一种免疫细胞冻存液和应用及细胞冻存方法和复苏方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种免疫细胞冻存液和应用及细胞冻存方法和复苏方法。


背景技术：

2.细胞免疫治疗是指直接或间接利用免疫细胞对肿瘤患者进行有效治疗的方法；备受关注的细胞免疫治疗已从早期的淋巴因子激活的杀伤细胞、多种细胞因子诱导的杀伤细胞及细胞毒性t淋巴细胞、自然杀伤细胞等传统或非特异性细胞疗法，发展到特异性的car-nk(嵌合抗原受体修饰的nk细胞)和tcr-t(t细胞受体嵌合型t细胞)等细胞疗法；随着细胞治疗在临床上的广泛应用，细胞制品保存和低温运输面临巨大的挑战。
3.在室温环境中，细胞代谢旺盛，这些生理活动产生自由基和脂质过氧化物会引起细胞内环境变化，造成细胞溶胀和死亡；在细胞运输过程中，这一问题更为突出；而在液氮冷冻状态下，细胞几乎停止生命活动和新陈代谢，因此通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行运输；但是细胞冷冻和解冻时，容易受到溶液损伤和冰晶损伤，引发细胞死亡。因此，需要在细胞冷冻时采用细胞冻存液来保护细胞，以减少溶液损伤和冰晶损伤，从而减少细胞死亡。
4.目前，市面上的免疫细胞冻存液多以胎牛血清、高比例dmso、患者自体血浆、非临床应用级试剂配制而成，而动物血清有引入动物病原菌污染的潜在危险，dmso具有一定的毒性，在冷冻免疫细胞时使免疫细胞存活率较低。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种免疫细胞冻存液，其可以有效保护免疫细胞，在冷冻免疫细胞时有效提高免疫细胞的存活率。
6.本发明的第二个目的在于提供一种免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。
7.本发明的第三个目的在于提供免疫细胞的冻存方法，其使用免疫细胞冻存液对免疫细胞冻存。
8.本发明的第四个目的在于提供免疫细胞的复苏方法，其对冻存的免疫细胞进行复苏。
9.本发明的实施例通过以下技术方案实现：
10.一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇10～15％、右旋糖酐20～25％、细胞培养基5～10％、黄岑5～10％、参麦3～6％、il-2 3～6％、γ-干扰素2～8％、人血白蛋白5～10％和人自体血浆10～20％。
11.本发明将黄岑、参麦、il-2和γ-干扰素进行联用，可以促进淋巴细胞的增殖与分化，增强免疫细胞的活力及对病毒和病菌的抵抗能力。且有效保证免疫细胞冻存液的稳定性。
12.进一步地，所述il-2的添加量为2～5万iu，所述γ-干扰素的添加量为2～5万iu。
13.进一步地，所述细胞培养基为imdm培养基、rpmi-1640培养基或mccoy5a培养基。
14.一种免疫细胞冻存液在冻存免疫细胞中的应用。
15.进一步地，所述免疫细胞为t淋巴细胞、b淋巴细胞、k淋巴细胞或nk细胞。
16.一种免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：
17.s1：采用全血提取免疫细胞；
18.s2：配制免疫细胞冻存液；
19.s3：将提取的免疫细胞按比例加入配制的免疫细胞冻存液，先于4～8℃保存2～4h，再于-80℃保存10～12h，最后转移保存于液氮中，即将免疫细胞冻存。
20.进一步地，所述步骤s1中采用全血提取免疫细胞的具体方法为：(1)取0.5ml全血送检计数，取50～100ml全血于900～1200g离心10～15min，分离出上层血浆；(2)取下层浓血分装20ml/管，按体积比1:1加入生理盐水，混匀；(3)于400～600g离心20～25min，吸取白膜层单个核细胞；(4)用1倍以上生理盐水洗涤白膜层单个核细胞，于900～1200g离心5～10min，去除上清；(5)用40ml生理盐水洗涤细胞沉淀，于900～1200g离心5～10min，去除上清；(6)收集细胞沉淀即为免疫细胞。
21.进一步地，所述步骤s3中每1000～1500万iu免疫细胞中加入1.5～2ml免疫细胞冻存液。
22.一种免疫细胞复苏方法，取冻存的免疫细胞于38～40℃水浴30～50s快速解冻，混入培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养20～24h，即得到复苏的免疫细胞。
23.进一步地，所述培养基为添加有15％体积比人自体血浆的t551培养基。
24.本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
25.1.本发明的免疫细胞冻存液主成分采用丙三醇而不采用二甲亚砜，丙三醇是无色、无臭、味甜、澄明的黏稠液体，丙三醇是甘油三酯分子的骨架成分，甘油三酯代谢的最终产物是甘油和脂肪酸，对细胞无毒无害。
26.2.本发明的免疫细胞冻存液采用较安全的组分，减少了破坏细胞活性的潜在危险；且本发明的免疫细胞冻存液中不存在抗体、补体等成分，杂蛋白少，减少对免疫细胞的活性影响。
27.3.本发明的免疫细胞冻存液采用的成分简单，制备方法简单，成本较低，仅为市面上细胞冻存液成本的1/5～1/3。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.下面对本发明实施例提供的抗肿瘤联合组合物及其制备方法和应用进行具体说明。
30.实施例1
31.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇10％、右旋糖酐25％、imdm培养基10％、黄岑5％、参麦6％、il-2 6％、γ-干扰素8％、人血白蛋白
10％和人自体血浆20％。其中，所述il-2的添加量为2万iu，所述γ-干扰素的添加量为2万iu。
32.一种免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：
33.s1：采用全血提取免疫细胞，具体方法为：(1)取0.5ml全血送检计数，取50ml全血于900g离心10min，分离出上层血浆；(2)取下层浓血分装20ml/管，按体积比1:1加入生理盐水，混匀；(3)于400g离心20min，吸取白膜层单个核细胞；(4)用1倍生理盐水洗涤白膜层单个核细胞，于900g离心5min，去除上清；(5)用40ml生理盐水洗涤细胞沉淀，于900g离心5min，去除上清；(6)收集细胞沉淀即为免疫细胞；
34.s2：将各组分在无菌环境下混合配制免疫细胞冻存液；
35.s3：每1000万iu免疫细胞中加入1.5ml免疫细胞冻存液，先于4℃保存2h，再于-80℃保存10h，最后转移保存于液氮中，即将免疫细胞冻存。
36.一种免疫细胞复苏方法，取冻存的免疫细胞于38℃水浴50s快速解冻，混入添加有15％体积比人自体血浆的t551培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养20h，即得到复苏的免疫细胞。
37.实施例2
38.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇15％、右旋糖酐20％、rpmi-1640培养基10％、黄岑10％、参麦6％、il-2 6％、γ-干扰素8％、人血白蛋白10％和人自体血浆15％。其中，所述il-2的添加量为5万iu，所述γ-干扰素的添加量为3万iu。
39.一种免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：
40.s1：采用全血提取免疫细胞，具体方法为：(1)取0.5ml全血送检计数，取100ml全血于1200g离心15min，分离出上层血浆；(2)取下层浓血分装20ml/管，按体积比1:1加入生理盐水，混匀；(3)于600g离心25min，吸取白膜层单个核细胞；(4)用1倍以上生理盐水洗涤白膜层单个核细胞，于1200g离心10min，去除上清；(5)用40ml生理盐水洗涤细胞沉淀，于1200g离心10min，去除上清；(6)收集细胞沉淀即为免疫细胞；
41.s2：将各组分在无菌环境下混合配制免疫细胞冻存液；
42.s3：每1500万iu免疫细胞中加入2ml免疫细胞冻存液，先于8℃保存4h，再于-80℃保存12h，最后转移保存于液氮中，即将免疫细胞冻存。
43.一种免疫细胞复苏方法，取冻存的免疫细胞于40℃水浴30s快速解冻，混入添加有15％体积比人自体血浆的t551培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养20h，即得到复苏的免疫细胞。
44.实施例3
45.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇12％、右旋糖酐24％、mccoy5a培养基8％、黄岑8％、参麦5％、il-25％、γ-干扰素8％、人血白蛋白10％和人自体血浆20％。其中，所述il-2的添加量为4万iu，所述γ-干扰素的添加量为3万iu。
46.一种免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：
47.s1：采用全血提取免疫细胞，具体方法为：(1)取0.5ml全血送检计数，取80ml全血于1000g离心12min，分离出上层血浆；(2)取下层浓血分装20ml/管，按体积比1:1加入生理
盐水，混匀；(3)于500g离心22min，吸取白膜层单个核细胞；(4)用1倍以上生理盐水洗涤白膜层单个核细胞，于1000g离心8min，去除上清；(5)用40ml生理盐水洗涤细胞沉淀，于1000g离心8min，去除上清；(6)收集细胞沉淀即为免疫细胞；
48.s2：将各组分在无菌环境下混合配制免疫细胞冻存液；
49.s3：每1000万iu免疫细胞中加入2ml免疫细胞冻存液，先于5℃保存3h，再于-80℃保存12h，最后转移保存于液氮中，即将免疫细胞冻存。
50.一种免疫细胞复苏方法，取冻存的免疫细胞于40℃水浴40s快速解冻，混入添加有15％体积比人自体血浆的t551培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养22h，即得到复苏的免疫细胞。
51.实施例4
52.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇12％、右旋糖酐23％、rpmi-1640培养基10％、黄岑7％、参麦6％、il-2 6％、γ-干扰素6％、人血白蛋白10％和人自体血浆20％。其中，所述il-2的添加量为4万iu，所述γ-干扰素的添加量为4万iu。
53.一种免疫细胞冻存方法，包括以下步骤：
54.s1：采用全血提取免疫细胞，具体方法为：(1)取0.5ml全血送检计数，取75ml全血于1100g离心10min，分离出上层血浆；(2)取下层浓血分装20ml/管，按体积比1:1加入生理盐水，混匀；(3)于400g离心20min，吸取白膜层单个核细胞；(4)用1倍以上生理盐水洗涤白膜层单个核细胞，于1100g离心10min，去除上清；(5)用40ml生理盐水洗涤细胞沉淀，于1100g离心10min，去除上清；(6)收集细胞沉淀即为免疫细胞；
55.s2：将各组分在无菌环境下混合配制免疫细胞冻存液；
56.s3：每1500万iu免疫细胞中加入1.5ml免疫细胞冻存液，先于6℃保存4h，再于-80℃保存12h，最后转移保存于液氮中，即将免疫细胞冻存。
57.一种免疫细胞复苏方法，取冻存的免疫细胞于38℃水浴45s快速解冻，混入添加有15％体积比人自体血浆的t551培养基，于37℃、5％co2恒温培养箱中培养24h，即得到复苏的免疫细胞。
58.对比例1
59.本对比例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：二甲亚砜15％、右旋糖酐25％、rpmi-1640培养基24％、il-2 6％、人血白蛋白10％和人自体血浆20％。
60.本对比例的免疫细胞冻存方法与复苏方法与实施例1的方法相同。
61.对比例2
62.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：丙三醇15％、右旋糖酐25％、rpmi-1640培养基60％。
63.本对比例的免疫细胞冻存方法与复苏方法与实施例1的方法相同。
64.对比例3
65.本实施例提供一种免疫细胞冻存液，包括以下体积百分比的组分：二甲亚砜45％、胎牛血清培养基35％和人自体血浆20％。
66.本对比例的免疫细胞冻存方法与复苏方法与实施例1的方法相同。
67.实验例
68.按照mtt法检测实施例1～4以及对比例1～3所得到的冻存的免疫细胞和复苏的免疫细胞的细胞浓度和细胞数量。结果如表1所示：
69.表1细胞浓度和细胞数量表
70.[0071][0072]
由表1可以看出，本发明实施例1～4的冻存的免疫细胞和复苏的免疫细胞的细胞活率均比对比例1～3的细胞活率高；对比例1的免疫细胞冻存液只采用二甲亚砜、右旋糖酐、rpmi-1640培养基、il-2、人血白蛋白和人自体血浆；对比例2的免疫细胞冻存液只采用丙三醇、右旋糖酐和rpmi-1640培养基；对比例3的免疫细胞冻存液只采用二甲亚砜、胎牛血清和人自体血浆；证明采用本发明提供的免疫细胞冻存液对免疫细胞冻存时可以有效保护免疫细胞，有效提高免疫细胞的存活率。
[0073]
综上，本发明提供的免疫细胞冻存液，通过一定比例的丙三醇、右旋糖酐、细胞培养基、黄岑、参麦、il-2、γ-干扰素、人血白蛋白和人自体血浆的联合使用，可以有效保护免疫细胞，在冷冻免疫细胞时有效提高免疫细胞的存活率。
[0074]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。