一种慢性胰腺炎疾病模型及其制备方法

1.本发明涉及生物医学领域的一种慢性胰腺炎实验动物模型及制备方法，用于胰腺病、胆源性慢性胰腺炎、胰源性糖尿病、肠源性糖尿病等相关疾病的研究以及药物的有效性和安全性评价。


背景技术：

2.慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,cp)是由于各种原因导致的胰腺局部或弥漫性的慢性进展性炎症，伴随胰腺内外分泌功能的不可逆损害，继发胰腺消化酶分泌不足和糖尿病等病症。cp属于中医“腹痛”“胃脘痛”“泄泻”“症瘕积聚”等病症范畴，其病机为：饮食不调或外邪入里，肠胃积热所致的胃脘部痞塞不通、脾运不及；肝胆湿热蕴结于肝胆，使之失于疏泄条达。临床上表现为反复发作性或持续性腹痛、腹泻或脂肪泻、消瘦、黄瘟、腹部包块和消渴症。
3.cp实验模型是研究开发治疗cp药物、阐明药物药理毒理学机制的前提条件和研究基础。目前尚无完全模拟人类cp的实验动物研究模型，因此，研究开发具有操作简便、成功率高、一致性好、造模时间周期短、病变持续时间较长的实验动物模型具有重要意义。目前，构建cp实验模型的方法主要有侵入式和非侵入式2类。
4.侵入式制备cp模型主要基于手术方式，包括胰腺导管结扎法(partial duct ligation,pdl)和胆管逆行注射法。胰腺导管结扎法原理是通过结扎胰腺导管，造成导管局部堵塞，引起胰液排泻障碍、胰管高压、胰液溢出，诱使胰酶在胰腺异常活化，从而导致急性胰腺炎的发生。胰腺导管结扎法7～14天死亡率接近100％。胆管逆行注射法是通常向胰腺导管注射化学试剂的方法诱导急慢性胰腺病变，常用的化学试剂是三硝基苯磺酸，该方法手术要求较高和手术难度较大，且手术过程耗时长，影响实验动物的存活率，实验结果干扰因素多。
5.非侵入模型是指不需要对动物实施手术，操作过程相对简单。主要采用腹腔、静脉途径将化学试剂注入血管或局部形成胰腺炎。造模剂主要包括：二丁基二氯化锡、乙醇、二乙基二硫代氨基甲酸盐、l-精氨酸、雨蛙素、脂多糖等。注射法所致胰腺纤维化较为显著，但不足之处在于对注射部位或其他脏器具有非特定的损伤作用，急性期死亡率较高。此外，通过高脂饮食喂饲也能建立cp实验动物模型，但是这种食物诱导法存在模型建立周期长的不足。
6.胆囊动力学与胆道流变学改变所致的胆系疾病可诱发胆源性慢性胰腺炎，诱发病变的类型包括胆囊排空降低、胆道梗阻、胆汁引流不畅等病症，这些疾病诱因与疾病本身常常互为因果，复发加剧胰腺损害和胆道梗阻。
7.本发明构建了一种胆管伴十二指肠结扎法(bile duct and duodenum ligation，bddl)诱发的cp实验动物研究模型，该模型能直接造成胆管动力学改变和十二指肠胰段梗阻，诱发胆管异常梗阻，胰管壶腹部压力失衡，导致胰腺分泌功能失调，出现细胞自身消化、凋亡、组织结构破坏、内外分泌功能减退的实质性损害表现，进而造成继发胰腺组织炎症、
纤维化，继发血糖调节功能紊乱和消化功能不足等的慢性胰腺炎病症。


技术实现要素：

8.本发明的目的：针对现有技术的不足，发明一种cp动物疾病模型，该动物疾病模型具有操作过程简便、成功率高、稳定性好，重复性好、观察周期长、不易自行恢复的特点，应用于药品、医疗器械、生物活性材料的研究评价和胰腺炎发病机制研究。
9.为实现上述发明目的，通过以下技术方案实现：
10.1.方法设计
11.1.1.动物分组
12.实验大鼠随机分为假手术组、模型对照组、bddl组、bddl 药物组。
13.1.2.仪器设备
14.生物组织脱水机、生物组织包埋机、切片机、生物显微镜。
15.2.操作实施
16.2.1.手术前操作
17.禁食、麻醉、备皮、消毒。
18.2.2.手术过程
19.手术采用无菌操作，具体操作分为5个环节构建bddl模型。
20.2.2.1.切口：上腹部正中切口，长约2cm。
21.2.2.2.视野暴露：将十二指肠引出体外，暴露出胆管和十二指肠。
22.2.2.3.胆管结扎：用缝合肠线不完全结扎胆管中段，结扎时不宜过紧，避免阻断胆管，结扎后将针头抽出。
23.2.2.4.肠管结扎：在胆管十二指肠开口处十二指肠肠管上下端局部肠管狭窄。
24.2.2.5.回纳缝合：将十二指肠回纳后，逐层缝合腹壁。
25.2.3.手术后操作
26.术后更换洁净垫料，不使用抗生素，单笼饲养至完全苏醒，30小时内禁食、限量饲喂、自由饮水，30小时候恢复正常饲喂条件。
27.2.4.给药
28.实验动物清醒后给予溶媒、参比制剂和(或)治疗药物，假手术组、模型对照组和(或)bddl组给予等容量的溶媒，实施药物干预。
29.2.5.取材与病理
30.末次给药后，麻醉动物，取出胰腺组织。观察并进行大体观察，取损伤处组织，甲醛溶液固定，进行组织病理学检查。
31.3.评价指标
32.1.1临床观察
33.从动物的精神状态、自主活动、被毛平顺程度评价动物体征表现。从胰腺的器官形态、颜色、粘连、分叶评价腺体大体表现。
34.1.2血清生化检查
35.取实验动物血液，于造模后采血进行胰腺外分泌功能血清学生物化学指标检查。
36.1.3病理学分级
37.镜下观察胰腺病理检查。以水肿、坏死、炎症、纤维化为指标，检查胰腺(腺泡、腺体)、胆管、十二指肠组织结构的病变情况。
38.2统计方法
39.所有观察数据excel软件进行汇总分析。
具体实施方式
40.实施例1
41.1.1.实验动物
42.健康大鼠80只，随机分为4个试验组，即假手术组、pdl组、bddl组、bddl 药物组，每组20只。
43.1.2.手术前操作
44.所有动物实验操作同2.1。
45.1.3.手术过程
46.假手术组仅进行切口、回纳和缝合手术操作。
47.pdl组进行无菌手术操作，手术结扎胆胰管构建pdl模型。
48.bddl组、bddl 药物组进行无菌手术操作，分为5个环节构建bddl模型，胆管结扎：用4-0#缝合肠线将直径1.6mm的无菌不锈钢304棒连同胆管中段一起结扎，结扎时不宜过紧，避免阻断胆管，结扎后将针头抽出。
49.其余实验操作同2.2。
50.1.4.手术后操作
51.所有动物实验操作同2.3。
52.1.5.给药
53.实验动物造模3日后开始给药，bddl 药物组动物给予药物，假手术组、pdl组和bddl组给予等容量的纯水。
54.1.6.观察指标
55.术后对实验动物表观体征、死亡率、血清生化学指标进行描述和评估。
56.1.7.动物体征观察结果
57.假手术组术后未见明显异常。pdl组、bddl组、bddl 药物组术后72h、10d，可见倦怠、萎靡、被毛不平顺、体重减轻的症状，结果见表1、表2。
58.1.8.血清生化检查结果
59.造模后3、10、17、24d，假手术组、pdl组、bddl组实验动物采集眼眶静脉丛血液，离心取血清，检测血清淀粉酶(amy)、胰淀粉酶(pamy)、脂肪酶(lps)、总胆红素(tbil)水平。造模后3d，pdl组amy、pamy、lps、tbil水平均明显高于假手术组、bddl组，造模后10、17、24d pdl组与假手术组、bddl接近；造模后3、10、17、24d bddl组与假手术组amy、pamy、lps水平接近。
60.实施例2
61.2.1.实验动物
62.健康大鼠40只，随机分为4组，假手术组、pdl组、bddl组、bddl 药物组，每组10只。
63.2.2.手术前操作
64.所有动物实验操作同2.1。
65.2.3.手术过程
66.假手术组仅进行切口、回纳和缝合手术操作。
67.pdl组进行无菌手术操作，手术结扎胆胰管构建pdl模型。
68.bddl组、bddl 药物组进行无菌手术操作，分为5个环节构建bddl模型。肠管结扎：在胆管十二指肠开口处十二指肠肠管上下端1.5cm处各结扎一半肠管。
69.其余实验操作同2.2。
70.2.4.手术后操作
71.所有动物实验操作同2.3。
72.2.5.给药
73.实验动物术后4日开始给药，bddl 药物组动物给予治疗药物，bddl组、pdl组和假手术组给予等容量的纯水，连续给药21d。
74.2.6.观察指标
75.术后对存活大鼠的胰腺形态、粘连、分叶情况以及胆胰管形态分别进行解剖观察。采集胰腺组织，对胰腺腺泡、胰腺小叶的病理学表现进行描述和评估。
76.2.7.胰腺观察结果
77.假手术组术后胰腺与周围组织无粘连、分叶清晰易分辨，无明显异常。术后24d，pdl组、bddl组、bddl 药物组解剖发现胰腺呈黄白色、质地松散、形态萎缩、局部粘连、分叶不清晰，皮肤可见黄染，结果见表3。
78.2.8.病理结果
79.于造模后24d且末次给药24h后。麻醉处死，取胰腺并进行大体观察。将胰腺损伤处组织用甲醛溶液固定，进行组织病理学检查。镜下从腺泡萎缩、空泡样变、坏死病变三个方面评估胰腺腺泡的病变情况。从炎性细胞浸润、纤维增生、纤维化三个方面评估胰腺小叶的病变情况。组织学病变轻、中、重程度依次以“ ”、“ ”、“ ”表示。
80.术后24d，相较假手术组，pdl组、bddl组、bddl 药物组镜下可见胰腺腺泡萎缩、空泡样变、变性坏死。造模后，各组胰腺小叶可见不同程度的炎性细胞浸润、纤维增生、纤维化。结果见表4、表5。
81.综上结果，采用bddl法获得的慢性胰腺炎模型，具有与临床慢性胰腺炎相似的观察体征和生化病理学改变，可以作为一种替代模型方法用于发病机制、药品、医疗器械、生物医学材料等领域的研究与评价。
82.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
83.本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其细节上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
84.表1术后72h大鼠体征情况结果
[0085][0086]
注：每组初始样本数n＝20。
[0087]
表2术后10d大鼠体征情况结果
[0088][0089]
注：每组初始样本数n＝20。
[0090]
表3术后24d大鼠胰腺解剖观察结果
[0091][0092]
表4术后24d大鼠胰腺腺泡组织病理表现
[0093][0094]
注：
“‑”
表示未出现相应病变；“ ”表示出现轻度相应病变。
[0095]
表5术后24d大鼠胰腺小叶组织病理表现
[0096][0097]
注：
“‑”
表示未出现相应病变；“ 、 ”分别表示出现轻、中度相应病变。