一种盐酸小檗碱含量的检测卡及其制备方法以及黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法与流程

1.本发明涉及检测盐酸小檗碱含量的技术领域，具体涉及一种盐酸小檗碱含量的检测卡及其制备方法以及黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法。


背景技术：

2.黄连具有抗菌、抗病毒、降血脂、降血糖等药理作用，小檗碱为其主要活性成分，与黄连碱、巴马汀及药根碱的含量约占黄连总生物碱的95％，其中小檗碱约占50％。
3.目前国内外用于快速筛选或选择性确认盐酸小檗碱添加的技术也主要为借助高精度仪器设备的仪器分析技术，这些方法样品的预处理要求高、耗时、成本高且无法进行大量样品检测，其应用受到限制，不利于生产基层单位现场检测，也不利于在快速检测市场上推广使用。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种盐酸小檗碱含量的检测卡，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短；本发明的目的之二在于提供一种盐酸小檗碱含量的检测卡的制备方法，对样品结合垫加入胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物进行优化处理，得到灵敏度高的盐酸小檗碱含量的检测卡；本发明的目的之三提供一种黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法，限定了样本前处理方法，在采购前能有效检测黄连中微量的盐酸小檗碱，数据更精准。
5.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
6.一种盐酸小檗碱含量的检测卡，包括壳体和设置在壳体内部的底板，所述壳体包括互相扣合的上壳和下壳，所述底板表面依次设置有吸水材料、层析膜和样品结合垫；其中，层析膜表面依次设有检测线和对照线；上壳设有观察窗和加样孔；样品结合垫设置在加样孔的下方，检测线和对照线设置在观察窗的下方；其中，样品结合垫包埋有胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物，层析膜的检测线包被有盐酸小檗碱单克隆抗体a，对照线包被有羊抗兔二抗抗体。
7.进一步，所述吸水材料为吸水纸。
8.再进一步，所述胶体金的颗粒为10～20nm或20～40nm。10-20nm比20-40nm 的金颗粒小，但显色会比较鲜艳，由于颗粒比较小在标记的时候难度更大， 20-40nm的胶体金金颗粒比较大，显色会比较偏深，颗粒偏大在标记时更稳定，在研发过程中更适合。
9.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
10.上述的盐酸小檗碱含量的检测卡的制备方法，包括以下步骤：
11.1)胶体金与小檗碱单克隆抗体b偶联物偶联，得到胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物；
12.2)将胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物用缓冲液稀释后，得到稀释液，将样
品结合垫浸泡于稀释液中，取出后经真空冷冻干燥后待用；
13.3)将盐酸小檗碱单克隆抗体a包被在层析膜的检测线内，将羊抗兔二抗抗体包被在对照线内，得到层析膜；
14.4)将吸水材料和步骤2)所得的样品结合垫分别搭接在步骤3)所得的层析膜的左右两端，得到搭接后的底板，再将底板与壳体进行组装，得到盐酸小檗碱含量的检测卡。
15.进一步，所述胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物的制备方法：取胶体金溶液，加碳酸钾调节ph到7-8.2，然后加入小檗碱单克隆抗体b，反应后再加入牛血清白蛋白进行封闭，离心，弃上清液，再加入复溶液，冷藏备用。
16.再进一步，所述复溶液为磷酸盐缓冲液、蔗糖、牛血清白蛋白和吐温20的混合溶液。
17.进一步，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液和牛血清白蛋白的混合溶液，稀释倍数为10～50倍。
18.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
19.一种黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法，包括以下步骤：
20.1)黄连样品前处理；
21.2)采用上述的检测卡进行检测；
22.3)通过显色反应直接目测实验结果。
23.进一步，步骤1)中，样品前处理方法具体步骤为：
24.将所述黄连样品切碎，加入提取液进行浸提，提取液包括甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液。
25.再进一步，所述提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～2)。其中，优选以下三个方案：所述提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为0.5：1.5：1。所述提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1：0.5：2。所述提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1.5：1.5：0.5。
26.相比现有技术，本发明的有益效果在于：
27.(1)本发明的盐酸小檗碱含量的检测卡，样品结合垫包埋有胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物，层析膜的检测线包被有盐酸小檗碱单克隆抗体a，对照线包被有羊抗兔二抗抗体，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短。该检测卡是采用双抗体夹心法，具体原理为：当进行检测时，若为阳性标本，样本中的盐酸小檗碱与胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物结合形成复合物，此复合物由于层析作用沿试纸条向前移动，则与检测线区的盐酸小檗碱抗体a形成“固相盐酸小檗碱抗体a-盐酸小檗碱ag-胶体金金标记盐酸小檗碱抗体b”双抗体夹心复合物而凝聚显色；若为阴性标本，在检测线区域不能形成双抗体夹心复合物，因此不显色。无论样本中盐酸小檗碱是否存在，一条有色条带都会出现在对照线区内。对照线区内所显现的有色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。若无对照线出现，则实验无效。本发明的检测卡是由固相载体和金标记物均与被检测物的两个以上抗原表位结合，形成抗体抗原金标抗体复合物，特异性强，适用于含有多种生物碱的黄连样本检测。
28.(2)本发明的检测卡的制备方法，对样品结合垫和层析膜进行了优化处理，将胶体金标记物与待检物特异性抗体(小檗碱单克隆抗体b)进行偶联，喷涂于样品结合垫上，t线
(检测线)喷涂与检测抗原另一抗原表位结合的捕获抗体 (盐酸小檗碱单克隆抗体a)。c线(对照线)包被有羊抗兔二抗抗体，得到灵敏度高的盐酸小檗碱含量的检测卡。
29.(3)本发明的黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法，限定了样本前处理方法，选用了特定的提取液(甲醇-异丙醇-乙酸乙酯)，该提取液渗透性强，能有效的参透进盐酸小檗碱中，从中提取出有效盐酸小檗碱浓度，达到更为准确的结果。同时还具有去除杂质的效果，为后面的检测打好基础，使得数据更精准，在采购时可检出含量，检出限为3～10％。
具体实施方式
30.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
31.实施例1
32.一种盐酸小檗碱含量的检测卡，包括壳体和设置在壳体内部的底板，所述壳体包括互相扣合的上壳和下壳，所述底板表面依次设置有吸水材料、层析膜和样品结合垫；其中，层析膜表面依次设有检测线和对照线；上壳设有观察窗和加样孔；样品结合垫设置在加样孔的下方，检测线和对照线设置在观察窗的下方；其中，样品结合垫包埋有胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物，层析膜的检测线包被有盐酸小檗碱单克隆抗体a，对照线包被有羊抗兔二抗抗体。其中，所述吸水材料为吸水纸。所述胶体金的颗粒为10～20nm。
33.上述的盐酸小檗碱含量的检测卡的制备方法，包括以下步骤：
34.1)胶体金与小檗碱单克隆抗体b偶联物偶联，得到胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物；
35.2)将胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物用缓冲液稀释后，得到稀释液，将样品结合垫浸泡于稀释液中，取出后经真空冷冻干燥后待用；其中，缓冲液为0.02m磷酸盐缓冲液(pb)和0.5％bsa(牛血清白蛋白)的混合溶液，稀释范围为20倍。
36.3)将盐酸小檗碱单克隆抗体a包被在层析膜的检测线内，将羊抗兔二抗抗体包被在对照线内，得到层析膜；
37.4)将吸水材料和步骤2)所得的样品结合垫分别搭接在步骤3)所得的层析膜的左右两端，得到搭接后的底板，再将底板与壳体进行组装，得到盐酸小檗碱含量的检测卡。
38.具体地，所述胶体金标记的小檗碱单克隆抗体b偶联物的制备方法为：取胶体金溶液50μl，加0.2m入碳酸钾调节ph到7.0～8.2，然后加入10μl小檗碱单克隆抗体b，反应后再加入2μl牛血清白蛋白进行封闭，在12000r/min的转速下离心10min，弃上清液，再加入1ml复溶液(磷酸盐缓冲液 1％蔗糖 0.5％牛血清白蛋白 0.5％吐温20)，冷藏备用。
39.一种黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法，包括以下步骤：
40.1)黄连样品前处理：将所述黄连样品切碎，加入提取液进行浸提20～30min，提取液包括质量比为0.5：1.5：1的甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液。
41.2)采用上述的检测卡进行检测；
42.3)通过显色反应直接目测实验结果。
43.实施例2
44.实施例2的检测卡和制备方法均与实施例1相同，不同之处在于：实施例2 在黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法所用的提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1：0.5：
2。
45.实施例3
46.实施例3的检测卡和制备方法均与实施例1相同，不同之处在于：实施例2 在黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法所用的提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1.5：1.5：0.5。
47.实施例4
48.实施例4的检测卡和制备方法以及检测方法均与实施例1相同，不同之处在于：实施例4的所述胶体金的颗粒为20～40nm。
49.实施例5
50.实施例5的检测卡和制备方法均与实施例1相同，不同之处在于：实施例5 在黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法所用的提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1：1：1。
51.实施例6
52.实施例6的检测卡和制备方法均与实施例1相同，不同之处在于：实施例6 在黄连中盐酸小檗碱含量的检测方法所用的提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1.5：1.5：2。
53.性能测试
54.对实施例1～6的检测卡进行黄连中盐酸小檗碱含量的检测下限分析，具体如表1。
55.表1 各组的检测卡最低检测限数据
[0056][0057][0058]
由表1可知，实施例4的胶体金颗粒在20～40nm内，与实施例1相比，检出限更低，这是因为20-40nm的胶体金金颗粒比较大，显色会比较偏深，颗粒偏大在标记时更稳定，所以优选20～40nm的胶体金颗粒。实施例6的检测方法中所用的提取液与实施例1不同，检出限更低，说明提取液中甲醇、异丙醇和乙酸乙酯的质量比为1.5：1.5：2是优选的提取液比例。
[0059]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。