用于畜禽β-兴奋剂检测的检测卡以及检测β-兴奋剂的方法与流程

用于畜禽
β-兴奋剂检测的检测卡以及检测
β-兴奋剂的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术检测领域，具体而言，本发明涉及一种用于畜禽β-兴奋剂检测的检测卡以及检测β-兴奋剂的方法。


背景技术：

2.β-兴奋剂对人的危害很大，主要表现为在：急性中毒时出现心悸，面颈、四肢肌肉颤动，手指震颤，足有沉感甚至不能站立，头痛、头晕、恶心、呕吐、乏力，脸部潮红，皮肤过敏性红色丘疹。原有高血压、冠心病、甲状腺功能亢进者上述症状更易发生，对哺乳动物的危害与此相似。耐受性弱且有应激因素长时间存在时甚至可以发生猝死。饲喂β-兴奋剂的畜禽，在长途贩运途中经常有发生急性心力衰竭，导致猝死的情况。如，克伦特罗，性质稳定，要加热至172℃才会分解，所以普通烹调方法根本无法破坏它的结构。有研究表明，如果长期食用，还会导致染色体畸变的可能，会诱发恶性肿瘤。
3.针对β-兴奋剂检测可以采用一体化快速检测卡进行检测。此方法对于工厂化生产中具有方便、快速、灵敏的特点，适用于工业化大量样品检测，提高产业化。然而对于该方法的检测还需要进一步改进。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一种能够一体化检测β-兴奋剂的方法，所提供的方法能够全面客观的检测出大部分的兴奋剂成分。同时，此检测通用猪、牛、羊等畜禽，非单一某一种畜禽。
5.具体而言，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明的第一方面提供了一种用于畜禽β-兴奋剂检测的检测卡，包括：
7.样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫和底板，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，
8.所述结合垫上含有胶体金标记的抗体，所述胶体金标记的抗体具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr序列，和seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr序列；
9.所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上检测线(t)和质控线(c)，所述检测线包被有β-兴奋剂药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控线包被有羊抗鼠抗抗体。
10.进一步地，所述β-兴奋剂药物半抗原-载体蛋白偶联物通过β-兴奋剂药物半抗原与载体蛋白偶联获得。
11.进一步地，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白中的至少一种。
12.本发明的第二方面提供了一种利用检测卡检测畜禽β-兴奋剂的方法，所述检测卡为本发明第一方面所述的检测卡，所述方法包括：
13.将样本加入到本发明第一方面所述的检测卡的样品吸收垫上进行检测的步骤。
14.进一步地，当样本中待测物质含量高于检测限时，测试区不显色，结果为阳性；
15.当样本中待测物质含量低于检测限或者不含有β-兴奋剂时，测试区显色，结果为阴性。
16.进一步地，所述方法对于克伦特罗(cle)的检出限为3ng/g(3ppb)；
17.所述方法对于莱克多巴胺(ract)的检出限为3ng/g(3ppb)；
18.所述方法对于沙丁胺醇(sal)的检出限为5ng/g(5ppb)。
19.本发明所取得的有益效果为：
20.此发明适用于工厂化大批量检测，操作简单、快捷、费用低、准确度高。而且样品的检出限要求比国家标准更加严格。例如检出限：克伦特罗(cle)：3ng/g(3ppb)；莱克多巴胺(ract)：3ng/g(3ppb)；沙丁胺醇(sal):5ng/g(5ppb)。
附图说明
21.图1为根据本发明的实施例提供的用于畜禽β-兴奋剂检测的检测卡的结构示意图，其中标号1为样品垫，2为结合垫，3为反应膜，4为吸水垫，5为底板，6为检测线，7为质控线。
具体实施方式
22.下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。同时对本文中的一些术语进行解释和说明，这些解释和说明也用于帮助本领域技术人员理解。
23.本发明提供了一种用于畜禽β-兴奋剂检测的检测卡，包括：样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫和底板，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述结合垫上含有胶体金标记的抗体，所述胶体金标记的抗体具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr序列，和seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr序列；所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上检测线(t)和质控线(c)，所述检测线包被有β-兴奋剂药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控线包被有羊抗鼠抗抗体。
24.本文中所提到的胶体金标记的抗体，可以采用本领域常用的方法对抗体进行标记获得。所提到的羊抗鼠抗抗体可以通过购买获得。本文中未提到的试剂均可以通过商购获得，或者通过本领域技术人员的普通常识即可获得。
25.实施例1
26.首先通过β-兴奋剂类药物半抗原和载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫小鼠，获得能够与β-兴奋剂类药物发生特异性结合的抗体。选自其中表现出高亲和力的抗体，进行测序分析，其具有gfspsgyg(seq id no:1，hcdr1)、indedya(seq id no:2，hcdr2)、gryyyaadi(seq id no:3，hcdr3)所示的hcdr序列和esyytrnr(seq id no:4，lcdr1)、ras(seq id no:5，lcdr2)、agrgsrttdia(seq id no:6，lcdr3)所示的lcdr序列。
27.实施例2
28.实施例2提供了一种检测卡，如图1所示，包括：样品垫1、结合垫2、反应膜3、吸水垫4和底板5，所述底板上依次粘贴有样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫；所述结合垫上含有胶体金标记的抗体，所述胶体金标记的抗体具有seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所
述的hcdr序列，以及seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr序列；所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上具有检测线(t，如图1中6所示)和质控线(c，如图1中7所示)，所述检测线包被有β-兴奋剂药物半抗原-载体蛋白偶联物，所述质控线包被有羊抗鼠抗抗体。
29.当样本中待检物质含量高于检测限时，检测线(t线)不显色，结果为阳性；反之，当样本中不含有待检物或是含量低于检测限时，检测线(t线)显色，肉眼可见，结果为阴性。
30.实施例3
31.实施例3利用实施例2提供的检测卡对畜禽β-兴奋剂进行检测。
32.首先进行样本前处理
33.1.样本处理前须知：实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
34.2.样本前处理步骤：
35.组织：称取5g
±
0.05g匀质的新鲜肌肉组织样本放于50ml带盖离心管中，沸水浴10min；4000转/min离心1分钟，待冷却后取上清液用于检测。
36.具体的操作步骤如下：
37.1.取出检测卡，开封后平放于桌面，用滴管小心吸取离心管上清液，加3滴于样品孔中。
38.2.加样后5min，观察显色区，判定结果。
39.结果判断
40.1.阴性：质控线(c线)显色，检测线(t线)肉眼可见，无论颜色深浅均判为阴性；表明样本中不含有对应的瘦肉精或是含量低于检测限；
41.2.阳性：质控线(c线)显色，而检测线(t线)不显色判为阳性；表明样本中对应的瘦肉精含量高于检测限；
42.3.无效：质控线(c线)与检测线(t线)均不显色或者质控线(c线)不显色但检测线(t线)显色；说明此检测卡已失效、过期，或操作不当，需另做一次测试。
43.对100例样本进行了检测，结果表明所述方法对于克伦特罗(cle)的检出限在3ng/g(3ppb)；所述方法对于莱克多巴胺(ract)的检出限在3ng/g(3ppb)；所述方法对于沙丁胺醇(sal)的检出限在5ng/g(5ppb)，而且精确率在99％以上。
44.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。