红缨子高粱发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种红缨子高粱发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由于人们生活水平的提高，加上空气及环境的污染，出现敏感肌以及炎症类皮肤的情况越来越多，亟需开发一种抗敏效果较好，且不会对皮肤造成负担的产品。目前市售的抗炎和抗敏产品多种多样，功效各异，大部分产品的配方组分不仅会对肌肤造成负担，真正有抗敏效果的成分的添加量也很少。红缨子高粱中富含淀粉、蛋白质等营养物质，还含有多酚类化合物、植物甾醇、高级烷醇和脂等多种活性成分。目前，红缨子高粱主要作为谷物被应用于食品加工领域和酿酒领域，应用领域相对局限，在皮肤外用剂领域的应用鲜有报道。
3.因此，本领域亟需研发一种工艺简单，制备成本低，对红缨子高粱中有效活性成分的提取率高，不污染环境的红缨子高粱提取物的制备方法，且促使制得的红缨子高粱提取物具有美容功效，可被用于皮肤外用剂领域。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中红缨子高粱普遍用于食品和酿酒领域，在皮肤外用剂领域中的应用研究较少等缺陷。同时，面对众多提取工艺，如何筛选出可用于红缨子高粱，并保证提取物具有抗敏功效的提取工艺仍是本领域技术难题。因此，本发明提供一种红缨子高粱发酵物，含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明的红缨子高粱发酵物在制备过程中减少了资源浪费，对植物全成分进行提取，减少红缨子高粱中活性成分的流失，发酵条件温和，不采用任何化学试剂，降低生产成本，减少环境污染，具有理想的抗炎和舒缓抗敏功效，拓展红缨子高粱的应用领域。
5.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
6.本发明提供一种红缨子高粱发酵物的制备方法，其包括如下步骤：将酵母菌接种到发酵底物中，经有氧发酵，超声破碎菌体，灭菌，即可；其中，所述发酵底物的制备方法为将红缨子高粱和水混合均匀。
7.一些实施例中，所述红缨子高粱在使用前还可进一步包括粉碎的操作，制得红缨子高粱粉末。
8.其中，所述红缨子高粱粉末的粒径可为本领域常规，较佳地为50～150目，更佳地为80～120目，例如，100目。
9.一些实施例中，所述红缨子高粱和所述水的质量比可为1：(10～50)，较佳地为1：(20～40)，更佳地为1：30。
10.一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可进一步包括灭菌的操作。
11.其中，所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高温灭菌法。
12.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为115～125℃，更佳地为118～121℃。
13.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为10～60min，更佳地为20～40min，例如30min。
14.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15mpa，更佳地为0.1～0.13mpa。
15.其中，按照本领域常规，所述灭菌的操作后还可进一步包括冷却的操作，一般可为冷却至室温。
16.一些实施例中，所述酵母菌可包括酿酒酵母菌，较佳地包括购自北京市食品酿造研究所的黄酒酵母21392和/或保藏编号为cgmcc no.17452的酿酒酵母。
17.一较佳实施例中，当所述酵母菌包括购自北京市食品酿造研究所的黄酒酵母21392和保藏编号为cgmcc no.17452的酿酒酵母时，产品编号为21392的黄酒酵母和保藏编号为cgmcc no.17452的酿酒酵母的活菌数比可为(0.25～4)：1，更佳地为1：1。
18.一些实施例中，所述酵母菌可按照本领域常规以酵母菌菌液的形式添加，所述酵母菌菌液中所述酵母菌的浓度可为107～109cfu/ml，较佳地为108cfu/ml。
19.一些实施例中，单位体积的所述发酵底物中接种的所述酵母菌的数量可为本领域常规，较佳地为5
×
105～5
×
107cfu/ml，更佳地为5
×
106～5
×
107cfu/ml。
20.一较佳实施方案中，所述酵母菌菌液的制备方法可为本领域常规，具体包括如下步骤：(1)所述酵母菌接种到ypd固体培养基中划线活化，培养，制得单菌落；(2)所述单菌落接种到ypd液体培养基中经培养，即可。
21.其中，步骤(1)中，所述培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为25～30℃，例如28℃。
22.其中，步骤(1)中，所述培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为30～50h，例如48h。
23.其中，步骤(2)中，所述培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为25～30℃，例如28℃。
24.其中，步骤(2)中，所述培养的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为36～72h，例如48h。
25.其中，步骤(2)中，所述培养可按照本领域常规在摇床上进行，所述摇床的转速可为150～250rpm，较佳地为200rpm。
26.一些实施例中，所述有氧发酵的条件和方法可为本领域常规，一般可在摇床上进行，所述摇床的转速可为100～300rpm，较佳地为150～250rpm，例如180rpm。
27.一些实施例中，所述有氧发酵的时间可为48～96h，较佳地为48～72h。
28.一些实施例中，所述有氧发酵的温度可为25～37℃，例如30℃。
29.一些实施例中，所述超声的功率可为200～950w，较佳地为300～600w，更佳地为400w。
30.一些实施例中，所述超声的总时间可为5～20min，较佳地为10～20min，更佳地为15min。
31.一较佳实施例中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声的时间为10～20s，间
歇的时间为10～20s，所述超声的总时间为5～20min。
32.一更佳实施例中，所述超声采用间歇超声的方法，每次超声的时间为15s，间歇的时间为15s，所述超声的总时间为5～20min。
33.一些实施例中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高温灭菌法。
34.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为115～125℃，更佳地为118～121℃。
35.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～60min，更佳地为20～40min，例如30min。
36.当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15mpa，更佳地为0.1～0.13mpa，例如0.12mpa。
37.一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括冷却和/或离心，收集上清液的操作。
38.其中，按照本领域常规，所述冷却可为冷却至室温。
39.其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，较佳地为3000～10000rpm，更佳地为4000～8000rpm，例如4800rpm。
40.其中，所述离心的半径可为本领域该类操作常规的半径，较佳地为8～15cm。
41.其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为10～50min，更佳地为20～40min，例如30min。
42.一些实施例中，所述离心的操作后还可进一步包括二次灭菌和/或与防腐剂混合的操作。
43.所述二次灭菌的方法可为本领域常规使用的高温灭菌法。
44.当采用高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为105～125℃，更佳地为112～125℃。
45.当采用高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～30min。
46.当采用高温灭菌法进行所述二次灭菌时，所述二次灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15mpa，更佳地为0.1～0.12mpa。
47.与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为50～80℃，更佳地为70～80℃。
48.与所述防腐剂混合的过程中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
49.当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得所述上清液的质量百分数可为0.1％～0.5％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得所述上清液的质量百分数可为0.5％～1％；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述离心后制得所述上清液的质量百分数为0.5％，所述1,2-己二醇占所述离心后制得所述上清液的质量百分数为0.8％。
50.本发明还提供一种红缨子高粱发酵物，其由如上所述的红缨子高粱发酵物的制备方法制得。
51.本发明还提供一种如上所述的红缨子高粱发酵物直接作为产品、作为添加剂或作
为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
52.一些实施例中，所述红缨子高粱发酵物可作为所述皮肤外用剂中的舒缓抗敏活性成分。
53.其中，所述舒缓抗敏活性成分可为对透明质酸酶具有抑制作用的舒缓抗敏活性成分。
54.本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的红缨子高粱发酵物。
55.一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种。
56.一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。
57.一些实施例中，所述红缨子高粱发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5％～99％，较佳地为60％～99％。
58.一些实施例中，所述室温一般指15～40℃。
59.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
60.本发明所用试剂和原料均市售可得。
61.本发明的积极进步效果在于：本发明红缨子高粱发酵物在制备过程中减少资源浪费，对植物全成分进行提取，减少红缨子高粱中活性成分的流失，发酵条件温和，不采用任何化学试剂，降低生产成本，减少环境污染。制得的红缨子高粱发酵物具有理想的抗炎和舒缓抗敏功效，拓展红缨子高粱的应用领域。
附图说明
62.本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
63.图1为实施例1～4和对比例1～4制得产品对透明质酸酶抑制率的对比图；
64.图2为实施例1～4和对比例1～4制得产品中总蛋白含量的对比图；
65.图3为实施例1～4和对比例1～4制得产品中总酚含量的对比图；
66.图4为采用实施例1～4和对比例1～4制得产品处理皮肤后，皮肤含水量随时间变化对比图。
具体实施方式
67.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
68.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
69.下述实施例和对比例中，黄酒酵母菌菌液(简称菌液1)的制备方法包括如下步骤：购自北京市食品酿造研究所的黄酒酵母菌21392接种到ypd固体培养基中划线活化，在温度
为28℃的培养箱中培养48h，制得单菌落；将单菌落接种到ypd液体培养基中，在温度为28℃的摇床中培养48h，摇床的转速为200rpm，即可。
70.下述实施例和对比例中，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)ywy-1，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏日期为2019年03月27日，保藏编号为cgmcc no.17452；cgmcc no.17452的酿酒酵母菌液(简称菌液2)的制备方法同黄酒酵母菌，区别在于菌种不同。
71.实施例1
72.(1)将红缨子高粱粉碎成目数为100的红缨子高粱粉末，称取红缨子高粱粉末10g与300ml去离子水混合，制得发酵底物，发酵底物于温度为121℃，压力为0.12mpa的高压灭菌锅中灭菌30min，灭菌后冷却至室温，得到灭菌的发酵底物；
73.(2)在灭菌的发酵底物中分别接入菌液1和菌液2进行有氧发酵；其中，菌液1和菌液2中活菌数均为108cfu/ml，两种菌液总接种量为5％(以发酵底物的体积为基准，菌液总体积占发酵底物体积的百分比)，两种菌液的添加量均为7.5ml，在30℃恒温振荡器中培养72h，振荡器转速为180r/min；有氧发酵结束后，在功率为400w的条件下进行超声，用于破碎菌体，使菌胞液释放，采用间歇超声的方法，每次超声时间为15s，间隔时间为15s，共超声15min；超声后于温度为121℃的高温灭菌锅中进行灭菌30min，再冷却至室温；将灭菌冷却后的发酵液离心30min，离心转速为4800r/min；离心结束后进行二次灭菌，二次灭菌的温度为121℃，二次灭菌的时间为30min，二次灭菌完成后，将温度降至75℃，添加防腐剂；以离心后制得上清液后制得物料的质量为基准，加入0.5％对羟基苯乙酮和0.8％的1,2-己二醇，制得红缨子高粱发酵物，命名为balance king。
74.实施例2
75.与实施例1相比，区别仅在于发酵时长为48h，其他条件参数同实施例1，制得红缨子高粱发酵物，命名为balance king。
76.实施例3
77.与实施例1相比，区别仅在于只接种购自北京市食品酿造研究所的黄酒酵母菌21392，其他条件参数同实施例1，制得红缨子高粱发酵物，命名为balance king。
78.实施例4
79.与实施例1相比，区别仅在于只接种保藏编号为cgmcc no.17452的酿酒酵母，其他条件参数同实施例1，制得红缨子高粱发酵物，命名为balance king。
80.对比例1
81.为实施例1步骤(1)制得的灭菌的发酵底物。
82.对比例2
83.与实施例1相比，区别仅在于发酵底物的制备方法为：将红缨子高粱和水混合均匀，进行热水浸提，即可；其中，热水浸提的温度为90℃，热水浸提的时间为1h；其他条件参数同实施例1。
84.对比例3
85.与实施例1相比，区别仅在于发酵底物的制备方法为：将5g红缨子高粱粉末和5g大米粉与300ml去离子水混合均匀，即可；其他条件参数同实施例1。
86.对比例4
87.与实施例1相比，区别仅在于步骤(2)中不进行超声破碎菌体，其他条件参数同实施例1。
88.效果实施例1
89.透明质酸酶是一种能分解多糖的溶酶体之一，能够水解透明质酸钾生成β-n-乙酰葡糖胺，该物质在碱性条件下与乙酰丙酮缩合生成生色原2-甲基-3-二乙酰吡咯衍生物，生色原与埃尔利希试剂在浓盐酸乙醇中显色。透明质酸酶与炎症、过敏有强相关性，是i型过敏反应的参与者，因此透明质酸酶体外抑制实验可作为快捷的抗炎、抗过敏测定方法。
90.试剂：透明质酸酶、透明质酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、无水碳酸钠、浓盐酸、对-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰醋酸、无水氯化钙。
91.设备：sunrise酶标仪的厂家为帝肯贸易有限公司；上海博讯实业有限公司医疗设备厂的数显恒温水浴锅；
92.取0.1ml cacl2溶液(0.25mmol/l)和0.5ml透明质酸酶液(100u/ml)于37℃下水浴恒温培养20min；加入受试样品液0.5ml(实施例1～4或对比例1～4制得的产品)，继续保温20min；再加入0.5ml透明质酸钠溶液(0.5mg/ml)，37℃水浴恒温培养30min后取出，在常温下放置5min；加入0.1ml naoh溶液(0.4mol/l)和0.5ml乙酰丙酮溶液(3.5ml乙酰丙酮溶于50ml的1.0mol/l碳酸钠溶液中)，于沸水浴中加热15min后立即转移至冰水水浴冷却5min；滴加1.0ml埃尔利希试剂(0.8g对-二甲基氨基苯甲醛溶于15ml浓盐酸和15ml无水乙醇中)，并用3.0ml无水乙醇稀释，室温放置20min显色，用分光光度计测定波长为540nm处吸光度值。样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式如下：
93.透明质酸酶抑制率＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)
×
100％，测试结果见表1和图1；
[0094]
式中：a—对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替受试样品溶液)；b—对照空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替受试样品溶液及酶液)；c—受试样品液吸光度值；d—受试样品空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。
[0095]
表1
[0096][0097][0098]
表1和图1结果表明，本发明实施例1～4制得的红缨子高粱发酵物对透明质酸酶具
有理想的抑制作用，即具有理想的抗炎和抗过敏功效，且抗炎和抗敏功效显著优于对比例1～4制得的产品。图1中，
***
p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，极显著降低；
**
p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性统计学差异，显著降低；
##
p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性差异，显著升高。
[0099]
效果实施例2活性物质含量的测定
[0100]
采用北京百瑞极生物科技有限公司生产的货号为bn27109的bca蛋白定量检测试剂盒测试实施例1～4和对比例1～4制得的产品中蛋白质含量，结果见表2和图2。
[0101]
表2
[0102]
编号蛋白质含量(mg/ml)实施例10.581实施例20.615实施例30.539实施例40.6对比例10.308对比例20.428对比例30.494对比例40.47
[0103]
从表2和图2数据可看出，本发明实施例1～4制得的红缨子高粱发酵物中活性成分含量显著高于对比例1～4制得的产品。图2中，
***
p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，极显著降低；
**
p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性统计学差异，显著降低；
##
p＜0.01，表示与实施例1相比有显著性差异，显著升高；
#
p＜0.05，表示与实施例1相比有统计学差异，比实施例1高。
[0104]
效果实施例3
[0105]
将上述实施例1～4和对比例1～4制得的产品在室温下静置30天，观察体系稳定性，结果见表3。
[0106]
表3
[0107]
编号产品性状实施例1无沉淀实施例2无沉淀实施例3无沉淀实施例4无沉淀对比例1无沉淀对比例2无沉淀对比例3无沉淀对比例4有沉淀生成
[0108]
效果实施例4
[0109]
总酚含量测定：
[0110]
在碱性溶液中，多酚类化合物可以将钨钼酸还原(w
6
变成w
3
)生成蓝色化合物，在760nm处有最大吸收，颜色的深浅与多酚含量呈正相关。一般用没食子酸(或焦性没食子酸)
作为参照标准，提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸的量来表示。
[0111]
实验药品：1.焦性没食子酸标准品；2.福林-酚试液；3.26.7％na2co3溶液：称取26.7g na2co3固体粉末，加入蒸馏水至100g，搅拌溶解。
[0112]
实验仪器：精密天平、分光光度计；
[0113]
实验操作：
[0114]
1.标准曲线的绘制
[0115]
准确称取真空干燥至恒重的焦性没食子酸标准品44.3mg，用蒸馏水溶解定容至100ml，分别取2.0、4.0、8.0、12.0、16.0和20.0ml于100ml容量瓶，用蒸馏水稀释至刻度。再分别取上述不同浓度溶液1ml加到10ml比色管中，然后依次加入1ml蒸馏水，0.5ml 2倍稀释的福林-酚试液，1.5ml 26.7％na2co3溶液，用水定容至10ml，室温下反应2h，于760nm下测定吸光值。以吸光值对标准品含量作图，得到典型的标准曲线。
[0116]
2.样品测定
[0117]
取1ml待测液(实施例1～4或对比例1～4制得的产品)加到10ml比色管中，然后依次加入1ml蒸馏水，0.5ml 2倍稀释的福林-酚试液，1.5ml 26.7％na2co3溶液，用水定容至10ml，室温下反应2h，于760nm下测定吸光值。将测得的吸光值代入标准曲线，计算待测液中所含多酚含量，结果见表4和图3。
[0118]
表4
[0119]
编号总酚含量(μg/ml)实施例1352.88实施例2406.17实施例3330.81实施例4367.87对比例1237.89对比例2270.14对比例3203.71对比例4232.38
[0120]
从表4和图3数据可看出，本发明实施例1～4制得的红缨子高粱发酵物中活性成分含量显著高于对比例1～4制得的产品。图3中，***p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性统计学差异，显著降低；
###
p＜0.001，表示与实施例1相比有极其显著性差异，显著升高。
[0121]
效果实施例5：保湿性评价
[0122]
根据《化妆品保湿功效评价指南》，用角质层含水量测试皮肤的水分含量，筛选出30位符合条件的志愿者参加测试，在温度为22
±
2℃，湿度为40％～60％的环境中，测试实施例1～4和对比例1～4制得产品对志愿者的保湿效果。
[0123]
其中，测试方法如下：
[0124]
清洁皮肤15min后，测定双侧前臂本底值(未涂抹产品的皮肤)，取受试者双侧前臂内侧用记号笔画出面积为3.5
×
3.5cm正常皮肤，采用皮肤水分测试探头corneometer cm825测试5min后、20min后、1小时后受试部位的皮肤含水量。将面膜布分别剪成3
×
3cm大小，分别贴在前臂相应标记处，把样品用胶头滴管滴在面膜布上，15min后取下面膜布，取下
后分别在5min、20min、60min测试皮肤含水量，并计算与本底值相比含水量的提升值，结果见表5和图4。
[0125]
表5
[0126][0127]
效果实施例6：人体封闭型斑贴实验
[0128]
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1～4和对比例1～4制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。
[0129]
1、试验对象：
[0130]
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
[0131]
2、实验方法
[0132]
分别将0.2ml上述实施例1～4和对比例1～4制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h和48h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表6。
[0133]
表6皮肤不良反应分级标准
[0134][0135]
3、试验结果
[0136]
结果参见表7，从表中可以看出；本发明实施例1～4以及对比例1～4制得的样品均无刺激性
[0137]
表7
[0138]
[0139][0140]
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0141]
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。