肝纤维化的诊断试剂盒的制作方法

nhs、nsp-dmae-nhs、nsp-sa、nsp-sa-nhs和nsp-sa-adh中的至少一种。
14.在其中一个实施例中，所述诊断试剂盒还包括抗原稀释剂，所述抗原稀释剂包括：10mm～50mm磷酸盐、500mm～1m氯化钠、0.1w/v％～2w/v％edta-2na、1w/v％～10w/v％海藻糖、1w/v％～10w/v％甘露醇、1w/v％～10w/v％赖氨酸和0.1v/v％～2v/v％表面活性剂。
15.在其中一个实施例中，所述表面活性剂选自tween20、tween80、triton x-100、triton x-405和tetronic 1307中的至少一种。
16.在其中一个实施例中，所述抗原稀释剂还包括防腐剂；在所述抗原稀释剂中，所述防腐剂的浓度为0.1w/v％～0.5w/v％。
17.在其中一个实施例中，所述抗原稀释剂包括：15mm～40mm磷酸盐、500mm～800m氯化钠、1w/v％～2w/v％edta-2na、5w/v％～10w/v％海藻糖、1w/v％～5w/v％甘露醇、1w/v％～5w/v％赖氨酸、0.5v/v％～1.5v/v％表面活性剂和0.1w/v％～0.5w/v％防腐剂。
附图说明
18.图1为实施例1的试剂盒的roc曲线；
19.图2为a试剂盒的roc曲线。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施例的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施例中，来产生更进一步的实施例。
21.术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
23.甘露聚糖结合凝集素关联丝氨基酸蛋白酶2(mannose associated serine protease 2，masp2)属于masps家族成员之一。人masp2基因定位于1p36.23-31，全长大约20kb，编码686个残基的肽链，是在肝脏中特异性表达的基因。该基因有2种可变剪接体masp2和map19，均由肝脏合成分泌到血液，并以酶原形式存在。与人的免疫缺损病有关，在机体的固有性免疫防御中有重要作用，是补体凝集素途径的中心蛋白酶分子，在补体激活的凝集素途径中，甘露糖结合凝集素(mbl)通过其胶原样区(clr)与masp2结合形成复合物，再借助于其c端糖识别域识别结合病原微生物表面的甘露糖、岩藻糖等结构，随后构象发生变化，masp2随之被活化，裂解c4和c2，分裂为c4b和c4a，c2b和c2a，随后c4b和c2b参与形成c3转化酶，进而激活补体下游成分。本研究发现masp2作为肝纤维化的标志物并结合化学发光法检测可以提高肝纤维化的诊断的灵敏度和特异性，提高诊断的准确性。
24.基于上述，本技术一实施方式提供了一种masp2作为肝纤维化的标志物在制备肝纤维化的诊断产品中的应用。
25.基于上述，本技术一实施方式还提供了一种用于检测标志物masp2的试剂在制备肝纤维化的诊断产品中的应用。
26.在一些实施例中，诊断产品为诊断试剂盒。进一步地，诊断产品为化学发光诊断试剂盒。
27.此外，本技术一实施方式还提供了一种肝纤维化的诊断试剂盒，该诊断试剂盒包括固相偶联物和标记抗体。
28.具体地，固相偶联物包括固相载体及包被于固相载体上的抗masp2抗体。
29.可选地，固相载体为试管、ep管、多孔板、微量反应板凹孔、微球或圆片。
30.在一些实施例中，多孔板为酶标板。在一个可选地具体示例中，多孔板的孔位为16、32、48、64、96或更多。
31.在本发明中，术语“微球”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。在一些实施例中，微球的直径为10nm～1mm。在一个可选地具体示例中，微球的直径为100nm、500nm、1μm、10μm、100μm或500μm。进一步地，微球的直径为400nm～10μm。
32.在一些实施例中，微球为磁珠，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(例如fe2o3或fe3o4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。
33.在一些实施例中，微球的表面修饰有一种或多种活性功能基团。可选地，活性功能基团包括-oh、-cooh、-nh2、-cho及-so3h中的一种或多种。在一些实施例中，包被的抗体通过物理吸附或直接化学缀合(例如通过桥接物进行桥接)与微球缀合或结合。
34.在另一些实施例中，固相载体的材质为聚苯乙烯、塑料、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶和琼脂糖凝胶中的一种或多种。
35.具体地，标记抗体是标记有化学发光标记物的抗masp2抗体。在一些实施例中，标记抗体的抗masp2抗体结合masp2的抗原表位，与固相偶联物的抗masp2抗体结合masp2的抗原表位不同。此时，上述诊断试剂盒利用固相偶联物与待测样本中的masp2结合后与标记抗体形成复合物而检测待测样本中masp2的量，也即是利用免疫夹心法的原理检测待测样本中masp2的量。可以理解的是，在其他实施例中，标记抗体的抗masp2抗体结合masp2的抗原表位，与固相偶联物的抗masp2抗体结合masp2的抗原表位还可以相同，此时利用竞争法的原理检测待测样本中masp2的量。
36.在一些实施例中，固相载体上包被的抗masp2抗体和化学发光标记物标记的抗masp2抗体的来源分别独立地选自所有畜养(如家畜和宠物)和野生的动物及禽鸟中的一种，其非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。在一些实施例中，固相载体上包被的抗masp2抗体与化学发光标记物标记的抗masp2抗体的来源相同。同种属来源的抗体能够有效降低交叉反应，提高准确性。
37.在一些实施例中，固相载体上包被的抗masp2抗体为多克隆抗体。如此设置可以增加检测的灵敏度。
38.需要说明的是，本文中“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。此外，抗体还包括能够结合期望抗原的功能性片段，例如fab、f(ab’)2、fd、fv、scfv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scfv-fc等。抗体的类型可以为igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd。
39.在一些实施例中，化学发光标记物选自吖啶类化学发光物质、三联吡啶钌、金刚烷、鲁米诺、鲁米诺的衍生物、异鲁米诺、异鲁米诺的衍生物、辣根过氧化物酶及碱性磷酸酶中的一种。
40.在其中一个实施例中，吖啶类化学发光物质选自吖啶酯和吖啶磺酰胺中的至少一种。可选地，吖啶类化学发光物质选自ae-nhs、dmae-nhs、me-dmae-nhs、nsp-dmae-nhs、nsp-sa、nsp-sa-nhs和nsp-sa-adh中的至少一种。
41.需要说明的是，本文中“ae-nhs”是“吖啶琥珀酰亚胺”的简称；“dmae-nhs”是“(6'-dimethyl-4'-(n-succinimidyloxycarbonyl)phenyl-10-methyl-acridinium-9-carboxylate methosulfate)”的简称；“me-dmae-nhs”是“2',6'-dimethylcarbonylphenyl 10-methyl-9-acridinecarboxylate 4'-nhs ester triflate”的简称；“nsp-dmae-nhs”是“2',6'-dimethylcarbonylphenyl-10-sulfopropylacridinium-9-carboxylate 4'-nhs ester”的简称；“nsp-sa”是“3-[9-(((3-(carboxypropyl)[4-methxylphenyl]sulfonyl)amine)carboxyl]-10-acridiniumyl)-1-propanesulfonateinner salt”的简称；“nsp-sa-nhs”是“3-[9-(((3-(n-succinimidyloxycarboxypropyl)[4-methxylphenyl]sulfonyl)amine)carboxyl]-10-acridiniumyl)-1-propanesulfonateinn er salt”的简称；“nsp-sa-adh”是“2',6'-dimethylcarbonylphenyl10-methyl-9-acridinecarboxylate 4'-nhs ester triflate”的简称。ae-nhs、dmae-nhs、me-dmae-nhs和nsp-dmae-nhs属于吖啶酯；nsp-sa和nsp-sa-nhs属于吖啶盐；nsp-sa-adh为吖啶酰肼。
[0042]
在一些实施例中，上述诊断试剂盒还包括抗原稀释剂。可以理解的是，抗原稀释剂可以是固体(例如冻干粉或喷雾干燥粉)，也可以是溶液。
[0043]
在一些实施例中，抗原稀释剂包括：10mm～50mm磷酸盐、500mm～1m氯化钠、0.1w/v％～2w/v％edta-2na、1w/v％～10w/v％海藻糖、1w/v％～10w/v％甘露醇、1w/v％～10w/v％赖氨酸和0.1v/v％～2v/v％表面活性剂。通过研究证实，在加有edta的高盐溶液(高盐溶液是指浓度为500mm～1m的盐溶液)中才可以将mbl/masp2的复合物分开，提高试剂的检出灵敏度。
[0044]
在一些实施例中，上述抗原稀释剂的ph＝6.5～7.5。在一个可选地具体示例中，上述抗原稀释剂的ph为6.8、7、7.2或7.5。
[0045]
在一些实施例中，表面活性剂包含tween、triton x-100、triton x-405和tetronic 1307中的至少一种。可选地，tween选自tween-20、tween-80和tween-100中的至少一种。可以理解的是，在其他实施例中，表面活性剂不限于上述。
[0046]
在一些实施例中，抗原稀释剂还包括防腐剂。可选地，防腐剂选自叠氮钠和proclin300中的至少一种。在其他实施例中，防腐剂不限于上述。
[0047]
在一些实施例中，在抗原稀释剂中，防腐剂的浓度为0.1w/v％～0.5w/v％。进一步
地，在抗原稀释剂中，防腐剂的浓度为0.1w/v％0.2w/v％。
[0048]
进一步地，抗原稀释剂包括：15mm～40mm磷酸盐、500mm～800m氯化钠、1w/v％～2w/v％edta-2na、5w/v％～10w/v％海藻糖、1w/v％～5w/v％甘露醇、1w/v％～5w/v％赖氨酸、0.5v/v％～1.5v/v％表面活性剂和0.1w/v％～0.5w/v％防腐剂。
[0049]
上述肝纤维化的诊断试剂盒以masp2作为肝纤维化的标志物并结合化学发光法检测提高了肝纤维化的诊断灵敏度和特异性，提高了诊断的准确性；并且与相应的化学发光测定仪配套，能够实现对masp2的自动化(自动取样、自动检测、自动报告)、高通量(300人份/小时)、快速检测(30min出报告)。
[0050]
此外，本技术一实施方式还提供了一种上述肝纤维化的诊断试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：将待检测样品与固相偶联物和标记抗体一起孵育，masp2侨联固相偶联物上的抗体与标记抗体；洗去未结合的非特异抗原及标记抗体；及检测标记抗体的信号强度。
[0051]
在一些实施例中，将抗原稀释剂、待检测样本、固相偶联物和标记抗体一起孵育。
[0052]
在本技术中使用术语“检测”和类似术语来概括地指过程或发现或确定某事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平，或发生的概率。例如，术语“检测”当关于靶核酸序列使用时，可以表示发现或确定所述序列的存在、不存在、水平或数量，以及存在或不存的概率或似然性。要理解的是，表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量检测。例如，定量检测包括确定样品中masp2的数量或量。
[0053]
在一些实施例中，待测样本为含有或推测含有masp2的血液。在一个可选地具体示例中，待测样本为含有或推测含有masp2的血浆或血清。
[0054]
具体实施例
[0055]
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
[0056]
实施例1
[0057]
本实施例的试剂盒主要分为校准品和检测试剂，其中，检测试剂由3部分组成：
[0058]
r1试剂：由顺磁性磁珠以及磁珠稀释液组成，磁珠包被有抗人masp2多克隆抗体(亚辉龙)；磁珠浓度为0.15mg/ml；磁珠稀释液为含有50mm tris、2w/v％bsa、5％w/v甘氨酸、0.5v/v％表面活性剂(triton x-405)、1w/v％蛋白稳定剂(aep-hbc)和0.1w/v％防腐剂(pc300)的稀释液，磁珠稀释液的ph为7.4。
[0059]
r2试剂：由标记了吖啶酯的鼠抗人masp2单克隆抗体(亚辉龙)以及吖啶稀释液组成。吖啶组分中鼠抗人masp2单克隆抗体的浓度均为200ng/ml；吖啶稀释液为含有50mm pbs、2w/v％bsa、0.5v/v％表面活性剂(tetronic1307)、0.05w/v％小鼠igg、0.1w/v％防腐剂(pc300)等成分的稀释液，ph为7.4。
[0060]
r3试剂：由20mm磷酸盐、500mm氯化钠、1.5w/v％edta-2na、10w/v％海藻糖、2w/v％甘露醇、1w/v％赖氨酸、1v/v％tween-20、0.1w/v％nan3、0.1％pc300组成，ph7.0。
[0061]
实施例2
[0062]
本实施例为试剂盒的使用方法，该使用方法包括但不限于下述步骤：
[0063]
实施例1的试剂盒可与亚辉龙生产的iflash-3000系列化学发光测定仪配套使用，其中清洗液、预激发液、激发液以及相应的清洗和发光读数步骤为测定仪的默认设定，其余步骤由人工设定程序，由测定仪处理完成。
[0064]
第一步 样本处理：设定程序，吸取10μl样本于反应杯中，并加入试剂90μlr3试剂，于37℃孵育5min，使mbl/masp2的复合物分开。
[0065]
第二步 添加磁珠/吖啶：向反应杯中添加50ul r1试剂，以及50ul r2试剂，于37℃孵育10min，样本中的masp2抗原与包被于磁珠上的抗masp2抗体以及吖啶上的抗masp2抗体结合，形成抗体-抗原-抗体的免疫复合物，随后执行清洗程序，洗去未结合和吸附的样品；
[0066]
第三步 测定待测物浓度：根据仪器预先设定好的发光程序，激发通过一系列反应结合在磁珠上的化学发光标记物，并由化学发光测定仪读取发光值；
[0067]
第四步 产生报告：根据校准曲线和参考区间，报告血样中masp2的含量，以辅助临床判断。
[0068]
实施例3
[0069]
测试临床样本中masp2的含量
[0070]
采集70例健康人群的血清样本，以及70例临床诊断为肝纤维化的血清样本，参照实施例2中的步骤，设定测量程序，检测各个血清样本中的masp2含量。参照购买的masp2试剂盒(elisa)(下文简称a试剂盒)操作指导，同样检测70例健康和70例临床诊断为肝纤维化的血清样本中的masp2含量，结果如表1所示。
[0071]
采用统计软件spss 22.0对实施例1的试剂盒测得的患者样本和健康人群样本的masp2含量用roc曲线进行特异性和灵敏度分析，绘制roc曲线，计算曲线下面积(area under the curve，auc)，结果如图1所示。采用统计软件spss 22.0对a试剂盒测得的患者样本和健康人群样本的masp2含量用roc曲线进行特异性和灵敏度分析，绘制roc曲线，计算曲线下面积(area under the curve，auc)，结果如图2所示。
[0072]
表1
[0073]
[0074]
[0075]
[0076][0077]
从表1可以看出，masp2在健康人群中的含量明显高于肝损伤样本，当实施例1的试剂盒的cutoff值定在423.84ng/ml时，其曲线面积达0.953(渐进95％置信区间的下限为0.913，上限为0.993；标准误a为0.02，渐进显著性b为0，其中，a在非参数假设下，b零假设：实面积＝0.5)，检测特异性可达95.7％，灵敏度92.9％；当a试剂盒的cutoff值定在345.58ng/ml时，其曲线面积达0.865(渐进95％置信区间的下限为0.803，上限为0.927；标准误a为0.032，渐进显著性b为0，其中，a在非参数假设下，b零假设：实面积＝0.5)，检测特异性可达85.7％，灵敏度78.6％。对比可发现，实施例1的试剂盒的检测灵敏度与特异性a试剂盒。
[0078]
实施例4
[0079]
测试线性
[0080]
(1)测试实施例1的试剂盒的线性：选取一例高值样本，用零值buffer按表2进行稀释，参照实施例2中的步骤，设定测量程序，检测稀释样本中的masp2含量，计算测试浓度与理论浓度的偏差，结果如表2所示。
[0081]
表2
[0082][0083]
从表2可以看出，在0ng/ml～1200ng/ml的范围内，实施例1的试剂盒稀释线性的偏差可控在
±
10％内。masp2在人血清的含量为70ng/ml～1200ng/ml，满足临床测试需求。
[0084]
(2)测试a试剂盒的线性：选取一例高值样本，用零值buffer按表3进行稀释，采用a试剂盒检测样本中masp2蛋白的浓度，计算测试浓度与理论浓度的偏差，结果如表3所示。
[0085]
表3
[0086][0087]
从表3可以看出，a试剂盒的检测线性范围在0ng/ml～900ng/ml的范围内，远低于实施例1的试剂盒的测量线性范围。
[0088]
实施例5
[0089]
测试检出限
[0090]
测试方法如下：用样本稀释液作为零值样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m 3sd，即为检出限，结果如表4所示。
[0091]
表4
[0092]
试剂盒检出限实施例1的试剂盒0.83ng/mla试剂盒1.88ng/ml
[0093]
由表4可知，实施例1的试剂盒的检出限远远低于a试剂盒的检出限。
[0094]
综上，实施例1的试剂盒对于masp2的检出限低，灵敏度高，检测的线性范围宽，对肝纤维化的诊断的准确性高。
[0095]
实施例6
[0096]
比较不同肝纤维化标志物的临床符合率。
[0097]
采集70例健康人群的血清样本，以及70例临床诊断为肝纤维化的血清样本，参照实施例2中的步骤，设定测量程序，检测各个血清样本中的masp2含量。按照b公司的ⅲ型前胶原n端肽测定试剂盒(化学发光法)、ⅳ型胶原测定试剂盒(化学发光法)、层粘连蛋白测定试剂盒(化学发光法)、血清透明质酸测定试剂盒(化学发光法)操作指导，同样检测上述的
70例健康和70例临床诊断为肝纤维化的血清样本中的ⅲ型前胶原n端肽、ⅳ型胶原、层粘连蛋白、血清透明质酸的含量，统计分析5种肝纤维化标志物的临床符合率，结果如表5所示。需要说明的是，masp2的正常值(健康人中的检测值，下同)＞423.84ng/ml，若masp2的检测值小于或等于423.84ng/ml，则判定为肝纤维化；ⅲ型前胶原n端肽的正常值＜30ng/ml，若ⅲ型前胶原n端肽的检测值大于或等于30ng/ml，则判定为肝纤维化；ⅳ型胶原的正常值＜30ng/ml，若ⅳ型胶原的检测值大于或等于30ng/ml，则判定为肝纤维化；层粘连蛋白的正常值＜50ng/ml，若层粘连蛋白的检测值大于或等于50ng/ml，则判定为肝纤维化；血清透明质酸的正常值＜100ng/ml，若血清透明质酸的检测值大于或等于100ng/ml，则判定为肝纤维化。在表5中，“符合”是指判定结果与实际临床诊断结果相符；“不符”是指判定结果与实际临床诊断结果不相符。
[0098]
表5：不同标志物的临床符合率
[0099]
[0100]
[0101]
[0102][0103]
由表5可知，masp2作为肝纤维化的标志物，其临床符合率高于传统的ⅲ型前胶原n端肽、ⅳ型胶原、层粘连蛋白、血清透明质酸标志物。
[0104]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要
求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。