一种双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法

1.本发明属于贝类毒素灾害的监测预警技术领域，具体涉及一种双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法。


背景技术：

2.麻痹性贝类毒素是一类主要由有害毒藻产生的海洋生物毒素，可通过食物链富集到双壳贝类体内，继而引发食品安全问题。麻痹性贝类毒素已经成为国内及国际贝类贸易中的必检项目。
3.常规的麻痹性贝类毒素检测方法是利用双壳贝类的整体软组织作为样品组织。然而申请人研究结果表明双壳贝类的不同组织中，麻痹性贝类毒素的积累存在显著差异；特别是外套膜等韧性较大的组织在整个软体组织中占比高但毒素积累量低，这会严重影响常规检测方法的准确性和灵敏度，同时因组织韧性较大，也增加了毒素的提取耗时和试剂消耗。
4.近年来，也有部分国家提出利用水体中毒藻水平监测和贝体生物标志物来实现对双壳贝类体内麻痹性贝类毒素积累的早期预警，但这些间接的预警方式受温度、水体ph等因素影响较多，不够准确且无法直接反应双壳贝类体内的毒素水平。建立灵敏准确且高效的双壳贝类中麻痹性贝类毒素早期预警方法已成为水产养殖和食品安全工作者共同关注的问题。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法，以解决现有技术所存在的无法实现操作方便、经济、灵敏准确且高效的早期监测预警的问题。
6.本发明所提供的双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法，所述的方法是检测双壳贝类的消化腺中的麻痹性贝类毒素的含量来确定是否有麻痹性贝类毒素含量超标的危险性；
7.所述的方法，其中是将消化腺用甲酸溶液进行匀浆，上清液通过固相萃取柱中进行净化；净化液加入乙腈溶液，离心后上清液进行过滤，滤液进行麻痹性贝类毒素的含量检测；
8.所述的甲酸溶液，其一种浓度为0.1％；
9.所述的过滤，是使用0.22μm有机系滤膜进行过滤；
10.进一步的，萃取柱分别用甲醇和水依次处理进行活化。
11.进一步的，所述的检测方式为液相色谱-串联质谱检测。
12.所述的双壳贝类包括扇贝、牡蛎或贻贝。
13.本发明所述以消化腺作为监测样本，在毒素提取操作上，相比于常规检测方法中使用的整体软组织更加易于匀浆研磨，操作简便，省时省力。检测样本体积更小，毒素提取
更加经济节约。消化腺毒素积累更加快速且积累量高，使得毒素更易被灵敏的检测到。同时，相比于监测水体毒藻水平和贝体生物生物标志物，以消化腺作为毒素监测样本，受其他因素干扰小且更能直接反应贝体毒素水平。利用贝类消化腺作为监测样本，既可以实现对双壳贝类中麻痹性贝类毒素的快速检测，又能为不同养殖环境、海域来源的双壳贝类中毒素含量是否超安全限值提供早期风险预警。
附图说明
14.图1是本发明双壳贝类在不同攻毒时间下各组织的毒力水平结果图。
15.图2是本发明双壳贝类的消化腺与整体软组织的毒力相关性分析结果图。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
17.实施例1：建立方法
18.双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法具体包括以下步骤：
19.1)实验室脱毒条件下喂养双壳贝类40只持续一周；
20.2)用产麻痹性贝类毒素的毒藻按每日相同浓度连续饲喂5天，分别于第0天、1天、3天、5天4个不同时间段各取样10只。取样时将消化腺与剩余组织分开于-20℃保存；
21.3)将步骤2)得到的各组织按1:2(组织重/g：试剂/ml)的比例加入0.1％的甲酸溶液匀浆，4℃下浸提24h后，12000r/min离心10min，吸取上清液。
22.4)将步骤3)得到的上清液，加入到提前活化好的hlb固相萃取柱中进行净化。
23.5)将步骤4)得到的净化液，按等体积加入乙腈溶液混匀，12000r/min离心15min，吸取上清液通过0.22μm有机系滤膜后上机检测。
24.6)将步骤5)检测所得结果进行不同攻毒时间下，各组织的毒力水平分析。相比于其他软体组织，消化腺中毒素积累快速且积累量远高于其余软体组织。
25.7)进一步对消化腺和整体软组织的毒力相关性进行分析，消化腺的毒力水平与整体软组织毒力呈显著正相关关系。以消化腺的毒力水平设置阈值，可进行双壳贝类中麻痹性贝类毒素积累的早期预警。
26.进一步的，所述步骤2)中的喂养浓度为3000cell/ml，与赤潮爆发期水体毒藻浓度近似。
27.所述步骤4)中萃取柱的活化为分别用6ml甲醇和6ml水依次处理。
28.进一步的，所述步骤5)中加入等体积乙腈溶液以沉淀蛋白质。
29.进一步的，所述步骤6)中的检测方式为液相色谱-串联质谱检测。
30.实施例2：虾夷扇贝作为样品进行检测
31.以虾夷扇贝为例，按照实施例1的方法进行检测。
32.1、实验室脱毒条件下喂养虾夷扇贝40只持续一周；
33.2、用产麻痹性贝类毒素的毒藻按每日3000cell/ml的浓度连续饲喂虾夷扇贝5天，分别于喂养第0天、1天、3天、5天各取样10只。取样时将消化腺与剩余组织分开于-20℃保存；
34.3、将步骤2得到的样品组织按1:2(组织重/g：试剂/ml)的比例加入0.1％的甲酸溶液，用组织匀浆机匀浆，并于4℃下浸提24h，12000转离心10min后吸取上清液。
35.4、将步骤3得到的上清液，加入到提前用6ml甲醇和6ml水活化好的hlb固相萃取柱中进行净化。
36.5、将步骤4得到的净化液，按等体积加入乙腈溶液混匀，静置30min后12000转离心10min。吸取上清液通过0.22μm有机系滤膜后上机检测。
37.6、将步骤5检测所得结果进行不同攻毒时间下，各组织的毒力水平分析。图1结果显示，消化腺中毒素积累快速且积累量远高于其余软体组织。在毒藻暴露第1天时，消化腺的毒力水平即达到307.15μg stxeq/100g，是整体软组织毒力水平的6.1倍。此外，在毒藻暴露的5天时间内，消化腺的毒力水平持续快速增加，而整体软组织毒力水平增势缓慢。本结果证明了消化腺可作为麻痹性贝类毒素积累监测的灵敏响应组织。
38.7、进一步对消化腺和整体软组织的毒力相关性进行分析。
39.图2结果显示，消化腺的毒力水平与整体软组织毒力相关系数超过0.9，呈显著正相关关系。当整体软组织毒力水平超过国家规定安全限值(80μg stxeq/100g)时，消化腺的毒力水平已高达571.48μg stxeq/100g。相反，若以消化腺的毒力水平设置更为严格的安全限值，可以有效规避整体软组织毒素含量超标的风险。本结果证明了本方法所述以消化腺的毒力水平设置阈值，可进行双壳贝类中麻痹性贝类毒素积累的早期风险预警。


技术特征：
1.一种双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法，其特征在于，所述的方法是检测双壳贝类的消化腺中的麻痹性贝类毒素的含量来确定是否有麻痹性贝类毒素含量超标的危险性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法是将消化腺用甲酸溶液进行匀浆，上清液通过固相萃取柱中进行净化；净化液加入乙腈溶液，离心后上清液进行过滤，滤液进行麻痹性贝类毒素的含量检测。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的甲酸溶液的浓度为0.1％。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的过滤，是使用0.22μm有机系滤膜进行过滤。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的萃取柱分别用甲醇和水依次处理进行活化。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的检测方式为液相色谱-串联质谱检测。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双壳贝类为扇贝、牡蛎或贻贝。

技术总结
本发明提供一种双壳贝类中麻痹性贝类毒素的早期预警方法，是检测双壳贝类的消化腺中的麻痹性贝类毒素的含量来确定是否有麻痹性贝类毒素含量超标的危险性。本发明方法以消化腺作为监测样本，在毒素提取操作上，相比于常规检测方法中使用的整体软组织更加易于匀浆研磨，操作简便，省时省力。检测样本体积更小，毒素提取更加经济节约。消化腺毒素积累更加快速且积累量高，使得毒素更易被灵敏的检测到。同时，相比于监测水体毒藻水平和贝体生物生物标志物，以消化腺作为毒素监测样本，受其他因素干扰小且更能直接反应贝体毒素水平。素干扰小且更能直接反应贝体毒素水平。素干扰小且更能直接反应贝体毒素水平。


技术研发人员：胡晓丽 史姣霞 孟德婷 李茉莉 王慧贞 包振民
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：2022.03.12
技术公布日：2022/5/30