一种中药中疏水性成分的绿色提取方法

1.本发明属于中药技术领域，涉及一种中药中疏水性成分的绿色提取方法，具体是一种新的机械辅助共无定形分散萃取(made)方法提取广陈皮(crc)中的疏水化合物。


背景技术：

2.天然产物，其有效成分主要有糖类、苯丙素、生物碱、类黄酮、类固醇等，广泛应用于临床医学、制药、保健、食品、化妆品等领域。近年来，由于天然产物中有效成分具有独特的结构特点和优异的生物活性，其提取方法越来越受到人们的关注。由于细胞结构和组成的不同，天然产物的提取方法需要根据目标化合物的性质来选择。目前，传统的提取方法，包括超声提取、浸渍、回流和索氏提取，存在提取效率低、有效成分损失大、溶剂残留大、溶剂消耗大、操作复杂、环境污染严重等问题，已无法满足生产活动的要求。特别是对具有通便、抗炎、抗氧化等多种健康益处的醌类、黄酮类等疏水化合物，有机溶剂萃取法因选择性高、操作简单而成为主流提取方法；但萃取过程中溶剂消耗大，挥发性强，可能对环境造成危害。因此，建立一种环境友好、高效的从天然产物中提取疏水化合物的方法，避免有机溶剂的使用和复杂的操作步骤，是迫切和必要的。
3.陈皮(crp)，生长于中国和世界各国，被公认为最具价值的中草药和食用植物茶。广陈皮(citrus reticulata’chachi,crc)是柑橘或其栽培品种，通常被认为是陈皮中最有价值的品种。crc的主要活性成分为黄酮类化合物、精油、生物碱和多糖。由于黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保护心血管系统的能力，一系列黄酮类化合物的提取方法已被广泛研究和报道。目前常用的黄酮提取方法有热回流提取、微波辅助提取、超声提取等。据报道，crc中一般有两种黄酮类化合物:黄酮苷类，如橘皮苷；多甲氧基黄酮类，如川陈皮素。甲氧基作为疏水性基团，使得两种类黄酮的水溶性都很差，导致所有类黄酮几乎均通过有机溶剂提取。鉴于此，由于绿色提取技术的提取效率高，符合可持续发展的理念，因此本发明将重点转向绿色提取技术的建立。
4.随着高通量筛选技术的快速发展，共无定形固体分散技术作为提高不溶性药物活性成分的溶出速率和口服生物利用度的有效手段，在制药行业得到了广泛的应用。无定形固体是由难溶于水的化合物和载体组成的混合物，由结晶状态转变为二元单相无定形状态，其特征是存在三维长程有序。在制备工艺中(如热熔挤压、喷雾冷冻干燥、球磨等)，球磨法因其绿色环保、简单、快速等特点而更受欢迎。球磨法是通过高速冲击和摩擦的方式破坏样品和载体的晶体结构，然后将两者充分混合，直到共研磨产物转变为完全的非晶态。与晶体相比，非晶态固体缺乏分子堆积的长程有序结构，具有较高的内能，这是共无定形产物水溶性更大的主要原因。但是这种方法目前在中药有效成分的提取方面应用较少。此外，根据前人的研究，共聚维酮是n-乙烯基吡咯烷酮(nvp)和醋酸乙烯酯(va)的线性共聚物，是一种很好的载体材料，既保留了聚乙烯吡咯烷酮(pvp)在水中保持了较大的溶解和粘附性能，也保留了va保持了较低的吸湿性能。因此，当以共聚维酮为载体时，另一个增溶原理是疏水醋酸乙烯酯基团可能与不溶性药物发生疏水相互作用，通过抑制晶核的生长速度，从而阻碍
溶解药物的重结晶，保持药物的过饱和状态。众所周知，天然产物中含有大量有价值的疏水活性成分，但目前大多采用有机溶剂提取，对环境不友好。基于此，本发明拟将共聚维酮与含有疏水活性化合物的中药共同研磨，使两者发生物理化学反应，如形成氢键等，以此实现难溶成分的提取，同时，共聚维酮也保留了作为载体的特性，即通过抑制晶核的生长速度来阻止溶解药物的重结晶，从而进一步提高取效率。考虑到共无定形固体分散技术在提取疏水成分和提高疏水活性成分的溶解度方面发挥的重要作用，而当前鲜有研究聚焦，因此将该方法应用于天然产物中疏水化合物的萃取是至关重要的。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种中药中疏水性成分的绿色提取方法，是一种机械辅助共无定形分散提取(made)。本发明提出将中药与共聚维酮共研磨后，粒径减小，均匀分散在共聚维酮表面，在加入溶剂水后，附着在共聚维酮表面的疏水化合物随着共聚维酮迅速分散在水中，增大了与水接触的表面积；疏水化合物与共聚维酮之间氢键的形成，有利于溶液超饱和状态的维持；药物与共聚维酮产生的疏水相互作用，抑制了药物晶核的形成，从而提高难溶物的溶出度。即本发明提供了一种能绿色、快速、有效提取与分离广陈皮中的疏水性成分的新方法。
6.本发明方法采用以下具体技术方案：
7.一种中药中疏水性成分的绿色提取方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)、广陈皮预处理，经粉碎机碾碎成粉状；
9.步骤(2)、将粉末状广陈皮和共聚维酮粉末通过行星式球磨机进行共研磨处理；所述广陈皮与共聚维酮的质量比为0.25-1.25g：50-300mg；优选为1g:250mg；所述共研磨时间为1-15min，优选为10min；
10.步骤(3)、在反应容器中加入步骤(2)共研磨产物，并加入适量的溶剂去离子水溶解；所述溶剂去离子水与粉末状广陈皮的用量比为10ml：0.25-1.25g，优选为10ml:1g；
11.步骤(4)、将上述样品溶液进行磁力搅拌提取，然后对样品混合液进行富集，得到疏水性成分橙皮苷、川陈皮素和橘皮素；作为优选，磁力搅拌时间为1-10min；更为优选为5min。
12.本发明的优点在于：
13.1、本发明将共聚维酮与含有疏水活性化合物的中药共同研磨，使两者发生物理化学反应，如形成氢键等，以此实现难溶成分的提取，同时，共聚维酮也保留了作为载体的特性，即通过抑制晶核的生长速度来阻止溶解药物的重结晶，从而进一步提高取效率。与传统的有机溶剂提取疏水化合物相比，本发明具有绿色无污染、萃取效率高、萃取速度快等优点。
14.2、本方法应用范围广泛，可用于多种药材中疏水化合物的检测，在天然药材中提取疏水化合物的微量分析中具有广泛的应用潜力。即本发明将made作为一种环保、灵敏、快速测定中药中疏水化合物的方法。
15.3、本发明方法检测限和定量限分别为3.0-28.3和9.9-94.0ng/ml，线性关系良好，相关系数为0.9990-0.9998。本发明方法是一种有潜力的、环保的、有效的提高天然药材中疏水化合物提取效率的方法。
附图说明
16.图1为made提取分离目标化合物流程图。
17.图2为考察不同共聚维酮用量提取效果折线图。
18.图3为考察不同研磨时间提取效果的折线图。
19.图4为考察不同提取时间提取效果折线图。
20.图5为考察不同剂料比提取效果柱状图。
21.图6为共聚维酮用量(x1,200-300mg)、研磨时间(x2,5-15min)、提取时间(x3,2.5-7.5min)对目标化合物提取效率影响的三维响应图；其中a为共聚维酮用量与研磨时间对目标化合物提取效率影响，b为共聚维酮用量与提取时间对目标化合物提取效率影响，c为研磨时间与提取时间对目标化合物提取效率影响，d为a的投影图，e为b的投影图，f为c的投影图。
22.图7为在其他条件相同的情况下目标化合物的混标溶液、经建立的方法提取的样品色谱图；a为330nm波长下混标溶液色谱图；b为283nm波长下混标溶液色谱图；c为330nm波长下经建立方法富集的样品色谱图；d为283nm波长下经建立方法富集的样品色谱图。
具体实施方式
23.如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，其主要是依据至少包括：1)广陈皮与共聚维酮共研磨后，粒径减小，均匀分散在共聚维酮表面，在加入溶剂水后，附着在共聚维酮表面的疏水化合物随着共聚维酮迅速分散在水中，增大了与水接触的表面积；化合物与共聚维酮之间氢键的形成，有利于溶液超饱和状态的维持；药物与共聚维酮产生的疏水相互作用，抑制了药物晶核的形成，从而提高难溶物的溶出度。2)对于橙皮苷来说，在共聚维酮中，疏水环上的羟基(给体)可以与羰基(受体)形成氢键。氢键不仅通过增加成核活化能抑制不溶性化合物的再结晶，使溶液保持过饱和状态，而且进一步增强了目标分析物从广陈皮向水相的传质。3)载体共聚维酮与广陈皮之间的疏水相互作用对再结晶抑制也有显著影响。
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
25.本发明一种中药中疏水性成分的绿色提取方法具体操作过程为：
26.广陈皮经粉碎机粉碎成65目粉末后，精确称量0.25-1.25g粉末和50-300mg共聚维酮由行星式球磨机共研磨一段时间(1-15min)。共研磨粉末溶解于10ml去离子水，接着样品溶液磁力搅拌(2.5-10min)。随后，取出2ml的样品溶液进行离心(16000rpm,5min)，用过滤的微滤膜(50mm
×
0.45μm)，用高效液相色谱仪在283和330nm时检测2μl上清液的波长最后将滤液注入超高效液相色谱进行分析。该过程如图1所示。
27.高效液相条件如下：
28.所述的提取效果，通过agilent 1290-dad测定疏水化合物的含量来表明该提取方法的有效性。该系统包括四元泵、自动进样器、柱箱和vwd检测器。流动相a为水，流动相b为乙腈。梯度洗脱程序为：0～2.0min，10％～20％b；2.0～7.0min；20％～48％b；7.0～
11.0min，48％～90％b；流速0.4ml
·
min-1
；检测波长为283nm和330nm，柱温为25℃，进样量为2μl。eclipse plus c18色谱柱购自agilent technologies(2.1mm
×
100mm,3.5μm)。
29.以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
30.实施例1.考察共聚维酮用量对提取效果的影响
31.1.1取8个洁净球磨室，编号1、2、3、4、5、6、7、8，依次加入1.00g广陈皮粉末；
32.1.2分别加入0，0，50，100，150，200，250，300mg共聚维酮，接着在编号3-8的球磨室内依次加入6个重量相等的瓷球；
33.1.3将球磨室对称摆放，研磨5min；
34.1.4将共研磨产物取出，依次倒入7个洁净的锥形瓶，均加入10ml去离子水；
35.1.57组样品溶液均进行磁力搅拌5min；
36.1.6依次分取1.5ml样品溶液于离心管中，16000rpm下离心5min；
37.1.7吸取中间液体，注入液相。
38.色谱条件为：
39.检测波长：283nm、330nm；柱温：25℃
40.实验结果图2所示。图2为考察不同共聚维酮用量的提取效果折线图。
41.无法将疏水化合物萃取到水相是绿色萃取技术的一大局限性，因此引入共聚维酮作为固体分散载体，以提高目标分析物的溶解度。从图2可以看出，由0增加载体量至250mg可显著提高橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的提取效率。这一现象的机理可以从三个方面来解释，首先，广陈皮与共聚维酮共研磨后，均匀分散在载体表面，没有聚集现象；然后，亲水性载体一接触水就迅速吸附并分散在水中，增加了化合物与水接触表面的表面积。其次，化合物的溶解被认为是可逆的反应，因此溶解度的增加可能是由于抑制了结晶过程。对于橙皮苷来说，在共聚维酮中，疏水环上的羟基(给体)可以与羰基(受体)形成氢键。氢键不仅通过增加成核活化能抑制不溶性化合物的再结晶，使溶液保持过饱和状态，而且进一步增强了目标分析物从广陈皮向水相的传质。最后，载体与广陈皮之间的疏水相互作用对再结晶抑制也有显著影响。以上三点是提高萃取效率的主要原因。然而，从图2中可以看到，当共聚维酮量超过250mg时，化合物的提取效率不再增加。因为共聚维酮是一种水溶性聚合物，在水中会变得粘稠，超过一定的量会对化合物的提取产生不利影响。因此，在接下来的研究中选择了250mg。
42.实施例2.考察研磨时间对提取效果的影响
43.2.1取4个洁净球磨室，编号1、2、3、4，依次加入1.00g广陈皮粉末；
44.2.2在编号1-4的球磨室内依次加入250mg共聚维酮，接着依次加入6个重量相等的瓷球；
45.2.3分别研磨1，5，10，15min；
46.2.4将共研磨产物取出，依次倒入4个洁净的锥形瓶，均加入10ml去离子水；
47.2.54组样品溶液均进行磁力搅拌5min；
48.2.6依次分取1.5ml样品溶液于离心管中，16000rpm下离心5min；
49.2.7吸取中间液体，注入液相。
50.色谱条件为：
51.检测波长：283nm、330nm；柱温：25℃
52.优化研磨时间对减小颗粒尺寸、增大载体和样品的比表面积具有重要意义。时间梯度设置为1～15min，考察在相同条件下(共聚维酮，250mg；提取时间，5分钟；液固比，10:1.00)。结果显示，从1分钟到10分钟，化合物的峰面积一直增加，从图3可以看出，研磨10分钟以上的萃取效率没有显著差异。原因是研磨时间不到10分钟，粒径不够小，导致广陈皮不能充分分散在共聚维酮表面，不能与水充分接触。因此，一些广陈皮仍然以沉淀形式存在于溶剂，导致化合物提取率低。当研磨时间为10min时，粒度足以使广陈皮充分分散在共聚维酮表面，分析物提取率相对较高。随着研磨时间的增加，试样与设备之间的摩擦增大，导致共研磨产物的损失。因此，10min为最佳研磨时间。
53.实施例3.考察提取时间对提取效果的影响
54.3.1取5个洁净球磨室，编号1、2、3、4、5，依次加入1.00g广陈皮粉末；取1个洁净球磨室，编号6；
55.3.2在编号1-5的球磨室内依次加入250mg共聚维酮，接着依次加入6个重量相等的瓷球；
56.3.3研磨10min；
57.3.4将共研磨产物取出，依次倒入5个洁净的锥形瓶，均加入10ml去离子水；
58.3.55组样品溶液分别进行磁力搅拌1，2.5，5，7.5，10min；
59.3.6依次分取1.5ml样品溶液于离心管中，16000rpm下离心5min；
60.3.7吸取中间液体，注入液相。
61.色谱条件为：
62.检测波长：283nm、330nm；柱温：25℃
63.由于萃取过程需要足够的时间来完成固液传质，萃取时间对萃取效率起着重要作用。一般情况下，随着提取时间的增加，提取效率会越来越高，直到目标组分提取完成。因此研究在其他实验参数保持不变的情况下(共聚维酮用量，250mg；研磨时间，10min；剂料比，10:1.00)，提取时间1，2.5，5，7.5和10分钟对提取率的影响。从图4可以看出，橙皮苷在2.5min时提取率达到最大值，而川陈皮素和橘皮素在5min时提取效果最佳。当达到最大值后，三种化合物的提取效率都经历了一个波动过程，直到达到平衡状态。在萃取初期，共磨产物未完全溶解。随着提取时间的延长，共磨产物的溶出度不断增加。在一定条件下，即使萃取时间继续增加，溶质的溶解度也达到最大值。此外,曲线在最高点显示下降趋势，这可能是由于提取时间长，导致溶液温度的上升，过高的温度可能会导致共研磨产物结构在某种程度上变性。考虑到节能和提取效率等因素，最佳提取时间为5min。
64.实施例4.考察剂料比对提取效果的影响
65.4.1取5个洁净球磨室，编号1、2、3、4、5，分别加入0.25，0.50，0.75，1.00，1.25g广陈皮粉末；取1个洁净球磨室，编号6；
66.4.2在编号1-5的球磨室内依次加入250mg共聚维酮，接着依次加入6个重量相等的瓷球；
67.4.3研磨10min；
68.4.4将共研磨产物取出，依次倒入5个洁净的锥形瓶，均加入10ml去离子水；
69.4.55组样品溶液分别进行磁力搅拌5min；
70.4.6依次分取1.5ml样品溶液于离心管中，16000rpm下离心5min；
71.4.7吸取中间液体，注入液相。
72.色谱条件为：
73.检测波长：283nm、330nm；柱温：25℃
74.液固比与液固接触面积有关，因此影响萃取效率。在其他实验参数保持不变的情况下(共聚维酮用量，250mg；研磨时间，10min；提取时间，5min)，研究了液固比的影响。从图5可以看出，在10:0.25～1.25ml/g范围内，随着液固比的降低，化合物的含量明显增大。当液固比从0.25:10提高到0.75:10ml/g时，可知萃取不完全。这一现象可以解释为，少量共研磨粉末在水中分散良好，接触面积较大，增强了传质效果；随着共磨粉量的增加，溶剂溶解粉末的效率逐渐趋于饱和，在10:1.0ml/g时达到最高。当比例合适时，溶液粘度也最合适，疏水化合物被共聚维酮完全分散并溶于水中。因此，当萃取比大于10:1.0ml/g时，萃取得率提高得并不明显，且萃取粘度过大不利于实验操作。为了获得更高的萃取效率，避免原料的浪费，在接下来的实验中选择10:1.0ml/g。
75.为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、日间精密度、重复性以及加样回收率。
76.日内精密度
77.1、取3个干净1.5ml离心管，编号1、2、3，分别配制10μg/ml的三种目标分析物的标准溶液；
78.2、16000rpm下离心3min；
79.3、吸取中间液体，注入液相；
80.4、进样分析，在同一天内不同的时间段进样6次。
81.日间精密度
82.1、取3个干净1.5ml离心管，编号1、2、3，分别配制10μg/ml的三种目标分析物的标准溶液；
83.2、16000rpm下离心3min；
84.3、吸取中间液体，注入液相；
85.4、进样分析，在三天内相同的时间点进样，每天进2次。
86.重复性
87.参照下列实验步骤，平行做3组，作为考察
88.1、取3个干净1.5ml离心管，编号1、2、3，分别配制10μg/ml的三种目标分析物的标准溶液；
89.2、16000rpm下离心3min；
90.3、吸取中间液体，注入液相，分析结果。
91.加样回收率
92.参照下列实验步骤，每个浓度平行做3组
93.1、称量1.00g广陈皮粉末(65目)，与250mg共聚维酮粉末共研磨10min，加入10ml去离子水，磁力搅拌5min。
94.2、加标(含量为1μg/mg和5μg/mg的混标)，室温下放置2小时使混标与样品均匀反
应；
95.3、16000转下离心5min；
96.4、吸取中间液体，注入液相。
97.图6为共聚维酮用量(x1,200-300mg)、研磨时间(x2,5-15min)、提取时间(x3,2.5-7.5min)对目标化合物提取效率影响的三维响应图；其中a为共聚维酮用量与研磨时间对目标化合物提取效率影响，b为共聚维酮用量与提取时间对目标化合物提取效率影响，c为研磨时间与提取时间对目标化合物提取效率影响，d为a的投影图，e为b的投影图，f为c的投影图。
98.图7为在其他条件相同的情况下目标化合物的混标溶液、经建立的方法提取的样品色谱图；a为330nm波长下混标溶液色谱图；b为283nm波长下混标溶液色谱图；c为330nm波长下经建立方法富集的样品色谱图；d为283nm波长下经建立方法富集的样品色谱图。实验结果汇总如下表2和表3：
99.表1
[0100][0101]
表2
[0102][0103]
结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性好。