红皮龙眼花色苷生物合成调控基因DlMYB1-HP及其应用

红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp及其应用。


背景技术：

2.花青苷是一类广泛存在于植物中的水溶性类黄酮化合物，在胞质内合成，积累于液泡中，使植物花色、果实和部分叶片呈现不同的颜色，具有强抗氧化力以及一定的消炎抗菌和抗病毒活性，在植物的生理活动中扮演着非常重要的角色。近十年来，随着对花青苷的深入研究，其生理活性、功能和其作用机制原理也逐渐成为众多学者研究的热点，同时花青苷因其食用和药用价值，包括其抗氧化性、抗炎、抑菌、抗衰老、抗癌等作用和其对肝脏、心脑血管和视力的保护作用也受到了人们的广泛关注和认可。
3.myb转录因子广泛存在于真核生物中，在植物基因组中发现了大量的myb类转录因子基因，如在拟南芥中发现了199个myb转录因子成员，从杨树中鉴定出191个myb基因、棉花中发现有200多个myb类转录因子，在其他植物中也找到了相应的r2r3-myb转录因子。其共同特征是n端一段特有的保守dna结合结构域，广泛参与了植物的生理生化过程，包括植物表皮细胞的分化、气孔的发育、类黄酮生物的合成、非生物的胁迫以及病原体抗性等。植物中的第一个myb类转录因子colorless(c1)是从玉米中分离鉴定的，后研究发现c1主要参与调控玉米花青苷的生物合成，随后，在模式植物拟南芥中，也相继分离出参与花青苷生物合成调控的atpap1(atmyb75)和atpap2(atmyb90)。
4.本发明从一种红皮龙眼中发现了一个调控dlmyb-hp基因，单独表达dlmyb-hp基因在多种植物中均有非常强的调控花色苷生物合成的功能。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp及其应用，以将其应用在调控花色苷生物合成上。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp的应用，所述合成基因dlmyb1-hp用于调控花色苷生物合成。
8.所述红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.所述红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10.本发明至少具备以下有益效果：
11.本发明从红皮龙眼中发现了一个调控花色苷生物合成的基因dlmyb1-hp，该基因在红皮龙眼的各个组织中都表达，通过构建超表达载体在烟草中瞬时表达或者在稳定转基因都可以使原不含花色苷的叶片积累大量的花色苷，说明该基因具有很强的促进花色苷合
成的功能，因此在将该基因dlmyb1-hp用于调控促进花色苷合成上具有良好的发挥在那前景和商业价值。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
13.图1为红皮龙眼dlmyb1-hp和石硖龙眼dlmyb1-xs氨基酸序列比对图；
14.图2为dlmyb1-hp基因和dlmyb1-xs基因扩增出目标条带示意图；
15.图3为烟草叶片中瞬时表达dlmyb1-xs和dlmyb1-hp的表型及花色苷含量示意图，a为瞬时表达石硖龙眼dlmyb1-xs和dlmyb1-hp基因烟草叶片表型，b为花色苷含量。
16.图4为转dlmyb1-xs和dlmyb1-hp龙眼烟草表型示意图，a为对照和转基因烟草叶片表型，b为花色苷含量。
具体实施方式
17.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
18.本发明为一种红皮龙眼花色苷生物合成调控基因dlmyb1-hp及其应用。
19.1.材料与方法
20.1.1.材料
21.红皮龙眼和石硖龙眼不同组织，包括果皮、果肉、叶片、种子、茎。
22.1.2.rna提取及反转录
23.利用天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚植物总rna提取试剂盒(货号：dp441)提取龙眼不同组织的总rna，然后根据南京诺唯赞公司的hiscript iii 1st strand cdna synthesis kit( gdna wiper)试剂盒(货号：r312-01)反转录合成cdna。
24.1.3.基因超表达载体构建及测序分析
25.设计特异引物ctagtggatccaaagatgtcgcatttacttggtgtaag和actctagaagtactcctactttgcattgtcttcttctgaac，以红皮龙眼果皮cdna为模板扩增红皮龙眼dlmyb1-hp基因序列；设计特异引物ctagtggatccaaagatgttggatttacttgatgcaag和actctagaagtactcctaaattagattattgtcttcttctg以石硖龙眼幼叶cdna为模板扩增石硖龙眼dlmyb1-sx基因序列。
26.pcr扩增完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后利用simgen公司的凝胶dna回收试剂盒(货号：2001050)回收扩增的目标dna，通过无缝克隆的方法将dlmyb1-hp和dlmyb1-hp-sx组装到用ecor i和xho i酶切后的psak277载体上，分别命名为psak277-dlmyb1-hp和psak277-dlmyb1-sx超表达载体，进而将gibsion组装的产物转化大肠杆菌，经过菌液pcr检测后按照simgen公司的快速质粒dna小量试剂盒(货号：1005250)提取质粒，送华大基因公司测序。测序结果返回后利用clustal软件比对两个基因之间的核苷酸和氨基酸序列差异。
27.具体请参阅图1，序列比对发现dlmyb1-hp和dlmyb1-sx编码的氨基酸序列有较大差异，多个位置氨基酸序列不一样，且和同科植物荔枝的花色苷关键调控基因lcmyb1氨基
酸序列也有较大差异。
28.2.烟草瞬时表达和转基因实验
29.2.1.将得到的psak277-dlmyb1-hp和psak277-dlmyb1-xs超表达载体通过电转的方法转化农杆菌gv3101感受态，用特异引物agaagacgttccaaccacgtct和tcataggcgtctcgcatatctc菌液pcr检测正确后备用。挑取含有psak277-dlmyb1-hp和psak277-dlmyb1-xs超表达载体的农杆菌。psak277-dlmyb1-hp和psak277-dlmyb1-xs超表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素(100mg/l)的液体lb培养基中，28℃，300rpm培养至od
600
约为2之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用maa(10mm mes(2-[n-morpholino]ethanesulfonic acid)ph 5.6，10mm mgcl2，100μm acetosyringone)悬浮菌体od
600
至1.0左右；用不含针头的注射器将含有psak277-dlmyb1-hp和psak277-dlmyb1-xs表达载体的农杆菌分别注射烟草背面。注射5～6d后观察拍照并采集样品分析花青苷含量。
[0030]
具体请参看图3，其中图3中的a为瞬时表达石硖龙眼dlmyb1-xs和dlmyb1-hp基因烟草叶片表型，b为花色苷含量。
[0031]
2.2.烟草稳定遗传转化
[0032]
农杆菌准备：在超净工作台，取yep液体培养基，加入相应抗生素，然后分装在50ml离心管中，每管约5ml。取检测正确的农杆菌100μl于上述培养基中，置于28℃摇床上过夜培养。取出菌液，将菌液6000rpm离心5min。倒去上清液，用约50ml msb液体培养基重悬菌体，备用。
[0033]
①
取健康成熟中等大小的叶片放于自来水中。
[0034]
②
用0.5％次氯酸钠消毒10mi n。
[0035]
③
用灭菌水清洗3次。
[0036]
④
于培养基皿中倒入少量灭菌水(薄薄一层即可)，在无菌水中将叶片切成约0.5cm2大小的外植体(去掉叶片的边缘部分以及主脉)，需约需90个左右外植体。
[0037]
⑤
将切好的外植体于上述重悬好的菌液中浸染约10min。
[0038]
⑥
在预先制备好的共培养培养基上铺上一张灭过菌的滤纸，将浸染完成后的外植体正面向上铺于共培养培养基。
[0039]
⑦
做好标记和记录，将完成实验的培养基放在避光的纸箱中28℃下暗培养2d，取出时可见外植体边缘微卷，且有些许泛白。
[0040]
⑧
共培养2d后将外植体转入筛选培养基上进行选择培养(还要注意，叶片正面向上)。
[0041]
⑨
2周后继代将叶片转入筛选培养基上培养，以后每2周继代一次。
[0042]
注:若培养过程中发现切口往上翘，需重新放置叶片，尽量让切口接触培养基表面。以便充分吸收培养基中养分。期间定期观察，污染后及时更换。
[0043]
⑩
约四周后，筛选培养基上会诱导产生抗性芽，在抗性芽生长至1-2cm时(可以稍大点)，将抗性芽切下，转入生根培养基中，诱导根的形成。待抗性芽生根，且幼苗高度长至瓶高2/3以上时，将苗取出，清洗干净根部的培养基，放于清水中，置于窗台上炼苗。让其接触自然环境，适应自然环境中的光照、温度和湿度。炼苗约2-3天后，移栽到大棚的盆土里面，浇透水。
[0044]
各阶段培养如下：
[0045]
①
msb液体培养基：4.4g/l ms 30g/l蔗糖 2.0mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 100μm as ph 5.7。分多瓶灭菌后备用。
[0046]
②
共培养培养基：4.4g/l ms 30g/l蔗糖 8g/l琼脂 2.0mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 100μm as ph5.7，灭菌后分装备用。
[0047]
③
第一次筛选培养基：4.4g/l ms 30g/l蔗糖 8g/l琼脂 2.0mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 100mg/l km 400mg/l cef ph5.7，灭菌后分装备用。
[0048]
④
生根培养基：4.4g/l ms 30g/l蔗糖 8g/l琼脂 100mg/l km 400mg/l cef ph 5.7。
[0049]
在烟草叶片瞬时转化dlmyb1-hp基因的部分的花色苷含量为0.016mg/g，而瞬时转化dlmyb1-xs基因部分的花色苷含量为：0.001mg/g。
[0050]
用杭州新景生物公司植物dna试剂盒(3201050)提取抗性候选植株dna，使用特异引物atgccggaaaagctgtagattg和catgcgatcataggcgtctcgcat扩增目的基因，检测目的基因是否已经整合到烟草中。从图2可以看出，我们选择的三个转dlmyb1-hp基因和dlmyb1-sx基因的烟草dna都能扩增出目标条带大小，而野生型w38和h2o对照不能扩增，说明dlmyb1-hp基因和dlmyb1-sx基因都成功转入w38烟草中。
[0051]
稳定转化dlmyb1-hp基因植株叶片积累大量花色苷为0.0262mg/g为红色，而稳定转化dlmyb1-sx基因的叶片只有很少量的花色苷积累，仅为0.0042mg/g，转化dlmyb1-hp基因植株叶片花色苷含量是转化dlmyb1-sx基因的叶片的62倍。
[0052]
结果如图4所示。(花青苷含量测定方法为：花色素苷含量的测定采用ph差示法，参照wrolstad等(1982)的试验方法，具体步骤为：取萝卜组织0.1g样品于3ml浸提液(甲醇；水：浓盐酸85：12：3)中，室温避光充分浸提(约5-6小时)。配制buffer 1和buffer 2，buffer 1：0.2mol/l kcl-0.2mol/l hcl(25：67)，ph＝1；buffer 2：1mol/l naac-0.4mol/l hcl(100：150)，ph＝5。取0.5ml浸提液于试管中分别加入2ml的buffer 1和buffer 2，用紫外分光光度计测定它们在530nm下吸光值。
[0053]
根据经验公式计算结果，公式如下：花色苷含量(mg/g)＝δod
530
×5×3×
445.2/29600
×
0.1，其中5为稀释倍数，3为提取液体积，445.2为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；29600为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔比吸收系数(mol-1
.ml-1
)，0.1表示样品重量。)
[0054]
由此，综合上述可知：
[0055]
本发明从红皮龙眼中发现了一个调控花色苷生物合成的基因dlmyb1-hp，该基因在红皮龙眼的各个组织中都表达，通过构建超表达载体在烟草中瞬时表达或者在稳定转基因都可以使原不含花色苷的叶片积累大量的花色苷，说明该基因具有很强的促进花色苷合成的功能，为利用该基因进行分子遗传概念提供了理论和技术基础。
[0056]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
[0057]
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]