一种苯二氮卓BZO快速检测试剂盒的制作方法

一种苯二氮卓bzo快速检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及体外诊断技术领域，具体为一种苯二氮卓(bzo)药物相关的胶体金免疫层析快速检测试剂盒，用于戒毒所、医院、特种工业、高危人群普查和招工体检工作筛查及食品检疫等。


背景技术：

2.苯二氮卓类药物具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、肌肉松弛等作用，应用于多种生理疾病的治疗，特别是焦虑症和失眠症的治疗。然而过去的几年里，苯二氮卓类物质已成为新精神活性物质市场上一类快速增长的滥用药物，该类药物的非医疗用途已成为广泛关注的社会问题之一。长期服用该药物会导致严重的记忆丧失和认知障碍，产生身体和精神依赖性，停药后出现强烈的戒断症状，包括头痛、肌肉痛、极度焦虑紧张、烦躁、兴奋和谵妄，严重时会出现失眠、意识障碍、失去理智、听觉过敏、麻木、四肢麻刺感，出现幻觉和癫痫发作，甚至导致死亡。
3.鉴于苯二氮卓类药物的危害性，国家已将其列为精神药品进行管理。目前，该类药物的检测方法有很多，方法多集中于色谱法、免疫分析法、光谱法和电化学法，每种方法的侧重点不同，但大部分所使用的仪器和设备非常昂贵，不易于基层工作的展开。
4.利用胶体金免疫层析技术这种检测方法可直接对血液、尿液、体腔液中的苯二氮卓类药物进行检测，该方法具有高灵敏度，易于试纸化、小型化、成本低廉，操作简单且反应快速等优点。在现场检测中，尤其是酒驾和毒驾现场，常用于第一步筛查。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术，根据使用者的需求，提供一种快速、方便、灵敏的不依赖专门设备的苯二氮卓(bzo)快速检测试剂盒。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种用于苯二氮卓(bzo)药物的快速检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、免疫胶体金片材、nc膜和吸水滤纸；所述免疫胶体金片材为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片；所述nc膜为设有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白复合物，所述质控线上包被有山羊抗鸡igy。
8.进一步地，所述试剂盒还包括底板和顶盖，所述底板设有卡槽，能稳固安置试剂条；所述顶盖开设有进样口、观察口；加样口位于样品垫的上方，观察口位于检测线和质控线的上方。
9.在本发明的一个优选实施例中，所述检测线(t线)和质控线(c线)宽度为0.8-0.5cm。
10.在本发明的一个优选实施例中，所述加样口为上大下小的漏斗形状，因液体表面张力可有效防止样品溢出。
11.在本发明的一个优选实施例中，所述观察窗有一定高度，即能有效隔离外力损伤试剂条，又能避免掉地时灰尘污染。
12.在本发明的一个优选实施例中，在所述底座上设置有1-5个试剂条安放槽，可根据使用频次选择不同型号底座。
13.在本发明的一个优选实施例中，所述苯二氮卓抗体为鸡igy，由于禽类和哺乳动物在动物种系发生学距离较远，可有效降低人体其他代谢物的干扰。浓度为od30-60。
14.在本发明的一个优选实施例中，所述样品垫的一端与所述免疫胶体金片材的一端相叠，所述免疫胶体金片材的另一端与nc膜的一端相叠，所述nc膜的另一端与吸水滤纸相叠，即使竖直放置的情况下试剂盒也能显色。
15.在本发明的一个优选实施例中，所述样品垫需用处理液浸泡10-45min后，取出后甩干5-15min，放入烘箱烘干12-24h。其中，浸泡时间优选为30min。
16.在本发明的一个优选实施例中，所述样品垫的处理液包含0.02％-2％表面活性剂，0.01％-1％聚乙烯比咯烷酮，0.001％-0.1％酪蛋白钠盐，0.001％-0.1％edta.na4，0.05％-0.5％胆酸钠；最佳ph为8.0
±
0.1。通过合理配方处理液浸泡后的样品垫，在免疫胶体金释放完全的基础上，能减慢免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，可有效提高试剂盒反应灵敏度。
17.检测试剂盒操作方法：
18.将样品水平放置于台面上，用吸管吸取尿样后在方形加样孔内滴加3～5滴样品，反应5分钟后判读结果。注意：检测不同的样品需要更换不同的吸管。
19.检测试剂盒结果判读方法：
20.阴性：在观察口内出现两条色带，即检测线(t线)和质控线(c线)位置各出现一条红色线条，表示样品中无苯二氮卓存在。
21.阳性：只在观察口内的质控线(c线)位置出现一条红色线条，检测线(t线)未出现任何线条，表示样品中有苯二氮卓存在。
22.无效：质控线(c线)位置出现一条红色线条，表示加样和操作正确。如果质控线线位置未出现红色线条，表明测试结果是不确定的，应重做。
23.检测试剂盒的工作原理：
24.如果尿样中含有苯二氮卓类药物，尿样中的苯二氮卓药物将与包被在nc膜上的抗苯二氮卓单克隆抗体胶体金层中的苯二氮卓单克隆抗体反应，竞争标记在抗苯二氮卓单克隆抗体胶体金层上的抗原结合位点，当尿液中的苯二氮卓浓度高于300ng/ml时，尿样中的苯二氮卓药物会首先与苯二氮卓单克隆抗体反应并占据全部的抗原结合位点，这样就阻止了抗苯二氮卓单克隆抗体胶体金层中的苯二氮卓单克隆抗体与检测线上的苯二氮卓载体复合物层中的苯二氮卓载体结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而没有红色色带呈现为阳性结果。如果尿样中没有苯二氮卓或其浓度低于闽值浓度，则抗苯二氮卓单克隆抗体胶体金层中的苯二氮卓单克隆抗体将与检测线上的苯二氮卓载体复合物层中的苯二氮卓载体结合，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性结果。
25.本发明的有益效果：
26.本发明中毒品抗体使用鸡igy，禽类igy可与哺乳动物抗原上的更多表位发生反应，起到信号放大作用；免疫胶体金纸片制备步骤中通过采用合理配方的预处理液对样品
垫和金标垫进行预处理，并选配合适的喷金缓冲液，可减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，提高反应灵敏度，同样的阈值下还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
27.本发明制备的用于检测苯二氮卓类药物的胶体金检测试剂盒，具有批间差异小、灵敏度高、特异性强，操作简便省时检测结果肉眼判断，无需特殊仪器和专业技术人员，检测费用低廉、存储和运输方便等优点，十分适合现场、多人使用。
附图说明
28.图1-1和1-2分别为本发明的单人份(左)和五人份(右)苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒的俯视图。图中：1、4：顶盖；2、5：观察窗；3、6：进样口。
29.图2-1和2-2分别为本发明的单人份(左)和五人份(右)苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒的仰视图。图中：7、8：底板
30.图3-1和3-2分别为本发明的单人份(左)和五人份(右)苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒底板的俯视图。图中：9、12：卡槽上部；10、13：底板；11、14：卡槽下部。
31.图4-1和4-2分别为本发明的单人份(左)和五人份(右)苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒去顶盖的俯视图。图中：15、20：底板；16、21：吸水滤纸；17、22：nc膜；18、23：免疫胶体金片材；19、24：样品垫。
32.图5-1和5-2分别为本发明苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒的试剂条俯视图和右视图。图中：25、31：吸水滤纸；26、32：nc膜；27、33：质控线(c线)；28、34：检测线(t线)；29、35：免疫胶体金片材；30、36：样品垫。
33.图6-1和6-2分别为本发明的单人份(左)和五人份(右)苯二氮卓(bzo)类药物快速检测试剂盒的立体图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.实施例
36.如图所示,本发明用于苯二氮卓(bzo)药物的快速检测试剂盒的一个实施例，包括底板、顶盖和试剂条。图1-1和1-2分别为单人份(左)和五人份(右)的顶盖，上面开设有进样口(图1-1和1-2中3、6)、观察口(图1-1和1-2中2、5)；加样口位于样品垫的上方，观察口位于检测线和质控线的上方。如图3-1和3-2所示，底板设有卡槽，能稳固安置试剂条。将试剂条滤纸端置于卡槽上方(图3-1和3-2中9、12)，样品垫端置于卡槽下方(图3-1和3-2中11、14)，单人份(左)和五人份(右)的放置示意图如图4-1和4-2所示。试剂条从加样端开始依次为样品垫(图5-1和5-2中30、36)、免疫胶体金片材(图5-1和5-2中29、35)、nc膜(图5-1和5-2中26、32)和吸水滤纸(图5-1和5-2中25、31)；所述免疫胶体金片材为包被有胶体金标记的抗苯二氮卓单克隆抗体的玻璃纤维垫片；所述nc膜为设有检测线(图5-1和5-2中28、34)和质控线(图5-1和5-2中27、33)的硝酸纤维素膜，所述检测线上包被有苯二氮卓-牛血清白蛋白
复合物，所述质控线上包被有山羊抗鸡igy。
37.具体地，本发明实施例中的生产流程：
38.(1)样品垫的处理
39.将edta样品垫处理液倒入干净的专用容器中，将玻璃纤维放入到处理液中浸泡30min，泡后取出甩干，取出放入45℃烘箱，烘干12-24h。
40.(2)胶体金溶液配制
41.将10％氯金酸溶液迅速倒入沸腾的超纯水中，高速搅拌；加入10％柠檬酸三钠溶液，搅拌5min后停止加热，并继续搅拌10min；将以上溶液转移至为加热的搅拌器上，持续低速搅拌20min；将以上溶液带容器放入冷却水中降至室温以下。
42.(3)苯二氮卓(bzo)金标溶液标记
43.取所需金水置于搅拌机上搅拌，搅拌过程中加入0.2m碳酸钾溶液调节ph，继续搅拌5min；将苯二氮卓单抗快速加入金水溶液中，在室温下搅拌30min；将10％bsa标记封闭液加入上述溶液中，封闭30min；将标记后的金水溶液在2-8℃、10000rpm离心45min，去除上清，加入适量tcp金标稀释液将金标复溶，使最终标记液体积约为金水量的1％。
44.(4)苯二氮卓(bzo)金标制作
45.启动喷金机，按一定参数在已处理过的tb聚酯膜上点上金标，结束后将金标条放入45℃烘箱，烘干12-24h。
46.(5)苯二氮卓(bzo)片材制作
47.撕去底板上nc膜粘贴处的不干胶，将nc膜粘贴在相应位置；启动划膜仪，设置参数，使c/t线间距为0.8cm；将划好的片材放入45℃烘箱中稳定12-24h。
48.(6)组装
49.将干燥后的片材切成宽4mm的小条，将切好的试剂条放入模具底板，扣上顶盖。
50.(7)包装
51.将组装好的试剂条放入装有干燥剂的袋子里密封保存。
52.本发明提供的一种苯二氮卓(bzo)快速检测试剂盒及其制备工艺，将高度特异性的抗体抗原反应与免疫胶体金层析技术相结合，在此现有技术的基础上进行改进，在胶体金标记检测抗体的同时标记控制线抗体，相应地在质控区点膜第二抗体与经过胶体金标记的控制线抗体进行显色反应，在保证质控线显色一致的情况下，通过检测线的显色程度来实现。
53.对比公开号为cn102565409a的苯二氮卓检测试剂盒，本发明提供的一种苯二氮卓(bzo)快速检测试剂盒反应更加灵敏迅速，成本更加低廉。
54.以上实施例仅为本技术的示例性实施例，不用于限制本技术，本技术的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本技术的实质和保护范围内，对本技术做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本技术的保护范围内。