照，无有效负载的硅酸钙包被的多孔硅纳米 颗粒(ca-psinp)可以通过与上文所述相同、但是不包括所添加的有效负载 溶液的方式制备。图1b、图2-图3阐明了负载被运载物的硅酸钙包被的 多孔硅纳米颗粒。
[0050]
对本领域技术人员来说将显而易见的是，可以使用其它实施方案来产 生ca-psinp，一个实例涉及用化学染色蚀刻代替用于产生多孔硅核心的电 化学蚀刻，并且另一个实例利用通过化学还原纳米结构的氧化硅所制备的 多孔硅核心。染色蚀刻使用硅粉代
替硅晶片作为硅前体，并且使用化学氧 化剂代替电源来驱动电化学反应。在一些情况下，可能期望用硝酸钙、亚 硝酸钙、葡萄糖酸钙、或其它钙离子源代替氯化钙。硝酸钙或亚硝酸钙由 于硝酸根离子和亚硝酸根离子的氧化性质而可以比氯化钙更快地氧化多 孔硅。
[0051]
在一个实施方案中，所述多孔硅颗粒可以是发光的。本公开提供了一 种产生发光多孔si纳米颗粒(lpsinp)的方法。所述方法包括通过在水性 hf/乙醇电解质中施加约200ma/cm2的恒定电流密度对p型硅晶片进行电 化学蚀刻。然后通过在水性hf/乙醇电解质中施加约4ma/cm2的电流脉冲 从结晶硅衬底去除所得的独立的多孔硅纳米结构膜。随后例如通过超声处 理使独立的氢封端的多孔硅膜破碎，然后过滤以获得所期望的粒度。可以 通过离心和色谱进行尺寸选择所述纳米颗粒的其它方法。将所述纳米颗粒 在去离子(di)水或其它氧化水性环境(例如硼酸盐水性缓冲液)中进一步 孵育以激活它们的发光(例如在一个实施方案中，在近红外范围)。可以使 用各种氧化(或中性至碱性)水性缓冲液。在一些实施方案中，水性缓冲液 选自由以下各项组成的组：水性硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、以及氢 氧化钠。举例来说，在一个实施方案中，硼酸盐水性缓冲液是有用的。然 后可以将所得的lpsinp用所期望的药物试剂或其它因子进一步修饰或负 载。负载或修饰的lpsinp然后可以由脂质体封装/封装到脂质体中。
[0052]
在另一个实施方案中，可以通过首先产生具有2nm-100nm(例如5 nm-10nm、10nm-20nm、20nm-30nm等)的孔径范围的硅层来产生lpsinp 材料。在hf乙醇溶液中将硅层蚀刻至单晶硅基片。通过施加电流脉冲从 si基片去除整个多孔纳米结构。然后将独立的氢封端的多孔硅膜放置在水 溶液中并且通过例如过夜超声处理破碎成多尺寸颗粒。如果需要的话，然 后可以过滤所述颗粒(例如经由0.22μm多孔滤膜或其它的尺寸分离装置) 以获得多孔硅纳米颗粒。举例来说，lpsinp的分离或尺寸控制可以通过 使胶体悬浮液通过物理过滤器、通过将悬浮液离心、通过电泳、通过尺寸 排阻色谱、或通过静电沉淀来实现。将纳米颗粒在氧化水溶液中孵育以激 活它们的发光。
[0053]
在水溶液中进行发光的激活。在激活期间，氧化硅在氢封端的多孔硅 表面上生长，从而由于量子限制效应和位于si/sio2界面处的缺陷而产生显 著的发光。纳米颗粒的制备条件可以被优化以提供适用于负载治疗剂和所 期望的体内循环时间的孔体积和表面积，同时维持可接受的降解速率。
[0054]
给定膜的厚度、孔径、以及孔隙度是通过电流密度、蚀刻循环的持续 时间、以及蚀刻剂溶液组成来控制的。此外，可以使用多孔硅膜作为模板 以产生生物学上相容的或生物可再吸收的材料的印记。所述多孔硅膜或它 的印记具有正弦变化的孔隙度梯度，从而在光学反射率光谱中提供尖锐的 特征，这可以用于监测孔中截留的化学物质的存在或不存在。
[0055]
对于体内应用，常常期望制备呈颗粒形式的多孔si。可以使用通常被 称为“电抛光”或“剥离”的程序从si基片去除多孔层。将蚀刻电解质替换为 含有更低浓度的hf的蚀刻电解质并且施加电流脉冲几秒。更低浓度的hf 引起扩散受限的情形，该情形以快于孔可以传播的速度从结晶si/多孔si 界面去除硅。结果是多孔层的底切，从而使多孔层从si基片被释放。然后 可以用镊子或剧烈冲洗去除独立的多孔si膜。然后可以通过超声波破碎将 膜转化成微粒。如果具有更均匀形状的颗粒是所期望的，那么也可以使用 常规的光刻法或微滴图案化方法。
[0056]
在电化学蚀刻期间容易调节孔径和孔体积的能力是对于药物递送应 用非常有用
的多孔si的独特特性。其它多孔材料一般需要更复杂的设计方 案来控制孔径，即使如此，可获得的孔径仍倾向于跨越有限的范围。使用 电化学制备的多孔si，通过调整蚀刻期间的电流设置来获得对孔隙度和孔 径的控制。通常，更大的电流密度产生更大的孔。当在孔内并入相当大的 分子或药物时，大孔是所期望的。孔径和孔隙度不仅对于药物负载是重要 的；它还决定了多孔si主体基质的降解速率。
[0057]
更小的孔提供更大的表面积并且暴露更多的位点以被水性介质侵蚀。 膜内更小的多孔丝产生更大的溶解速率，从而提供方便的手段来控制多孔 si主体的降解速率。
[0058]
由于它的高表面积，因此多孔si特别容易受到空气或水氧化。一旦被 氧化，纳米相sio2就容易溶解在水性介质中，并且表面活性剂或亲核试剂 加速该过程。si-o键容易通过氧化在多孔si上制备，并且可以使用多种化 学氧化剂或电化学氧化剂。空气中的热氧化倾向于产生相对稳定的氧化 物，特别是如果在》600℃下进行反应的话。通常在室温下进行的臭氧氧化 形成更加水合的氧化物，所述氧化物在水性介质中快速溶解。
[0059]
通过二甲亚砜(dmso)缓慢氧化多孔si表面——在与通过hf溶解新 形成的氧化物相结合时——是增大多孔si膜中的孔的一种温和的手段。也 可以使用诸如koh的碱的水溶液来增大蚀刻后的孔。其中在诸如h2so4的无机酸存在下将多孔si样品阳极氧化的电化学氧化产生相当稳定的氧 化物。氧化赋予多孔结构以亲水性，从而使得亲水性药物或生物分子能够 在孔内并入和吸附。在包括ca
2
的各种离子存在下进行的液相氧化产生多 孔si的钙化形式，该形式已经被证实为具有生物活性并且对体内应用特别 有意义。可以通过施加dc电流来增强钙化。
[0060]
本公开的融合脂质体包被的纳米颗粒提供了用于药物递送以及组织 和疾病(例如肿瘤)监测的装置和方法。取决于待治疗的病况、组织、或癌 症的类型，药物递送融合脂质体包被的纳米颗粒组合物可以包括许多候选 药物。候选药物可以被“物理地”截留在硅颗粒的孔内，或者孔本身可以被 化学修饰以结合候选药物。这样的药物在一般意义上可以包括肽、多肽、 小分子试剂、核酸以及其组合。
[0061]
更确切地说，“物理截留”类似于在瓶中建船，其中“船”是候选药物并 且“瓶”是多孔si颗粒中的纳米级孔。小分子可以通过氧化分子周围的多孔 si而被截留在多孔基质中。由于硅的氧化将每si原子2个氧原子添加到材 料中，因此在氧化后基质的体积显著增加。这具有使孔壁膨胀和缩小孔内 部的自由体积的作用，并且在适当的条件下，在氧化期间孔中存在的分子 被截留在氧化物基质中。截留过程的一个实施方案是在截留过程期间发生 的活性成分的浓度增加。晶体可以呈现带负电荷的环境并且活性成分—— 例如蛋白质和其它药物——可以在晶体中被浓缩到比溶液中活性成分的 游离浓度高得多的水平。在与晶体缔合时，这可以使得活性成分浓度增加 到10倍至100倍或更大。可以通过进行分层氧化以重复的间隔进行氧化。 举例来说，可以通过氧化剂的受控添加将生物制剂或药物截留在孔中。新 鲜制备(氢化物封端)的多孔si材料的氧化引起孔的有效缩小。这由于所形 成的氧化硅比si起始材料具有更大的体积而发生。如果药物也存在于含有 氧化剂的溶液中，那么药物被截留在孔中。此外，多孔氧化硅可以比非氧 化的氢化硅材料包含更高浓度的生物制剂或药物。
[0062]
多孔si膜中的自由体积通常是50％至80％。氧化应当使该值略微降 低，但是预期自由体积仍是相当高的。大部分的当前药物递送材料是致密 固体并且可以递送小重量百
分比的药物。
[0063]
将分子有效负载加载到多孔si主体中的各种方法已经被研究，并且它 们可以被分成以下一般类别：共价连接、物理截留、以及吸附。
[0064]
共价连接提供了方便的手段以使生物分子捕捉探针与多孔硅的内孔 壁连接以用于生物传感器应用，并且这种方法也可以用于连接药物分子、 肽等。如本文其它地方所述，经由si-c键连接生物分子倾向于是比使用 si-o键更稳定的途径，这是因为si-o物质易受亲核攻击的影响。
[0065]
更常见的方法之一是接枝在末端烯烃的远端上含有羧基物质的有机 分子。烯烃末端参与氢化硅烷化反应，从而键合到si表面并且使羧基末端 游离以用于进一步化学修饰。一种这样的接头分子是十一碳烯酸，它提供 了疏水性的10碳脂族链以使接头与多孔si表面隔离。药物有效负载可以 与烯烃的羧基直接连接，或它可以用peg接头与表面进一步隔开。由于 si-c键的稳定性，因此氢化硅烷化是使有效负载与多孔si连接的良好方 式。有效负载只有在共价键断裂或支撑多孔si基质降解时才会被释放。
[0066]
在又另一个实施方案中，可以使用静电吸附，基本上是更弱地保持分 子的离子交换机制。静电是实现更快速的药物递送的一种有用的手段，这 与经过数日、数周、或数月的时间释放药物的共价或物理截留方法相反。
[0067]
多孔si颗粒对特定分子的亲和力可以使用表面化学来控制。氧化的多 孔si的表面在约2的ph值下具有零电荷点，因此它对所关注的大多数水 溶液呈现带负电荷的表面。在适当的ph值下，多孔sio2自发地吸附带正 电荷的蛋白质，例如血清白蛋白、纤维蛋白原、蛋白a、免疫球蛋白g(igg)、 或辣根过氧化物酶，从而在该过程中将它们浓缩。
[0068]
硅酸钙多孔硅核心可用于提供以高负载效率浓缩阴离子遗传有效负 载以及发射光致发光以允许颗粒追踪的双重作用。硅酸钙是阳离子的，这 允许与阴离子核苷酸进行强烈的静电相互作用以形成稳定的基因和颗粒 的簇。硅酸钙psinp的另一个方面是当摄取后脂质体包被通过膜融合而脱 落时，在细胞间环境中快速分散和降解；来自核苷酸有效负载的浓缩物的 延迟分离或降解可导致整个簇的排泄，这是因为细胞将外来物质识别为不 可操作的。数据已经显示含有核心硅酸钙的融合颗粒psi在细胞质中在没 有脂质体保护的情况下快速降解并且丧失光致发光。另一方面，非融合颗 粒在内体和溶酶体内保持完整，以保持psi光致发光。硅酸钙psinp的快 速降解允许将例如sirna释放到细胞质中以进行rna干扰和基因沉默。
[0069]
多孔si也可以被制备成疏水性的，并且疏水性分子，例如类固醇地塞 米松或血清白蛋白可以被负载到这些纳米结构中。亲水性分子也可以借助 于适当的表面活性剂被负载到这样的材料中。多孔si的天然氢化物表面是 疏水性的。这样的技术已经用于短期负载和释放。由于水从这些疏水表面 被排除，因此水降解和浸出反应趋于缓慢。通过氢化硅烷化将烷烃接枝到 表面通常用于制备在生物介质中稳定的材料；这种稳定性在很大程度上源 自于疏水性部分局部排除水或溶解的亲核试剂的能力。
[0070]
可以与本公开的多孔硅颗粒一起使用的其它药物(例如被运载物)或
ꢀ“
活性成分”包括但不限于以下各项中的任一种或任何组合：抗血管生成化 合物，例如贝伐单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、哌加他尼 (pegaptanib)、以及血管生成级联中的其它化合物。抗癌药物例如像化学治 疗化合物和/或其衍生物(例如5-氟尿嘧啶、长春新
碱、长春花碱 (vinblastine)、顺铂、多柔比星、阿霉素(adriamycin)、他莫昔芬(tamocifen) 等)。还包括了糖皮质类固醇，例如地塞米松、曲安奈德(triamcinoloneacetonide)、氟西奈德(fluocinolone acetonide)以及皮质类固醇和可的松家族 中的其它类似的化合物。还包括了诸如以下各项的化合物：抗酸剂、抗炎 物质、冠状动脉扩张剂、脑扩张剂、外周血管扩张剂、抗感染剂、精神药 物、抗躁狂剂、兴奋剂、抗组胺剂、轻泻剂、减充血剂、维生素、胃肠镇 静剂、止泻制剂、抗心绞痛药、血管扩张剂、抗心律失常剂、抗高血压药、 血管收缩剂和偏头痛治疗、抗凝剂和抗血栓形成药、镇痛剂、退烧剂、催 眠剂、镇静剂、止吐剂、止恶心剂、抗惊厥剂、神经肌肉药、高血糖剂和 降血糖剂、甲状腺和抗甲状腺制剂、利尿剂、解痉剂、子宫松弛剂、矿物 质和营养添加剂、抗肥胖药、合成代谢药、促红细胞生成药、平喘剂、支 气管扩张剂、祛痰剂、止咳剂、粘液溶解剂、影响钙化和骨转换的药物以 及抗尿酸血药。特定的药物包括胃肠镇静剂，例如胃复安(metoclopramide) 和溴化丙胺太林(propantheline bromide)；抗酸剂，例如三硅酸铝、氢氧化 铝、雷尼替丁(ranitidine)以及西咪替丁(cimetidine)；抗炎药，例如保泰松 (phenylbutazone)、吲哚美辛(indomethacin)、萘普生(naproxen)、布洛芬 (ibuprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、双氯芬酸(diclofenac)、地塞米松、泼 尼松(prednisone)以及泼尼松龙(prednisolone)；冠状动脉血管扩张药，例如 三硝酸甘油、二硝酸异山梨醇酯以及季戊四醇四硝酸酯；外周和脑血管扩 张剂，例如梭罗替隆(soloctidilum)、长春胺(vincamine)、草酸萘呋胺 (naftidrofuryl oxalate)、甲磺酸双氢麦角毒碱(co-dergocrine mesylate)、环扁 桃酯(cyclandelate)、罂粟碱以及烟酸；抗感染物质，例如红霉素硬脂酸酯 (erythromycin stearate)、头孢氨苄(cephalexin)、萘啶酸(nalidixic acid)、盐酸 四环素(tetracycline hydrochloride)、氨苄西林(ampicillin)、氟氯西林钠 (flucloxacillin sodium)、扁桃酸乌洛托品(hexamine mandelate)以及马尿酸乌 洛托品；神经安定药，例如氟西泮(flurazepam)、地西泮(diazepam)、替马 西泮(temazepam)、阿米替林(amitryptyline)、多虑平(doxepin)、碳酸锂、硫 酸锂、氯丙嗪(chlorpromazine)、硫利达嗪(thioridazine)、三氟拉嗪 (trifluperazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、派普噻嗪(piperothiazine)、氟哌啶 醇(haloperidol)、盐酸马普替林(maprotiline hydrochloride)、丙咪嗪 (imipramine)以及去甲丙咪嗪(desmethylimipramine)；中枢神经兴奋剂，例 如哌甲酯(methylphenidate)、麻黄碱(ephedrine)、肾上腺素、异丙肾上腺素、 硫酸苯丙胺(amphetamine sulfate)以及盐酸安非他明(amphetaminehydrochloride)；抗组胺药，如苯海拉明(diphenhydramine)、二苯拉林 (diphenylpyraline)、扑尔敏(chlorpheniramine)以及溴苯那敏 (brompheniramine)；止泻药，如比沙可啶(bisacodyl)和氢氧化镁；轻泻药， 琥珀辛酯磺酸钠；营养补充剂，如抗坏血酸、α生育酚、硫胺素(thiamine) 以及吡哆醇(pyridoxine)；解痉药，例如双环胺(dicyclomine)和地芬诺酯 (diphenoxylate)；影响心律的药物，例如维拉帕米(verapamil)、硝苯地平 (nifedipine)、地尔硫卓(diltiazem)、普鲁卡因酰胺(procainamide)、达舒平 (disopyramide)、甲苯磺酸溴苄胺(bretylium tosylate)、硫酸奎尼丁(quinidinesulfate)以及葡萄糖酸奎尼丁；用于治疗高血压的药物，例如盐酸普萘洛尔(propranolol hydrochloride)、单硫酸胍乙啶(guanethidine monosulphate)、甲 基多巴(methyldopa)、盐酸氧烯洛尔(oxprenolol hydrochloride)、卡托普利 (captopril)
以及肼苯哒嗪(hydralazine)；用于治疗偏头痛的药物，例如麦角 胺(ergotamine)；影响血液凝固的药物，如ε-氨基己酸和硫酸鱼精蛋白；镇 痛药，如乙酰水杨酸、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、磷酸可待因(codeinephosphate)、硫酸可待因、氧可酮(oxycodone)、酒石酸二氢可待因、羟可待 酮(oxycodeinone)、吗啡(morphine)、海洛因(heroin)、纳布啡(nalbuphine)、 酒石酸布托啡诺(butorphanol tartrate)、盐酸喷他佐辛(pentazocinehydrochloride)、环佐辛(cyclazacine)、哌替啶(pethidine)、丁丙诺啡 (buprenorphine)、东莨菪碱(scopolamine)以及甲芬那酸(mefenamic acid)；抗 癫痫药，如苯妥英钠(phenytoin sodium)和丙戊酸钠(sodium valproate)；神经 肌肉药，如丹曲林钠(dantrolene sodium)；用于治疗糖尿病的物质，例如甲 苯磺丁脲(tolbutamide)、木瓜凝乳蛋白酶(disbenase)、胰高血糖素以及胰岛 素；用于治疗甲状腺功能障碍的药物，例如三碘甲状腺氨酸 (triiodothyronine)、甲状腺素以及丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)；利尿药，如 呋塞米(furosemide)、氯噻酮(chlorthalidone)、氢氯噻嗪(hydrochlorthiazide)、 螺内酯(spironolactone)以及氨苯蝶啶(triamterene)；子宫松弛药，利托君 (ritodrine)；食欲抑制剂，如盐酸芬氟拉明(fenfluramine hydrochloride)、芬 特明(phentermine)以及盐酸安非拉酮(diethylproprion hydrochloride)；平喘药 和支气管扩张药，例如氨茶碱(aminophylline)、茶碱(theophylline)、沙丁胺 醇(salbutamol)、硫酸奥西那林(orciprenaline sulphate)以及硫酸特布他林 (terbutaline sulphate)；祛痰药，如愈创木酚甘油醚(guaiphenesin)；止咳剂， 例如右美沙芬(dextromethorphan)和诺斯卡品(noscapine)；粘液溶解药，例 如羧甲司坦(carbocisteine)；防腐药，例如氯化十六烷基吡啶、短杆菌素 (tyrothricin)以及洗必泰(chlorhexidine)；减充血药，例如苯丙醇胺 (phenylpropanolamine)和伪麻黄碱(pseudoephedrine)；催眠药，例如氯醛比 林(dichloralphenazone)和硝西泮(nitrazepam)；止恶心药，例如茶氯酸异丙 嗪(promethazine theoclate)；造血药，例如硫酸亚铁、叶酸以及葡萄糖酸钙； 促尿酸排泄药，例如苯磺唑酮(sulphinpyrazone)、别嘌呤醇(allopurinol)以及 丙磺舒(probenecid)；以及影响钙化的药剂，例如双膦酸盐，例如依替膦酸 盐(etidronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、利塞 膦酸盐(residronate)、替鲁膦酸盐(teludronate)、氯膦酸盐(clodronate)以及阿 隆膦酸盐(alondronate)。
[0071]
在本公开考虑了包括几乎无限数量的药物的范围内，可以使用体外药 物代谢动力学研究来确定用于每一种药物的多孔硅颗粒的适当配置。一旦 向受试者递送，就可以监测药物缀合的硅颗粒。举例来说，可以使用低功 率分光光度计测量来自发光硅纳米颗粒(lpsinp)的光强度。使用这样的方 法可以监测药物和/或lpsinp的半衰期、递送以及收集。
[0072]
用于颗粒鉴定的发光光谱可以容易地使用便宜的和便携式的仪器，例 如ccd光谱仪或二极管激光干涉仪来测量。从lpsinp去除药物可以引起 lpsinp的发光的变化，所述变化是光谱中的波长偏移。可以使用这样的 技术来使得能够经由不透明组织进行无创性传感。
[0073]
在前述实施方案中的任一个中，携带被运载物(例如负载或结合药物或 试剂)或不含任何药剂和/或其中颗粒为发光或非发光颗粒的硅颗粒被封装 在适用于与细胞膜融合的脂质体(例如融合脂质体)中。此外，这些脂质体 可以是修饰的或未修饰的。如果被修
饰，那么所述修饰可以包括如本文进 一步所述的靶向部分。
[0074]
融合脂质体制剂可以由许多已知的脂质来制备。脂质体囊泡可以由多 种脂质制成，其中脂质体具有10nm至500nm的直径或其间的任何直径(例 如20nm-400nm、50nm-300nm、60nm-250nm、100nm-200nm、120 nm-180nm、140nm-160nm等)。在另一个实施方案中，脂质体是单层脂 质体或胶束。在另一个实施方案中，脂质体是多层脂质体。在另一个实施 方案中，多种脂质包含选自以下各项的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂 酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、和/或其任何衍 生物。在又另一个实施方案中，磷脂衍生物选自1,2-二-(3,7,11,15-四甲基 十六碳酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2
‑ꢀ
二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二芥 酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二 月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二 月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消 旋-甘油)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油
ꢀ‑
3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基
ꢀ‑
sn-甘油-3-磷酸甘油、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二油 酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基
ꢀ‑
sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、l-α-磷脂酰基-dl-甘油、1,2-二油酰基-sn-甘油-3
‑ꢀ
磷酸丝氨酸、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸酯、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3
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磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油
ꢀ‑
3-磷酸甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸、1,2-二硬脂酰基-sn
‑ꢀ
甘油-3-磷酸酯、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-sn
‑ꢀ
甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油、卵鞘磷脂、卵 pc、氢化卵pc、氢化大豆pc、1-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕 榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-肉豆蔻酰 基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3
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磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2
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油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油
ꢀ‑
3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-硬脂酰基
ꢀ‑
2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、和/或1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷 酸胆碱。在另一个实施方案中，脂质体进一步包含胆固醇。在又另一个实 施方案中，脂质体进一步包含聚乙二醇。举例来说，在一个实施方案中， 融合脂质体制剂可以由1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二 醇)-2000](dspe-peg)、以及1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)以 76.2:3.8:20的摩尔比制备。对于实验对照，非融合制剂可以通过相同的方 式，但是以80:0:20的摩尔比(即缺少peg)来合成。dspe-peg(甲氧基)可 以相同的摩尔比被羧酸-(dspe-peg(羧基))或顺丁烯二酰亚胺
ꢀ‑
(dspe-peg(顺丁烯二酰亚胺))官能化的peg脂质代替以用于进一步表面 修饰，例如使用靶向部分来表面修饰。举例来说，dspe-peg(羧基)或 dspe-peg(顺丁烯二酰亚胺)的使用分别可用于使用抗体或靶向肽修饰。在 另一个实施方案中，脂质体进一步包含一个或多个位点靶向部分。位点靶 向部分的实例包括但不限于肽、适体、抗体、以及抗体片段(例如f(ab')2、 fab、以及scfv)。
[0075]
术语“脂质”指的是产生双层以使得脂质材料的疏水性部分朝向双层定 向，而亲水性部分朝向水相定向的任何合适的材料。两亲性脂质用作主要 的脂质囊泡结构要素。亲水性特征源自于磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、 巯基、硝基、以及其它类似基团的存在。疏水性可以通过包括以下基团而 被赋予，所述基团包括但不限于长链饱和及不饱和脂族烃基、以及被一个 或多个芳族基团、脂环族基团或杂环基团取代的这样的基团。典型的两亲 性化合物是磷酸甘油酯和鞘脂，其代表性实例包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙 醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、 溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基 磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱或二亚油酰基磷脂酰胆碱，它们可以 被使用。缺少磷的其它化合物，如鞘脂和鞘糖脂家族也落入被指定为脂质 的组内。此外，上文所述的两亲性脂质可以与包括甘油三酯和固醇的其它 脂质混合。
[0076]
术语“中性脂质”指的是在生理ph值下以不带电荷的或中性的两性离 子形式存在的许多脂质物质中的任一种。这样的脂质包括例如二酰基磷脂 酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、以及脑苷脂。
[0077]
术语“非阳离子脂质”指的是如上文所述的任何中性脂质以及阴离子脂 质。阴离子脂质的实例包括心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸以及二酰基磷脂 酸。
[0078]
术语“阳离子脂质”指的是在生理ph值下携带净正电荷的许多脂质物 质中的任一种。这样的脂质包括但不限于dodac、dotma、ddab、 dotap、dc-chol以及dmrie。此外，阳离子脂质的许多商业制品是可 获得的，它们可以用于本公开中。通过添加peg修饰的脂质，特别是peg 修饰的神经酰胺脂质来改进这些载体。添加peg修饰的脂质防止了颗粒聚 集并且提供了用于延长循环寿命以及增加脂质-核酸颗粒向靶细胞的递送 的手段。此外，已经发现，阳离子脂质更容易与靶细胞融合并且因此，添 加电中性的peg修饰的神经酰胺脂质不会掩盖或减少载体脂质体的正电 荷。
[0079]
可用于配制脂质体的示例性脂质包括但不限于：
[0080][0081]
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)；
[0082][0083]
1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)；
代磺酸酯、以及乙烯基砜；羧基至胺反应性基团，例如碳二亚胺(例如edc)； 胺反应性基团，例如nhs酯、酰亚胺酯、五氟苯基酯、羟基甲基膦；醛 反应性基团，例如酰肼、和烷氧基胺；光反应性基团，例如二吖嗪 (diazinine)、和芳基叠氮化物；以及羟基(非水性)反应性基团，例如异氰 酸酯。
[0093]
与脂质体的表面结合的靶向部分可以从约125道尔顿-200道尔顿分子 量的小半抗原到具有至少约6kd，但是一般小于106kd的分子量的大得 多的抗原不等。蛋白质配体和受体是特别相关的。由于被并入脂质体中所 含的硅颗粒中的试剂/被运载物关于其作用的细胞类型可以是没有差别的， 因此靶向递送系统相对于随机注射非特异性脂质体提供了显著的改进。
[0094]
可以使用许多程序来使多克隆抗体或单克隆抗体与脂质体双层共价 连接。抗体靶向脂质体可以包括单克隆抗体或多克隆抗体或其片段，例如 scfv、fab或f(ab')2，只要它们有效结合靶细胞上的抗原表位即可。
[0095]
如上所述，本公开还提供了其中融合脂质体包被的纳米颗粒包含靶向 部分/分子的实施方案。靶向部分/分子可以包括但不限于配体或抗体(包括 抗体片段)，它特异性结合它的相应靶标，例如细胞表面上的受体或抗原。 因此，例如，在靶向分子是抗体或其片段的情况下，融合脂质体包被的纳 米颗粒将特异性结合(靶向)带有所述抗体或抗体片段所针对的表位的细胞 和组织。因此，靶向分子一般指的是能够与靶细胞上的受体或多肽(例如它 的同源对)反应或以其它方式识别或结合所述受体或多肽的所有分子。可以 使用任何已知的配体或靶向分子。可以被操纵和克隆或连接以产生融合脂 质体包被的纳米颗粒的靶向肽的实例在文献中有许多。一般来说，可以使 用任何肽配体或其基于所述配体的受体结合序列的片段。在免疫学中，这 样的肽结构域被称为表位，并且术语表位在本文可以用于指受体所能识别 的配体。举例来说，配体包含由靶细胞的表面上的结合配偶体识别的蛋白 质或肽的序列，所述结合配偶体为了方便起见被称作受体。然而，应当了 解的是，出于本公开的目的，术语“受体”涵盖了信号转导受体(例如激素、 类固醇、细胞因子、胰岛素、以及其它生长因子的受体)、识别分子(例如 mhc分子、b细胞受体或t细胞受体)、营养摄取受体(例如转铁蛋白受体)、 凝集素、离子通道、粘附分子、细胞外基质结合蛋白等，它们在靶细胞的 表面处定位并且可及。
[0096]
可以靶向各种细胞类型。举例来说，包括白细胞的抗原提呈细胞(apc) 可以通过制备包含识别apc上的靶标的靶向分子的融合脂质体包被的纳 米颗粒来靶向。在操作中，融合脂质体包被的纳米颗粒结合靶标，与膜融 合，由细胞内化，并且将纳米颗粒的内容物释放到细胞中。可以被靶向或 用作靶向部分的受体的实例包括例如以下受体或以下各项的受体：e-选择 素、cd3、cd 4、cd8、cd11、cd 14、cd 34、cd 123、cd 45ra、cd64、 e-钙粘蛋白、icam-1、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、e-钙粘蛋白、 fc、mch、cd 36和其它整合素、趋化因子、巨噬细胞甘露糖受体和其它 凝集素受体、b7、cd 40、cd 50、cd 80、cd 86和其它共刺激分子、dec-205、 清道夫受体以及toll受体，还参见guermonprez等(annu.rev.immunol., 2002)。
[0097]
本文提供的各种实施方案大体上涉及用于生产药物递送装置的系统 和方法，所述药物递送装置可以递送被运载物以治疗或诊断各种疾病或病 症，包括病毒感染和细菌感染、癌症、肿瘤以及其它细胞增殖性疾病和病 症、炎症性疾病和病症以及组织损伤。此
外，本公开提供了免疫技术，所 述免疫技术结合本公开的硅纳米颗粒加强药物递送或促进药物作用或改 善免疫原加工。这样的方法可以包括激活树突状细胞和其它炎症细胞以及 刺激免疫应答。
[0098]
包含封装硅纳米颗粒和/或微粒的脂质体的组合物可以被配制用于肠 内递送、肠胃外递送、局部递送、或吸入。本公开的含脂质体的硅颗粒可 以被配制用于使用本领域已知的技术进行体外施用和体内施用。
[0099]
本公开的药物组合物被配制成与它的预期施用途径相容。施用途径的 实例包括肠胃外施用，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如吸入)、透 皮(局部)、经粘膜、以及经直肠施用。用于肠胃外、真皮内、或皮下施用 的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶 液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如 苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯 合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以 及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，例如盐酸 或氢氧化钠调节ph值。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安 瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0100]
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在具有水溶性的情况 下)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静 脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(新泽西州 帕西帕尼的巴斯夫公司(basf,parsippany,n.j.))或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。 在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应当是流动到易于通过注射 器施用的程度。它在制造和储存的条件下必须是稳定的并且必须防止微生 物(例如细菌和真菌)的污染。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例 如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及其合适的混合物的溶剂或分散介 质。可以例如通过使用例如卵磷脂的包被、在分散体的情况下通过维持所 需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗 细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫 柳汞等来实现对微生物作用的预防。在很多情况下，有用的是，在组合物 中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可以通 过在组合物中包括延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来使可注射组合物 的吸收延长。
[0101]
无菌可注射溶液可以通过将所需量的脂质体硅颗粒组合物，例如本文 公开的组合物，根据需要连同上文所列举的成分中的一种或组合一起混入 适当的溶剂中，继而过滤灭菌来制备。一般来说，通过将活性化合物混入 到含有基本分散介质和(来自上文所列的那些成分中的)所需的其它成分 的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的 情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些技术产生活性成分 加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所期望的成分的粉末。
[0102]
在一个具体的实施方案中，本公开的一种或多种脂质体制剂是使用将 保护化合物防止从体内快速消除的载体来制备的，例如受控释放制剂，包 括使用聚乙二醇、植入物以及微封装递送系统。可以使用可生物降解的生 物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸 酯、以及聚乳酸。用于制备这样的制剂的方法对本领域技术人员来说应当 是显而易见的。所述材料也可以从阿尔扎公司(alza corporation)和诺瓦制 药公司(nova pharmaceuticals,inc)商购获得。
[0103]
可以使用由细胞培养测定和动物研究所获得的数据来配制用于人类 的一系列剂
量。剂量可以在动物模型中制定以实现包括在细胞培养中所确 定的ic
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(例如实现对症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血 浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定人类中的有用剂量。本公 开的方法和组合物适用于广泛的物种，例如人类、非人类灵长类动物、马、 牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠、以及小鼠。
[0104]
本文公开的脂质体硅颗粒组合物和制剂，包括包含所述制剂的药物组 合物，可以用于治疗需要将肽、小分子、核酸(例如sirna)递送到细胞中 的许多疾病或病症。
[0105]
提供以下工作实施例以说明而非限制本发明。这些实施例中所用的科 学方法的各种参数详细描述于下文中并且总体上为实施本发明提供指导。
[0106]
实施例
[0107]
融合硅纳米颗粒合成。
[0108]
使用76.2:3.8:20的摩尔比的dmpc:dspe-peg:dotap的混合物的脂 质溶液，同时添加21μl的1.25mg/ml的(2z)-2-[(e)-3-(3,3-二甲基-1-十八 烷基吲哚-1
‑‑
2-基)亚丙-2-烯基]-3,3-二甲基-1-十八烷基吲哚(dii)来制备 融合脂质体膜。
[0109]
通过在hf乙醇水溶液中电化学蚀刻单晶硅晶片，继而去除多孔层并 且进行超声波破碎来制备多孔硅纳米颗粒(psinp)。
[0110]
将脂质体混合物干燥成膜，并且用多孔硅或硅酸钙沉积的多孔硅纳米 颗粒溶液水化。在磁力搅拌下将水化的悬浮液加热到40℃，持续20分钟， 并且通过具有200nm孔的聚碳酸酯膜机械挤出二十次。
[0111]
图1b-h示出了颗粒合成示意图和表征数据。融合脂质体包被的 psi(f-psi)的散射和显微镜数据确认了约190nm的流体动力学直径。图 1e-f示出了通过透射电子显微镜术(tem)进行的颗粒表征。
[0112]
药物加载到多孔硅颗粒中。
[0113]
经由硅酸钙密封化学方法将sirna有效负载加载到psi核心簇内达到 约20重量％的负载效率。其它负载寡核苷酸的纳米平台，如基于脂质的纳 米颗粒和介孔二氧化硅-聚合物混合系统具有1重量％-14重量％的平均负 载效率(表1)。具体来说，在这些材料中，尺寸相当的200nm的颗粒只能 负载少于5重量％。因此，本公开的融合多孔硅颗粒显示出寡核苷酸负载 效率四倍的增加，这可以进而增强细胞基因敲低效率。
[0114][0115]
融合颗粒的体外摄取行为
[0116]
将neuro2a细胞与融合脂质体和非融合脂质体一起孵育1小时，并且 在共聚焦显微镜下可视化。融合颗粒将亲脂性dii从脂质体膜转移到质膜 以将细胞轮廓染色，而发现
siirf5-mtp)、负载对照非治疗性sirna的靶向融 合颗粒(f-siluc-mtp)、或负载治疗性sirna的靶向融合颗粒 (f-siirf5-mtp)之前24小时，用金黄色葡萄球菌细菌气管内感染6周大雌 性balb/c小鼠。在处理后观测小鼠的存活率7天，并且记录以获得图8a 中所示的结果。
[0125]
图8b示出了来自每一个处理组的平均存活天数，以及统计显著性。 从单因素方差分析和使用图凯氏hsd检验的事后比较，数据显示接受 f-siirf5-mtp颗粒注射的小鼠具有比所有其它制剂，即pbs、 nf-siirf5-mtp以及f-siluc-mtp显著更高的平均存活天数(p水平《0.05， [f(3,20)＝8.78，p＝0.001])。
[0126]
在所有处理组中，存活超过4天的小鼠显示出正常的健康行为并且没 有明显的痛苦或疾病外在体征。
[0127]
融合硅颗粒稳定性
[0128]
通过dls测量流体动力学直径变化来观测颗粒在磷酸盐缓冲盐水 (pbs)中的稳定性，持续28天(图9)。将融合脂质体包被的颗粒(f-capsi) 挤出到约140nm的初始平均流体动力学直径。rvg与顺丁烯二酰亚胺封 端的peg的缀合(rvg-f-capsi)使尺寸扩大到约180nm。所述尺寸在前7 天内保持高度稳定，之后在随后3周内逐渐增加。
[0129]
抗体缀合的颗粒
[0130]
可以通过与用于靶向肽缀合的相似的peg相互作用使抗体与脂质体 的表面缀合。融合脂质体膜由76.2:3.8:20摩尔比的dmpc:dspe-peg(羧 基):dotap的混合物制成。将混合物干燥成膜，并且用多孔硅或金属(ca) 硅酸盐沉积的多孔硅纳米颗粒溶液水化。在磁力搅拌下将水化的悬浮液加 热到40℃，持续20分钟，并且通过具有200nm孔的聚碳酸酯膜机械挤出 二十次。使抗体的fc区的赖氨酸残基上的胺基与羧基封端的peg缀合以 经由1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/磺基-n-羟基丁二酰亚胺(edc/磺 基-nhs)化学而形成酰胺键。
[0131]
为了验证通过膜融合进行细胞摄取，将亲脂性(2z)-2-[(e)-3-(3,3-二甲 基-1-十八烷基吲哚-1
‑‑
2-基)亚丙-2-烯基]-3,3-二甲基-1-十八烷基吲哚 (dii)荧光染料加载到脂质体膜中。用颗粒对neuro2a细胞进行处理，并且 孵育1小时以进行细胞摄取。融合颗粒能够成功地将亲脂性dii从脂质体 膜转移到质膜，而发现包被有非融合脂质体的颗粒位于细胞质中的不同组 中，这是内体/溶酶体摄取的特征(图12，左图)。
[0132]
随后，研究融合脂质体包被与非融合脂质体包被之间在亲水性有效负 载的细胞内定位方面的差异。使用氯化钙截留将高度阴离子细胞不可渗透 染料钙黄绿素加载到多孔硅核心内，并且封装在融合脂质体和非融合脂质 体中。图10示出了脂质体包被的颗粒中负载的钙黄绿素的吸光度和荧光 光谱。负载钙黄绿素的颗粒的脂质体封装允许荧光发射的去猝灭。
[0133]
还研究了硅酸钙包被的颗粒的光致发光；硅酸钙/氧化硅壳层或硅酸镁 /氧化硅壳层显示出强烈的钝化硅纳米结构的表面的能力，从而使得来自所 述材料的固有光致发光增加。图11示出了在psinp与cacl2(或mgcl2)溶 液之间反应的过程中的不同时间所获得的光致发光光谱。在所述反应期 间，光致发光的强度逐渐增加，这是因为psinp表面上非辐射性载流子陷 阱的钝化。此外，光致发光的峰值波长随着反应进展而显示出显著的蓝移。 这两个现象(光致发光强度的增加和光致发光光谱的蓝移)均表明硅纳米晶 体上钝化表面
层的生长。所观测到的蓝移是量子限制纳米颗粒的典型特 征，它的发射波长强烈地依赖于尺寸并且预期随着量子限制硅域变得更小 而发生蓝移。由于它与主体硅基质密切相关，因此纳米构建体的固有光致 发光可以用于在体外实验或体内实验中监测基质的降解，并且通过推断来 监测有效负载的释放。
[0134]
用颗粒对hela细胞进行处理并且在共聚焦显微镜下随时间推移可视 化。图12上的右图示出了在孵育8小时之后颗粒的细胞摄取。观测到融 合脂质体包被的颗粒将钙黄绿素有效负载释放到细胞质中，并且使它们分 散在整个细胞中。缺乏来自硅酸钙包被的多孔硅的发光信号表明它由于缺 乏融合的脂质体的保护而在细胞内环境中快速溶解。相反，非融合脂质体 包被的颗粒与钙黄绿素信号在细胞质中的集中点中共定位。观测结果表明 非融合脂质体包被的颗粒被整个内吞到细胞中，并且脂质体包被在基于多 孔硅的核心周围的维持阻止了核心溶解。
[0135]
靶向肽缀合的颗粒
[0136]
狂犬病病毒糖蛋白(rvg，(ccgg)ytiwmpenprpgtpcdiftnsrgkrasng(seq id no:1))是neuro2a小鼠成神经细胞 靶向肽，其经由顺丁烯二酰亚胺-硫醇/半胱氨酸共价结合相互作用被缀合 到脂质体包被的顺丁烯二酰亚胺封端的peg。为了在共聚焦显微镜下观测 与细胞的相互作用，用5-fam染料标记rvg肽，并且用亲脂性dii标记 脂质体膜。靶向肽缀合似乎不影响脂质体包被的融合性，并且仅观测到与 没有靶向肽的融合脂质体包被的颗粒相比，加快了融合和摄取速率。
[0137]
用于基因敲低的负载sirna的颗粒
[0138]
通过将多孔硅颗粒与溶解在去离子水中的sirna和3m cacl2混合并 且通过离心洗涤来将小干扰rna(sirna)被运载物加载到多孔硅核心中。
[0139]
对于在neuro2a细胞中的sirna基因敲低测试，选择肽基脯氨酰异构 酶b(ppib/sippib)作为靶基因(图14)。负载sippib的f-psi在100nm显示 出约95％的基因敲低效率。相比之下，常见的转染剂lipofectamine在相似 的条件下仅实现了90％的基因敲低效率。非融合对照纳米颗粒nf-psi在 100nm仅显示出30％的基因敲低，具有高度可变性。
[0140]
体内巨噬细胞靶向和感染归巢
[0141]
用金黄色葡萄球菌气管内感染balb/c小鼠以诱发肺感染。使巨噬细胞 /单核细胞靶向肽与负载钙黄绿素和dii的f/nf-psi连接，并且经由静脉内 注射向受金黄色葡萄球菌感染的小鼠施用制剂，以观测对巨噬细胞的靶向 功效以及巨噬细胞向受感染的肺的归巢(图15)。将所收获的接受负载钙黄 绿素的颗粒注射的小鼠的肺匀浆以用于facs定量受感染的肺中钙黄绿素 的积聚，如图15(a-c)中所示。将被注射dii负载颗粒的小鼠的肺固定以用 于荧光组织学评价，如图15(d-k)中所示。尽管连接靶向肽，但是在负载钙 黄绿素的fac数据和负载dii的荧光组织学评价中nf-psi均没有显示出 明显的向肺的归巢。没有靶向肽的f-psi在这两个评估中均显示出最少的 积聚，而具有靶向肽的f-psi在facs和荧光组织学这两者中都显示出明 显的对巨噬细胞的靶向和后续向受感染的肺的归巢。因此，巨噬细胞靶向 肽在纳米颗粒在体内向巨噬细胞的归巢中是必要的。
[0142]
使用如本文所述的mtp靶向肽缀合，负载钙黄绿素或dii的纳米颗粒 能够成功地归巢到受感染的肺，而没有mtp肽的颗粒和非融合颗粒则不 能。健康的肺也没有显示出明显的归巢，这是因为被募集的巨噬细胞较少。 在验证了受感染的肺中mtp肽归巢的情况下，
测试负载治疗性siirf5的 制剂的治疗功效。
[0143]
本公开证实了融合脂质体包被的psi系统能够绕过内吞以实现比非融 合制剂更大的基因敲低功效。此外，成功地证实了对巨噬细胞/单核细胞的 体内靶向，并且递送有效负载的巨噬细胞/单核细胞有效归巢到受感染的 肺。在向巨噬细胞递送m1表型抑制性sirna的情况下，该数据显示融合 系统可以实现感染的改善和有效的免疫原清除，这可能是因为更高的吞噬 活性、炎症减轻、以及组织愈合。
[0144]
已经对本发明的多个实施方案作出了描述。然而，应当了解的是，可 以作出各种修改而不脱离本发明的精神和范围。因此，其它实施方案也落 入以下权利要求书的范围内。