一种金/锰的仿生纳米材料及其制备方法和在制备肿瘤诊疗药物中的应用

1.本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种金/锰的仿生纳米材料及其制备方法和在制备肿瘤诊疗药物中的应用。


背景技术：

2.免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断(icb)疗法，促使癌症治疗的发生了变革性的进展。然而，药物肿瘤靶向性差引起的低的效价比和以促炎免疫细胞缺乏、肿瘤抗原的暴露不足、免疫抑制性肿瘤微环境为特征的冷肿瘤是目前免疫治疗失败的主要原因。因此具有主动靶向肿瘤组织和逆转冷肿瘤的治疗策略急需被开发。
3.光热疗法利用光热剂将光子转化为热能并触发局部热效应，在过去几十年中迅速发展用于癌症治疗。近年来，近红外第二(nir-ii，1000-1700nm)窗口的光热剂因其更深的组织穿透和更高的成像分辨率而受到更多关注。因此，nir-ii窗口光热剂的研发成为热点。最近，金基纳米材料由于其独特的等离子体、声学、电学和形态学特性，由于光声成像(pai)和ptt能力而备受关注。目前，已有研究证明金纳米材料在nir-ii区具有可调谐的局域表面等离子体共振(lspr)能力，使其在肿瘤治疗诊断学中具有广泛的应用。然而单一治疗策略往往不能完全的消除肿瘤，组合疗法是目前肿瘤治疗的一大趋势。化学动力学疗法(cdt)是一种依靠类芬顿反应产生活性氧等产物来杀伤肿瘤细胞的新型肿瘤治疗技术，广泛应用于抗肿瘤纳米药物的开发。锰是人体必需的金属元素，是设计和合成多功能癌症治疗诊断剂中最常用的材料之一。例如，二氧化锰通过降解释放的锰离子作为过氧化氢酶，以消除过氧化氢并产生活性氧来杀死癌细胞。除了作为cdt试剂外，锰离子还是癌症t1加权的磁共振成像(mri)的最佳替代试剂之一。然而，单纯的金或者锰制剂并不具为主动靶向肿瘤微环境的能力。
4.最新的研究表明，干扰素基因刺激物(sting)信号通路在激活抗肿瘤免疫反应和重塑肿瘤微环境，将冷肿瘤转为热肿瘤中起着至关重要的作用。已有的研究表明，金属离子在免疫调节中起着至关重要的作用，如钙离子抑制腺苷代谢，锌离子增强t细胞的抗肿瘤作用，锰离子激活cgas-sting信号通路。更重要的是，一些基于锰离子的治疗策略在临床试验中取得了显着进展，例如已完成的1期临床试验(clinicaltrials.gov，nct03991559)表明，锰离子可通过促进1型干扰素、肿瘤坏死因子等来提高抗肿瘤免疫。
5.因此，开发一种既可以主动靶向肿瘤微环境，又能高效逆转冷肿瘤为热肿瘤的纳米平台，是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术不足，提供了一种金/锰的仿生纳米材料。
7.本发明的另一目的在于提供所述金/锰的仿生纳米材料的制备方法。
8.本发明的另一目的在于提供所述金/锰的仿生纳米材料的应用。
9.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现的：
10.一种金/锰的仿生纳米材料，所述仿生纳米材料包括金锰复合颗粒，以及包覆在金锰复合颗粒外的髓源抑制性细胞膜；
11.所述金锰复合颗粒从内至外依次为金纳米棒层、包覆在金纳米棒层外的二氧化硅层、包覆在二氧化硅层外的二氧化锰层；
12.所述金锰复合颗粒的平均粒径为114.5～117.5nm。
13.本发明所述的金/锰的仿生纳米材料，通过特殊的包覆结构和尺寸，赋予颗粒在近红外第二窗口1000～1100nm处具有吸收峰。这种性质使其可以配合光热治疗、光热成像或光声成像。髓源抑制性细胞膜赋予颗粒主动靶向肿瘤位点的能力，因此可以带来减毒增效的效果。
14.优选地，所述髓源抑制性细胞膜层的髓源抑制性细胞为骨髓来源的髓源抑制性细胞。抑制性细胞在不同的器官中都有分布，而骨髓中分离的抑制性细胞不仅纯度更高，而且比其他来源的抑制性细胞具有更好的肿瘤靶向能力。
15.包覆在金锰复合颗粒外的髓源抑制性细胞膜的厚度并没有特别限制，优选地，所述金/锰的仿生纳米材料的平均粒径为127～131nm。即在金锰复合颗粒的表面覆盖单层的髓源抑制性细胞膜。优选地，形成所述金纳米棒层的金纳米棒的平均长度为50～65nm，平均长短径比为2.5～4.0。
16.优选地，二氧化硅层的平均厚度为20～25nm。
17.优选地，二氧化锰层的平均厚度为8～10nm。
18.本发明中，所述厚度是指单侧连续材料的厚度。
19.所述金/锰的仿生纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
20.s1.制备金纳米棒；
21.s2.在金纳米棒的表面形成所述二氧化硅层；
22.s3.在所述二氧化硅层的表面形成所述二氧化锰层，得到金锰复合颗粒；
23.s4.在所述金锰复合颗粒的表面包覆髓源抑制性细胞膜。
24.s1.中，所述金纳米棒可以采用现有的制备方法制备，优选地，采用如下方法制备：
25.s11.制备金种子溶液；
26.s12.使金种子溶液生长，并获得金纳米棒。
27.作为一种具体的方案，所述金纳米棒通过如下方法制备：
28.s11.将四氯金酸与溴化十六烷基三甲基铵、超纯水混合，在搅拌下，将硼氢化钠加入上述混合液中，搅拌，得到金种子溶液；
29.s12.将金种子溶液进行老化，配置溴化十六烷基三甲基铵、四氯金酸、维生素c、硫酸、硝酸银组成的溶液体系，混合均匀后，加入老化后的金种子溶液中，使金种子溶液生长，过夜，离心分离得到所述金纳米棒gnrs。
30.作为另一种可以实现的方案，所述金纳米棒还可以通过电化学法实现，以金板为阳极，铂板为阴极，十六烷基三甲基溴化铵和四溴十二烷基铵作为电解池溶液，添加少量丙酮和乙烷作为促进剂，整个反应过程在超声下进行，最终收集电解液中的金纳米棒gnrs。
31.优选地，s2.中，在金纳米棒的表面形成所述二氧化硅层按照如下方法进行：
32.将金纳米棒分散为水悬浮液，调节ph值为碱性，加入硅酸四乙酯，使得在金纳米棒
的表面形成二氧化硅层。控制反应的时间，以获得理想厚度的二氧化硅层，得到表面包覆有二氧化硅层的颗粒gnrs@sio2。优选地，反应时间为22～26小时。更优选地，所述反应时间为24小时。
33.优选地，s3.中，在所述二氧化硅层的表面形成所述二氧化锰层按照如下方法进行：
34.将s2.处理后的gnrs@sio2颗粒分散为悬浮液，在超声处理下往悬浮液中滴加高锰酸钾，控制反应的时间，以获得理想厚度的二氧化锰层，然后离心得金锰复合颗粒gnrs@sio2@mno2(gsm)。优选地，反应时间为22～26小时。更优选地，所述反应时间为24小时。
35.优选地，s4.中，在所述金锰复合颗粒的表面包覆髓源抑制性细胞膜按照如下方法进行：
36.s41.获取髓源抑制性细胞，提纯，并处理得到髓源抑制性细胞膜；
37.s42.将髓源抑制性膜转换为髓源抑制性细胞膜囊泡，并将髓源抑制性细胞膜囊泡与gnrs@sio2@mno2(gsm)混合并通过微孔膜挤出，去除多余的髓源抑制性细胞膜囊泡，得到所述金/锰的仿生纳米材料(gsmm)。
38.本发明所述金/锰的仿生纳米材料在1000～1100nm处有显著的第二吸收峰，表明可以作为近红外二区的激发材料。最优选地，所述金/锰的仿生纳米材料在1064nm处有显著的第二吸收峰。
39.本发明所述金/锰的仿生纳米材料在1064nm处激光照射下可升温可达50～56℃，而一般认为在肿瘤的光热治疗的合适温度是52摄氏度左右的温度。过低温度治疗效果不好，过高温度又会损耗正常组织。并且，所述金/锰的仿生纳米材料在900～1300nm激光器作用下升温曲线呈现浓度依赖和激光强度依赖的增强方式，具有很好的光热稳定性。
40.作为一种更具体的可以获得本发明所述金/锰的仿生纳米材料的方式，提供一种详细的制备方法，包括如下步骤：
41.s1.制备金纳米棒，使得金纳米棒的平均长度为50～65nm，长径比为2.5～4.0；
42.s2.将s1.得到的金纳米棒用25ml超纯水重新分散，然后将5ml重新分散得到的金纳米棒悬浮液用超纯水稀释至20ml，ph值调至10。然后在温和搅拌下将30μl的硅酸四乙酯加入上述溶液中。该过程以30分钟的间隔重复四次。然后将整个系统在30℃下连续搅拌20～26小时，离心分离得到产物。
43.s3.在s2.得到的产物用10ml超纯水重新分散，得到悬浮液，然后在超声处理下将8ml的高锰酸钾滴加到上述悬浮液中。20～26小时后，通过离心获得，金锰复合颗粒；
44.s4.制备纯化的髓源抑制性细胞膜，使用微型挤出机将髓源抑制性细胞膜多次通过400nm和200nm微孔膜，获得髓源抑制性细胞膜囊泡。本领域技术人员知道，采用多次通过微孔膜可以获得更均一的囊泡。随后，将髓源抑制性细胞膜囊泡和s3.制备的金锰复合颗粒混合并通过200nm微孔膜挤出11次，通过离心去除多余的髓源抑制性细胞膜囊泡，获得所述金/锰的仿生纳米材料。
45.所述金/锰的仿生纳米材料在作为核磁共振成像的增敏剂的应用。
46.所述金/锰的仿生纳米材料在作为近红外光敏剂中的应用。近红外光敏剂可以用于光热治疗、光热成像或光声成像。
47.所述金/锰的仿生纳米材料在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述金/锰的仿生
纳米材料在酸性肿瘤微环境中降解释放的锰离子既可以作为芬顿样反应的催化剂又能直接激活sting信号促进抗肿瘤免疫，另外基于锰离子可以通过核磁共振技术实现肿瘤成像，最终实现肿瘤的多模型成像和光热、光动力治疗介导免疫治疗。
48.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
49.本发明提供一种金/锰的仿生纳米材料。所述金/锰的仿生纳米材料具有生物安全性高、体内循环时间长、主动靶向肿瘤微环境和肿瘤微环境响应等优点，可以作为近红外二区的光敏剂用于光热治疗、光热成像或光声成像或是实现肿瘤的多模型成像和光热、光动力治疗介导免疫治疗。
附图说明
50.图1为实施例1制备活性细胞的提纯分选情况示意图；
51.图2为实施例1的gsm和gsmm纳米颗粒动态光散射粒度测试结果图。
52.图3为tem观察测定实施例1各步骤得到颗粒的情况图；
53.图4为实施例1各步骤得到的颗粒的紫外-可见光-近红外光吸收波谱图；
54.图5为实施例1的gsmm纳米颗粒在1064nm激光器作用下的光热性能图；
55.图6为实施例1的gsmm纳米颗粒对芬顿样反应的催化效果示意图；
56.图7为实施例1的gsmm纳米颗粒对b16/f10细胞增值效果示意图；
57.图8为实施例1的gsmm纳米颗粒在不同浓度下促进b16/f10细胞活性氧产生的效果示意图；
58.图9为实施例1的gsmm纳米颗粒处理小鼠后在不同时间点的肿瘤成像图；
59.图10为实施例1的gsmm纳米颗粒光声成像效果图；
60.图11为实施例1的gsmm纳米颗粒及其联合光热治疗与小鼠肿瘤的抑制效果示意图；
61.图12为图11对应小鼠肿瘤微环境中细胞群体的变化示意图。
具体实施方式
62.下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
63.实施例1
64.s1.制备金纳米棒；
65.s11.将166.7μl的四氯金酸(haucl4，5mm)、2.5ml的溴化十六烷基三甲基铵(ctab，100mm)和466μl超纯水混合。在转速1200rpm下搅拌，将200μl的硼氢化钠(nabh4，10mm)快速注入上述溶液中。搅拌2分钟后，得到金种子溶液。
66.s12.将金种子溶液在37℃下老化30分钟。配置50ml的ctab(100mm)、5ml的haucl4(5mm)、500μl的维生素c(aa，100mm)、1ml的硫酸(h2so4，500mm)和500μl硝酸银(agno3，10mm)组成的溶液体系中。将溶液以600rpm搅拌2分钟，然后加入120μl金种子溶液以启动生长。将反应保持在37℃过夜，次日离心收集获得金纳米棒(gnrs)，并用超纯水反复洗涤以去除多余的ctab。所得金纳米棒平均长度50nm，平均长短径比3.85。
67.s2.在金纳米棒的表面形成所述二氧化硅层；
68.将上述得到的金纳米棒(gnrs)用25ml超纯水重新分散。
69.将5ml重新分散得到的gnrs悬浮液用超纯水稀释至20ml，ph值调至10。然后在温和搅拌下将30μl的硅酸四乙酯(teos)加入上述溶液中。该过程以30分钟的间隔重复四次。然后将整个系统在30℃下连续搅拌24小时。离心获得的gnrs@sio2。
70.s3.在所述二氧化硅层的表面形成所述二氧化锰层；
71.将上述获得的gnrs@sio2用10ml超纯水重新分散，得到悬浮液，然后在超声处理下将8ml的高锰酸钾(kmno4，4mm)滴加到gnr@sio2的悬浮液中。24小时后，通过离心获得gnrs@sio2@mno2(gsm)纳米颗粒并用超纯水重新分散。
72.s4.在所述金锰复合颗粒的表面包覆髓源抑制性细胞膜。
73.s41.从荷瘤c57bl/6小鼠身上分离出股骨。灌洗法将骨髓内容物取出，然后用依次用70μm、40μm滤网过滤，得到的细胞悬液用stemcell公司小鼠髓源抑制性细胞(mdscs)阴选试剂盒分选提纯mdscs，结果如图1所示，流式细胞术测得mdscs的纯度超过95％。mdscs经杜恩斯匀浆器处理。20000g离心30分钟，丢弃沉淀物，后使用超速离心机将上清液再次以80000g离心2小时。得到的细胞膜的沉淀在1mm的edta和10mm的tris-hcl中洗涤一次，得到的纯化的mdscs膜。
74.s42.使用微型挤出机将mdscs膜多次通过400nm和200nm微孔膜，获得mdscs膜囊泡。随后，将mdscs膜囊泡和gnrs@sio2@mno2混合并通过200nm微孔膜挤出11次，通过离心去除多余的mdscs膜囊泡以获得所述金/锰的仿生纳米材料gsmm。
75.实施例2
76.具体操作与实施例1类似，区别在于，步骤s1.金纳米棒制备方法采用电化学法：该方法在双电极电池下完成，金板为阳极，铂板为阴极，十六烷基三甲基溴化铵和四溴十二烷基铵(体积比9：1)作为电解池溶液，添加0.1％丙酮和0.1％乙烷作为促进剂，整个反应过程在25khz超声下进行，最终收集电解液中的金纳米棒。其余步骤及操作与实施例1相同。实施例2制备的金纳米棒所得金纳米棒平均长度60nm，平均长短径比3.0。
77.实施例3
78.具体操作与实施例1类似，区别在于，步骤s41.选取的髓源抑制性细胞膜来源于小鼠外周血，心脏采血方式采集荷瘤c57bl/6小鼠全身外周血，percoll分离液密度梯度离心处理，收集单核细胞和粒细胞层的细胞，pbs重悬，40μm滤网过滤，得到的细胞悬液用stemcell公司小鼠髓源抑制性细胞(mdscs)阴选试剂盒分选提纯mdscs，其余步骤及操作与实施例1相同。
79.实施例4
80.具体操作与实施例1类似，区别在于，步骤s41.选取的髓源抑制性细胞膜来源于小鼠脾脏，从荷瘤c57bl/6小鼠身上分离出脾脏，研磨、通过70μm滤网，去除红细胞后再次经40μm滤网过滤，得到的细胞悬液用stemcell公司小鼠髓源抑制性细胞(mdscs)阴选试剂盒分选提纯mdscs，其余步骤及操作与实施例1相同。
81.对实施例1各步骤制备的材料进行性能分析，详细如下所示：
82.(1)使用动态光散射仪(dls)检测上述gsm和gsmm纳米粒，结果如图2所示，动态光散射粒度仪(dls)测定gsm和gsmm纳米粒的平均粒径为分别为115.98nm和129.07nm。
83.(2)使用透射电子显微镜(tem)观察和测定gnrs、gnrs@sio2、gsm和gsmm纳米颗粒的形貌、分布和粒径大小。如图3所示，镜下观察再次验证了纳米颗粒的尺寸，金纳米棒平均长短径比为3.85；gsmm和gsm的粒径差值近似于细胞膜的厚度，佐证了细胞膜的成果包覆。
84.(3)检测gnrs、gnrs@sio2、gsm和gsmm纳米颗粒的紫外-可见光-近红外光吸收波谱。结果如图4所示，gnrs的吸收峰主要出现在820nm处，gnrs@sio2的吸收峰主要出现在830nm处，gsm和gsmm的在1064nm处又显著的第二吸收峰，表明gsm和gsmm吸收峰的红移，可以作为近红外二区的激发材料来应用。
85.(4)检测gsmm纳米颗粒在1064nm激光器作用下的光热性能。如图5所示，gsmm的升温曲线呈现浓度依赖和激光强度依赖的增强方式，同时具有很好的光热稳定性。并且本发明所述金/锰的仿生纳米材料在1064nm处激光照射下可升温可达50～56℃。
86.(5)检测gsmm对芬顿样反应的催化效果。将80μg/ml的gsmm与10μg/ml的甲苯胺蓝(mb)、25mm碳酸氢钠(nahco3)、10mm过氧化氢(h2o2)以不同排列组合反应30分钟，酶标仪检测各组反应体系在663nm处的吸光度。结果如图6所示，在酸性环境下，gsmm能够催化h2o2发生芬顿样反应，鉴于肿瘤微环境是酸性的，也证实了gsmm是一种肿瘤微环境响应的纳米材料。
87.(6)在有或无激光照射下，常氧培养后，检测gsmm对b16/f10细胞增值效果(1064nm，0.6w/cm2，5分钟或者10分钟)，结果如图7所示，图7中，在每一个对应浓度下，从左至右分别是0分钟，5分钟及10分钟的情况。无光照条件下gsmm对b16/f10细胞毒性ic50在20μg/ml。gsmm在20μg/ml以下的浓度对b16/f10细胞的光毒性不明显。gsmm在40μg/ml以上的浓度对b16/f10细胞的光毒性较为显著。
88.(7)在无激光照射下，常氧培养后，检测不同浓度的gsmm促进b16/f10细胞活性氧产生的效果。结果如图8所示，gsmm在20μg/ml以下的浓度，b16/f10细胞中活性氧极少。在40μg/ml的gsmm作用下，b16/f10细胞中产生大量的活性氧，表明该浓度下对细胞的杀伤作用较强。
89.对实施例1制备的gsmm进行体内性能分析，详细如下所示：
90.(1)检测gsmm纳米颗粒作为核磁共振增敏剂增强肿瘤核磁共振成像以及信号强度方面的作用。将b16/f10恶性黑色素瘤细胞荷瘤的c57bl/6小鼠(n＝5)给予gsmm处理(小鼠尾静脉注射，5mg/kg)，小动物核磁共振仪(布鲁克，7.0t)采集不同时间点的肿瘤成像图片。如图9所示，gsmm注射后成像分辨率显著高于注射前，在注射4小鼠左右信号强度的增加最显著，表明gsmm是一种优异的核磁共振成像的增敏剂。
91.(2)检测gsmm纳米颗粒光声成像的效果。将b16/f10恶性黑色素瘤细胞荷瘤的balb/c裸鼠随机分2组(n＝5)，分别给予gsmm或者gsm处理(小鼠尾静脉注射，5mg/kg)，小动物光声成像系统采集不同时间点的小鼠全身成像图片。如图10所示，小鼠背部肿瘤清晰成像，同时给与gsmm处理的小鼠肿瘤成像效果显著优于gsm处理组，也进一步表明gsmm主动靶向肿瘤微环境的能力。
92.(3)检测gsmm纳米颗粒肿瘤的免疫效果以及对肿瘤微环境的调控作用。将b16/f10恶性黑色素瘤细胞荷瘤的c57bl/6小鼠随机分成5组(n＝5)，组1(g1)：pbs、组2(g2)：pbs 光照、组3(g3)：gsm 光照、组4(g4)：gsmm、组5(g5)：gsmm 光照。gsm和gsmm的注射剂量为5mg/kg。在药物注射4小鼠后，组2、组3和组5的小鼠给予1064nm激光照射处理10分钟(激光强度
为0.6w/cm2)。治疗频率为5天一次。时间期间密切观察小鼠状态，隔天测了小鼠肿瘤的体积。结果如图11所示，gsmm联合光热治疗对小鼠肿瘤的抑制效果最为显著，而单纯的使用gsmm治疗，小鼠肿瘤的抑制效果并不明显。给予光热治疗的三组小鼠肿瘤的成长分别受到了不同程度的抑制。从研究结果可以看出gsmm具备高效的光热抑瘤能力。治疗结束后(给药后的第0天)小鼠给予安乐死处理，解剖取得完整的肿瘤，制备单细胞悬液，进行细胞表面染色，然后利用流式细胞术检测肿瘤微环境中细胞群体的变化，如图12所示，a图显示了白细胞的分布图，b图显示了也各个细胞群体的设门策略，c图展示各个细胞亚群的统计数值，结果显示gsmm联合光热治疗组，肿瘤组织中浸润的的cd45

的白细胞增多；发挥负性免疫作用的cd11b

gr-1

的髓源抑制性细胞和cd206

cd11b

f4/80

m2型巨噬细胞的数量减少；而发挥抗肿瘤作用的cd11b

cd11c

树突状细胞细胞、cd86

cd11b

f4/80

m1型巨噬细胞、cd4

t细胞和cd8

t细胞的数量增多。表明了gsmm联合光热治疗提高了抗肿瘤免疫反应。
93.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。