一种外源喷施提高植物幼苗耐低温能力的方法

1.本发明涉及植株耐低温处理技术领域，具体说是一种通过外源喷施一定比例磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰乙醇胺(pe)来提高植物幼苗耐低温能力的方法。


背景技术：

2.植物幼苗在16℃以下的低温胁迫中尤其敏感，轻则叶片变黄坏死，重则植株停止生长，进而影响作物产量和品质，降低经济效益。如果缺乏对生产设施的有力管控，低温是植物幼苗冬季正常生长的主要限制因子。
3.低温驯化、嫁接、添加抗冻外源物质等措施均能够提高作物的耐低温能力。但嫁接费工费时，且在管控不良的条件下嫁接苗易死亡。相比之下，施加外源物质更方便快捷。例如，在低温胁迫前喷施aba、水杨酸、油菜素内酯、多胺可以减轻冷害症状；生物菌肥、激素等外源物质添加能够提高植物幼苗低温抗性。另外有研究表明，低温下嫁接植物幼苗的差异表达基因和差异代谢物富集在脂质代谢通路，因此添加代谢通路上的中间产物对植物幼苗耐低温能力有一定影响，但是中间产物的用量较多，效率较低。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种外源喷施提高植物幼苗耐低温能力的方法，具体的是通过外源喷施一定比例磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰乙醇胺(pe)来提高植物幼苗耐低温能力的方法。该方法通过在植物幼苗叶面喷施脂质代谢通路上的终产物溶液，即适宜磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺比例的溶液，以提高植物幼苗的耐低温能力，尤其为解决我国北方冬春季作物生产设施易遭遇低温冷害的问题提供了方法。并且叶面喷施能使磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺通过叶片直接进入植物，参与代谢过程。速度快，作用强，用量少，效率高。
5.为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
6.一种外源喷施提高植物幼苗耐低温能力的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于溶剂i中，配制成磷脂酰胆碱母液；
8.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂ii中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
9.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液进行混合，向混合液中加入表面活性剂和溶剂iii，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液；
10.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施。
11.进一步，所述溶剂i包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙二醇，本法选用乙醇；溶剂ii包括三氯甲烷、乙醚；溶剂iii包括蒸馏水、去离子水，表面活性剂包括吐温、甘油。
12.进一步，所述磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液中磷脂酰胆碱的浓度为60-100μm，
磷脂酰乙醇胺的浓度为40-80μm，表面活性剂的浓度为1-20ml/l。
13.进一步，所述磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液中磷脂酰胆碱的浓度为60-80μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为40-60μm，表面活性剂的浓度为5-10ml/l。
14.进一步，所述步骤四中叶面喷施作业方法为：
15.每天1-4次，优选为每天2-3次；间隔6-12小时，优选为8-12小时；共7-11次，优选为9-11次；每次每植株喷施0.5-2ml，优选为1-2ml。
附图说明
16.本发明有如下附图：
17.图1不同时间低温处理外源喷施不同浓度pc和pe的黄瓜幼苗表型变化；
18.图2黄瓜叶片外源pc和pe物质喷施低温处理后相对电解质渗透率；
19.图3黄瓜叶片外源pc/pe喷施低温处理后表型和生理指标变化。
具体实施方式
20.以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
21.本发明所述的一种外源喷施提高植物幼苗耐低温能力的方法，包括如下步骤：
22.配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱固体，溶于溶剂i中，配制成磷脂酰胆碱母液；溶剂i包括甲醇、乙醇、异丙醇、丙二醇。
23.配制磷脂酰乙醇胺母液，称取磷脂酰乙醇胺固体，溶于溶剂ii中，配制磷脂酰乙醇胺母液；溶剂ii包括三氯甲烷、乙醚。
24.配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：将磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，加入表面活性剂和溶剂iii，得到磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液；表面活性剂包括吐温、甘油，溶剂iii包括蒸馏水、去离子水。
25.将喷施液喷施至植物幼苗的植株子叶叶面和除新叶、生长点外的所有真叶叶面，喷施作业方法为：每天1-4次，优选为每天2-3次；间隔6-12小时，优选为8-12小时；共7-11次，优选为9-11次；每次每植株喷施0.5-2ml，优选为1-2ml。
26.进一步，以
‘
新泰密刺’品种黄瓜为例，结合实施例具体说明使用本发明的方法对上述黄瓜幼苗进行处理后，幼苗耐低温能力得到明显提升的技术效果。
27.选取
‘
新泰密刺’黄瓜种子放入56℃温水中玻璃棒搅拌15min，换上25℃水常温浸泡4-6h后放置28
±
2℃黑暗条件下催芽，种子露白1-2mm后播至50孔穴盘(54cm
×
宽28cm，v草炭∶v蛭石∶v珍珠岩＝2∶1∶1混合基质)中，放置育苗设施(日光温室或塑料大棚等)中进行正常幼苗培育。培育得到的幼苗经筛选后使用不同配比的磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺复合喷施液进行喷施作业。
28.实施例1：
29.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
30.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
31.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷
脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入甘油和去离子水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为75μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为80μm，甘油的浓度为15ml/l；
32.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天3次，间隔8小时，共9次，每次每植株喷施1.5ml。
33.实施例2：
34.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
35.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
36.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入甘油和蒸馏水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为100μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为50μm，甘油的浓度为1ml/l；
37.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天2次，间隔12小时，共11次，每次每植株喷施1ml。
38.实施例3
39.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
40.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
41.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和去离子水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为80μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为60μm，甘油的浓度为1ml/l；
42.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天4次，间隔6小时，共7次，每次每植株喷施0.5ml。
43.实施例4
44.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
45.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
46.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和去离子水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为60μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为55μm，吐温的浓度为5ml/l；
47.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天2次，间隔12小时，共10次，每次每植株喷施2ml。
48.实施例5
49.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
50.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷
脂酰乙醇胺母液；
51.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和蒸馏水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为90μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为70μm，吐温的浓度为20ml/l；
52.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天3次，间隔6小时，共7次，每次每植株喷施0.5ml。
53.实施例6
54.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
55.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
56.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和去离子水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为100μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为45μm，甘油的浓度为20ml/l；
57.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天4次，间隔6小时，共10次，每次每植株喷施0.5ml。
58.实施例7
59.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
60.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
61.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和蒸馏水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为80μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为40μm，吐温的浓度为10ml/l；
62.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天2次，间隔8小时，共9次，每次每植株喷施1ml。
63.实施例8
64.步骤一、配制磷脂酰胆碱母液：称取磷脂酰胆碱，溶于甲醇中，配制成磷脂酰胆碱母液；
65.步骤二、配制磷脂酰乙醇胺母液：称取磷脂酰乙醇胺，溶于溶剂乙醚中，配制成磷脂酰乙醇胺母液；
66.步骤三、配制磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液：按比例量取磷脂酰胆碱母液和磷脂酰乙醇胺母液混合，向混合液中加入吐温和去离子水，配制成磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺喷施液，其中磷脂酰胆碱的浓度为75μm，磷脂酰乙醇胺的浓度为60μm，吐温的浓度为15ml/l；
67.步骤四、使用步骤三配制成的喷施液，对植物幼苗植株进行叶面喷施，喷施作业方法为：每天2次，间隔11小时，共8次，每次每植株喷施0.5ml。
68.耐低温试验及结果表征：
69.1.电解质渗透率(ec)和丙二醛(mda)含量测定
70.ec值测定：
71.ec值是一个对低温比较敏感的指标，而且简便易测，能够表征细胞膜的完整性，因此测定ec已成为抗寒力测定常规方法。
72.用钻孔器钻取9片叶片并将其置于温度为28℃的蒸馏水中。测量蒸馏水的电导率，记为ec0。震荡2h后，测定叶溶液的电导率，记为ec1。叶片溶液在95℃水浴中煮15min，冷却至室温后测量溶液的电导率，记为ec2。ec＝[(ec
1-ec0)/(ec
2-ec0)]*100％。
[0073]
mda含量测定：
[0074]
mda是膜脂过氧化的产物，在遭受低温时会在细胞中积累，mda量的增多会导致细胞受到毒害；在mda积累的同时细胞内的另一代谢产物活性氧的含量也会随着胁迫时间的延长而上升，含量过多时首先会损伤细胞膜系统，严重时甚至导致细胞的死亡。
[0075]
取叶片1g，加入少量石英砂和10％tca 2ml，研磨匀浆，再加8ml 10％tca进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，上清液为mda提取液。在试管中加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml 0.6％硫代巴比妥酸，摇匀，置沸水浴中反应15min，迅速冷却后4000r/min离心10min，取上清液分别在450nm、532nm、600nm波长下测定消光度。结果以mmol/g表示。
[0076]
2.耐低温试验结果
[0077]
(1)经单独组分喷施液喷施幼苗低温处理过程表形变化及ec值
[0078]
黄瓜幼苗长至两叶一心时，用对应浓度的喷施液对植株子叶和除新叶、生长点外的所有真叶进行叶面喷施。每天2次，间隔8h，共9次，每次每植株喷施1ml。喷施结束后置于正常培养条件下缓苗12h，随后放置光照培养箱中进行4℃低温处理。观测磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺单独喷施植株0h、6h、12h和24h低温胁迫后的表型变化(图1)。pc溶于乙醇，以400μl乙醇溶于加入吐温的水中作为该组的对照；pe溶于三氯甲烷，以200μl三氯甲烷溶于加入吐温的水中作为该组的对照。
[0079]
取经过上述喷施作业且经低温处理24h的黄瓜幼苗第一真叶进行ec值测定，每个喷施浓度取三个生物学重复，每个重复包含3-6棵苗，使用t-test对数值进行检测。结果如图2所示(图中“*”代表p＜0.05)。
[0080]
浓度筛选试验发现：与清水对照相比，80μm的磷脂酰胆碱(溶于乙醇)喷施下黄瓜叶片的相对电解质渗透率较低但无显著性差异(图1，图2)，表明磷脂酰胆碱的喷施对黄瓜抗低温性的调控效果并不显著。黄瓜叶片的磷脂酰乙醇胺物质(溶于三氯甲烷)喷施结果表明磷脂酰乙醇胺的喷施同样对黄瓜抗低温性的调控效果不显著，其中80μm的磷脂酰乙醇胺喷施后黄瓜叶片的相对电解质渗透率显著高于三氯甲烷对照。
[0081]
(2)经磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺配比喷施液喷施幼苗的耐低温效果鉴定
[0082]
黄瓜幼苗长至两叶一心时，用对应浓度的喷施液对植株子叶和除新叶、生长点外的所有真叶进行叶面喷施。每天2次，间隔8h，共9次，每次每植株喷施1ml。喷施结束后将黄瓜幼苗置于25℃正常培养条件下缓苗12h，随后放置光照培养箱中进行4℃低温处理。观测pc：pe配比液喷施植株0h、6h、12h低温胁迫后的表型变化，并测定12h低温处理后的ec值和mda含量。将不同配比喷施液的ec值和mda含量与对照相比，低于对照的即为能够提高黄瓜幼苗耐低温能力。设置两组对照：以磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺配比为80μm∶80μm中所含乙
醇和三氯甲烷的量为对照1；以磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺配比为80μm∶0μm中所含乙醇和三氯甲烷的量为对照2。
[0083]
如图3所示(图中“*”代表p＜0.05，“**”代表p＜0.01，“***”代表p＜0.001)，ec值和mda含量结果具有一致性，80μm∶40μm配比喷施液处理后的植株两项数值均表现为最低，且低于对照。单独喷施80μm的磷脂酰胆碱40μm的磷脂酰乙醇胺时，相对电解质渗透率仅低于对照，但不存在显著性差异。同时喷施两种物质，且配比为80μm∶40μm时，黄瓜幼苗经12h低温处理后相对电解质渗透率与对照2间存在显著性差异。不同配比喷施处理后的植株经12h低温处理后叶片中mda含量均与对照2存在显著差异，80μm∶0μm、80μm∶40μm这两种配比与对照1也存在显著差异。80μm∶40μm、80μm∶0μm、80μm∶80μm的ec和mda含量依次上升，但均低于对照1和2。对前期筛选出来磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺适宜浓度进行组合喷施，发现低温处理后与对照组相比，磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺(80μmol/l∶40μmol/l)组合降低了黄瓜叶片的相对电解质渗透率和mda含量，相比对照1该组合相对电解质渗透率和mda含量分别下降了34.33％和55.79％，相比对照2该组合相对电解质渗透率和mda含量分别下降了49.27％和69.76％。
[0084]
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。