一种提高苜蓿耐寒性的方法及农用制剂

1.本发明属于抗性作物培育技术领域，具体涉及一种提高苜蓿耐寒性的方法、提高苜蓿中抗氧化酶活力的方法及农用制剂。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.紫花苜蓿(medicago sativa l.)(以下简称苜蓿)起源于小亚细亚以及伊朗、土库曼高地和外高加索等地方(孙启忠等2019)，是极具有栽培价值的多年生优质豆科牧草，它的生产潜力巨大，营养价值高，不仅仅是世界范围内种植面积最大的一种优良牧草，也是我国分布范围最为广泛、经济潜力最高的牧草，素有“牧草之王”的美誉(苏加楷等2003)。
4.苜蓿种植一次可利用多年，但由于受生长环境所限，在种植利用过程中，诸如干旱、低温、盐碱和病虫等许多环境及生物因素会影响苜蓿可持续利用，其中冻害是影响苜蓿种植与利用的主要限制因素之一。低温对紫花苜蓿的影响是深刻而广泛的，它不仅影响苜蓿的分布，而且影响苜蓿草地的可持续利用。近几年我国北方苜蓿的种植面积不断扩大，苜蓿发展迅猛，其越冬问题已经成为制约我国北方苜蓿草地成功建植和草地可持续利用的关键问题。
5.5-氨基乙酰丙酸是四吡咯类化合物的前体物质，是一种广泛存在于微生物、植物和动物细胞中的非蛋白类氨基酸，参与调节叶绿素的合成与代谢。低浓度的ala具有促进植物光合作用、提高psⅱ反应活性、促进物质累积等作用，可以作为植物生长调节剂促进作物生长发育。现有研究表明，外源ala能够有效缓减干旱、盐渍、低温等非生物胁迫对植物生长所产生的抑制效应。


技术实现要素：

6.本发明的研究结果表明5-氨基乙酰丙酸(ala)能够提高紫花苜蓿的耐寒性能，经ala浸种处理的紫花苜蓿在寒冷胁迫条件下具有更好的生长态势，株高、叶片发育及地上总生物量均优于普通植株；针对其耐寒性提高的机制探索中，本发明对ala处理后的紫花苜蓿中抗氧化酶活性进行了测定，检测结果表明，低温胁迫条件下，ala能够有效提高苜蓿中抗氧化酶活性，植株中可溶性糖和可溶性蛋白的含量均显著增加，从而增强植株对不良生存环境的抵抗能力。
7.基于上述研究成果，本发明具体提供了提高苜蓿耐寒性及苜蓿植株中抗氧化酶活性的方法，上述方法可实现低温地带牧草产量的提升，以及获得高酶活的植物样本等。另外，本发明还提供ala在提高植物耐寒性农用制剂中的应用。
附图说明
8.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
9.图1为实施例1中所述ala对寒冷胁迫下苜蓿株高、叶片数和地上干物质量影响结果直方图；
10.其中，图1a为苜蓿株高统计结果，图1b为叶片数统计结果，图1c为地上干物质量统计结果。
11.图2为实施例1中所述ala对寒冷胁迫下苜蓿抗氧化酶pod，sod，cat影响结果直方图；
12.图2a为苜蓿中抗氧化酶pod变化统计结果；
13.图2b为苜蓿中抗氧化酶sod变化统计结果；
14.图2c为苜蓿中抗氧化酶cat变化统计结果。
15.图3为实施例1中所述ala对寒冷胁迫下苜蓿mda和相对电导率(ec)影响结果直方图；
16.其中，图3a为苜蓿中mda变化统计结果；图3b为苜蓿中相对电导率变化统计结果。
17.图4为实施例1中所述ala对寒冷胁迫下苜蓿可溶性蛋白(sp)和可溶性糖(ss)的影响；
18.其中，图4a为苜蓿中可溶性蛋白变化统计结果；图4b为苜蓿中可溶性糖变化统计结果。
具体实施方式
19.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
20.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
21.正如背景技术所介绍的，ala作为一种广泛存在于生物体中的类蛋白氨基酸，具有促进作物生长发育的效果。本发明研究进一步验证了，ala具有提高牧草耐寒性的效果，可通过提高作物体内抗氧化酶活及生物量的累积提高作物对低温环境的耐受能力。
22.本发明第一方面，提供一种提高苜蓿耐寒性的方法，所述方法包括采用5-氨基乙酰丙酸对苜蓿幼苗进行处理。
23.上述第一方面中，所述耐寒性的提升包括植物在低温环境中存活率的提升，还包括植物在低温环境中生长状态的提升。进一步的，所述低温环境的温度为2～8℃左右。
24.优选的，所述苜蓿表示豆科苜蓿属植物，包括但不限于紫花苜蓿(m.sativa l.)、野苜蓿(m.falcata l.)、花苜蓿(m.ruthenica(l.)trautv.)、南苜蓿(m.hispida gaertn)、天蓝苜蓿(m.lupulina l.)中的一种或几种；本发明验证可行的一种实施方式中，所述苜蓿为紫花苜蓿。
25.优选的，所述苜蓿幼苗为生长25～35d后的幼苗。
26.优选的，所述处理方式包括向幼苗喷洒包含5-氨基乙酰丙酸的药剂。
27.进一步的，所述包含5-氨基乙酰丙酸的药剂中，所述5-氨基乙酰丙酸的剂量应当是不低于8mg/l，进一步的，为9～11mg/l。
28.进一步的，所述处理方式还包括低温培养苜蓿幼苗，所述低温温度为2～7℃，更进一步的，为3～5℃，具体的，如4℃。一种实施方式中，所述苜蓿幼苗放置于4℃环境中进行培养，每天固定时间喷洒含有5-氨基乙酰丙酸的药剂，连续喷洒4～8天。
29.更进一步的，所述低温培养还包括对光照及湿度的调节，一种具体的实施方式中，所述光照条件如下：白天时长14～18h，光通量密度为8000～12000lx，夜间时长6～10h，光强为0lx；相对湿度为45～55％。
30.本发明第二方面，提供一种提高苜蓿中抗氧化酶活性的方法，所述方法包括采用5-氨基乙酰丙酸对苜蓿幼苗进行处理。
31.应当说明的是，第二方面所述提高苜蓿中抗氧化酶活性的方法，其应用目的包括提高植物抗性，还包括获得具有高酶活的生物样本，即所述5-氨基乙酰丙酸还可以作为一种造模试剂，用于提高特定酶高表达的生物样本。
32.优选的，所述抗氧化酶为包括但不限于超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)中的一种或几种。
33.本发明第三方面，提供一种抗寒型紫花苜蓿种子，所述种子来源于第一方面所述第一方面所述方法培养的耐寒性苜蓿，或所述种子采用5-氨基乙酰丙酸进行浸种处理。
34.本发明第四方面，提供一种提高苜蓿耐寒抗性的农用制剂，所述农用制剂中包括有效剂量的5-氨基乙酰丙酸。
35.所述有效剂量根据所述农用制剂的制剂形式、使用形式和使用对象存在不同，但均属于本领域技术人员根据常规研究思路可以获知的技术内容。
36.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
37.实施例1
38.1材料与方法
39.1.1试验材料与设计
40.以下实施例中所用紫花苜蓿(medicago sativa l.)品种为沃丰401，种子购买于西安百绿公司并存储于4℃冰箱中。试验使用药剂有10mg
·
l-1
5-氨基乙酰丙酸(ala)，ala的抑制剂20mm
·
l-1
乙酰丙酸(la)。
41.选取颗粒饱满的苜蓿种子播种于花盆中，每盆20粒种子，置于培养箱培养，待幼苗长出2片三出复叶时，每盆定苗4株。待生长25d后，将供试苜蓿材料放入4℃低温培养箱中，进行为期5d的低温喷施药剂处理，每天固定时间进行药剂喷施，以叶面药剂水珠不滴落为标准，以置于室温生长喷施蒸馏水的幼苗为对照(ck)。培养过程中每天适量浇水，每3d浇灌霍格兰德(hoagland)营养液.本实验4个处理，分别为：自然温度(ck)、低温(cold)、低温 5-氨基乙酰丙酸(c a)、低温 乙酰丙酸(c l),每处理3次重复。人工气候箱的设置为白天时长为16h，温度25℃，光通量密度10000lx；夜间时长为8h，温度为20℃，光强为0lx，相对湿度保持在50％。低温培养箱温度为4℃，其他参数相同。具体试验设计见下表。
42.表1试验设计表
[0043][0044]
1.2测定指标与方法
[0045]
处理完成后取苜蓿叶片快速用液氮冷冻，随即放置于-80℃冰箱测保存。丙二醛(mda)含量的测定采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量的测定使用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝-g250染色法；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)活性采用氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride)法；过氧化物酶(peroxidase)的活性采用愈创木酚法；过氧化氢酶(catalase)的活性采用紫外吸收法；叶绿素采用丙酮-乙醇浸提法；相对电导率采用电导率仪法。
[0046]
1.3数据分析
[0047]
数据采用spss 19.0进行单因素方差分析(p《0.05差异显著)，运用sigmaplot 14.0进行作图。
[0048]
2结果与分析
[0049]
2.1ala对寒冷胁迫下苜蓿株高、叶片数和地上干物质量的影响
[0050]
如图1所示，与ck相比，寒冷胁迫对紫花苜蓿的株高、叶片数、地上干物质量均产生显著影响，株高、叶片数、地上干物质量均显著降低(p《0.05)，分别降低了25.95％，27.29％，29.03％。
[0051]
与低温处理相比，c a处理组的株高和叶片数显著增加(p《0.05)，增加的数值分别为6.98％和11.68％；地上干物质增加的数值为9.09％，差异不显著(p》0.05)；
[0052]
与低温处理组相比，c l处理组的株高、叶片数和地上干物质量均显著下降(p《0.05)，分别下降了17.14％，11.68％，27.27％。
[0053]
在低温胁迫下，施加外源ala有助于增加紫花苜蓿的植株高度，叶片数和地上干物质量，而施加ala的抑制剂la则结果与之相反。
[0054]
说明从株高，叶片数和地上干物质量的角度来说，外源施加ala有助于提高紫花苜蓿的耐寒性。
[0055]
2.2ala对寒冷胁迫下苜蓿抗氧化酶pod，sod，cat的影响
[0056]
保护酶sod、pod、cat作为抗氧化系统中的关键酶，当植物受到低温胁迫时，植株通过升高sod、pod、cat酶活性来调节活性氧代谢平衡，避免活性氧自由基大量积累对膜脂造成伤害，进而增强苜蓿对低温的适应能力。
[0057]
与ck相比，低温胁迫下三种酶的活性都显著升高(p《0.05)，说明苜蓿材料在受到低温胁迫时sod、pod、cat酶活力迅速增加，以增强自身对低温逆境的抵抗能力。
[0058]
与低温处理组相比，c a处理组的sod、pod、cat酶活力显著增加(p《0.05)，c l处理组3种酶的活力则显著下降(p《0.05)，说明ala对苜蓿材料适应低温时起到了促进作用。
[0059]
2.3ala对寒冷胁迫下苜蓿mda和相对电导率(ec)的影响
[0060]
电导率可直接反映细胞膜的伤害程度，电导率大小与植物耐寒性紧密相关，植物受到低温胁迫越严重，细胞外渗电解质越多，电导率越大。
[0061]
丙二醛含量与细胞膜系统伤害程度密切相关，其作为植物细胞膜脂过氧化产物，可直接反映细胞的伤害程度。
[0062]
由图可知，与ck相比，低温下苜蓿的mda含量和相对电导率显著增加1.12倍和1.41倍(p《0.05)，表明苜蓿的细胞膜在低温胁迫下遭受到一定程度的破坏。
[0063]
而与cold处理组相比，c a处理组mda和相对电导率显著降低(p《0.05)，降低的数值为35.99％和50.0％；c l处理组则显著升高(p《0.05)，升高的数值为83.32％和30.94％。表明外源ala的施加减轻了低温胁迫对苜蓿的伤害。2.3ala对寒冷胁迫下苜蓿可溶性蛋白(sp)和可溶性糖(ss)的影响
[0064]
可溶性蛋白含量的增加可提高植株细胞对水分的保持能力，增强植物对低温的适应性。
[0065]
可溶性糖作为植物细胞渗透调节物质，可维系植株体内的水分平衡，防止细胞内水分大量外渗对植物造成严重伤害。
[0066]
与ck相比，低温处理组可溶性蛋白和可溶性糖都显著增加(p《0.05)，分别增加的数值为19.29％和70.74％。说明苜蓿通过积累可溶性蛋白和可溶性糖来适应低温环境。
[0067]
与低温处理组相比，c a处理组可溶性蛋白和可溶性糖均显著增加(p《0.05)，增加的数值为34.13％和33.62％；c l处理组的可溶性糖较低温处理组显著降低了13.67％(p《0.05)，可溶性蛋白降低了8.66％，但差异不显著(p》0.05)。
[0068]
可溶性糖和可溶性蛋白含量越高则表明植物能用更多的可溶性糖和可溶性蛋白调节细胞内水分的稳定，进而提高植物对低温的适应能力。因此，外源ala的施加提高了苜蓿的耐寒性。
[0069]
3讨论
[0070]
3.1外源ala对寒冷胁迫下苜蓿株高、叶片数和地上干物质量的影响
[0071]
植株高度虽然与越冬率没有直接关系，但植株高度能够直观反映苜蓿材料在低温环境下的生长状态。苜蓿因其高蛋白含量而被誉为优质牧草，而苜蓿的大部分蛋白质都是贮藏在叶片中，因此叶片数是衡量苜蓿质量的标准之一。干物质量是是苜蓿生物量的最直观表现，试验结果表明，低温胁迫会降低苜蓿的植株高度，减少叶片数量和干物质量，而在低温胁迫下外源施加ala能够缓解胁迫状态，施ala的抑制剂la则加剧了胁迫状态，进一步说明ala能够提高苜蓿材料的耐寒性。
[0072]
3.2外源ala对寒冷胁迫下苜蓿抗氧化酶的影响
[0073]
植物在正常环境中活性氧的产生和清除处于平衡之中，当植物遭受胁迫时平衡会被打破，产生大量的活性氧，对植物的生理生化过程产生阻碍。植物活性氧的清除剂有抗氧化酶和抗氧化剂两种，其中pod可以降解h2o2，因此在低温胁迫时能够避免细胞受到冻害，而sod能够在清除o
2-的时候产生h2o2，所以二者是相辅相成的。cat可以催化h2o2转化成为h2o，使植物忍耐或者减缓寒冷环境带来的伤害。试验结果表明在苜蓿材料遭受低温胁迫时，施
加外源ala能够增加sod,pod,cat的活力，清除超氧阴离子自由基使活性氧代谢达到平衡状态，保持膜系统的稳定性，提高苜蓿的耐寒性。
[0074]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。