铁死亡诱导剂RSL3在制备用于抑制胶质母细胞瘤的药物中的应用

铁死亡诱导剂rsl3在制备用于抑制胶质母细胞瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是指铁死亡诱导剂rsl3在制备用于抑制胶质母细胞瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，一般可分为4个组织病理学级别(i-iv)。iv级胶质瘤又称多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiform,gbm)，是最恶性的胶质瘤形式，gbm患者的平均生存时间约为15个月，5年生存率小于5％。手术、放疗和替莫唑胺(temozolomide)等烷化剂化疗是主要的治疗手段，因具有高度的侵袭性生长和治疗耐药性，胶质母细胞瘤治疗效果普遍不佳。临床上大部分胶质母细胞瘤患者(约90％)诊断为idh1/2野生型，一般无胶质瘤病史，多为原发。另外约10％的胶质母细胞瘤患者存在idh1/2突变，有低级别胶质瘤病史，定义为继发性胶质母细胞瘤。研究发现，idh1/2突变的胶质母细胞瘤患者对替莫唑胺治疗敏感，预后优于野生型idh1/2的患者。癌症基因组图谱(tcga)项目通过二代测序揭示了胶质母细胞瘤的遗传和转录组特征，将gbm分为四种分子亚型:前神经型,神经型,间充质型,和经典型。在临床预后和治疗方面，这些亚型对应着不同的生存时间和治疗反应。
3.铁死亡是一种铁依赖的细胞死亡形式，不同于凋亡或坏死，脂质过氧化在铁死亡中起核心作用，研究表明铁死亡可能是由gsh-gpx4抗氧化系统的破坏引起的。此外，铁的正常代谢和稳态也可以保护细胞免受铁死亡。铁有两种氧化态:亚铁(fe
2
)或铁(fe
3
)。铁氧化还原循环可能影响细胞对铁死亡的敏感性。fe
3
在血清中与转铁蛋白(tf)结合，然后通过细胞膜上的转铁蛋白受体(tfrc和tfr2)被细胞吸收。目前认为有四类铁死亡诱导剂(fins)可通过不同的机制诱导铁死亡。i类(如erastin和索拉非尼)抑制系统xc-的活性并耗尽谷胱甘肽。erastin通过抑制slc7a11抑制胱氨酸的吸收和减少谷胱甘肽gsh的合成，从而导致活性氧(ros)的积累来诱导铁死亡。细胞中谷胱甘肽含量的降低也会抑制谷胱甘肽过氧化物酶4(gpx4)的活性，导致细胞抗氧化能力下降，脂质活性氧增加，最终导致铁死亡。ii类药物(如rsl3)直接抑制gpx4的活性，gpx4是一种谷胱甘肽依赖的磷脂过氧化物酶。iii类药物(如fin56)可诱导gpx4降解，并干扰甲戊酸途径中间体的产生，包括辅酶q10(coq10)。iv类药物(例如fino2)促进脂质过氧化和gpx4活性丧失。结合以上可以推断，gpx4是诱导铁死亡的核心靶点。
4.越来越多的证据表明，铁死亡在癌症的发展和耐药性中起着重要的作用。有报道称，铁死亡相关基因参与替莫唑胺耐药性，靶向slc7a11能促进替莫唑胺在胶质瘤细胞中的抑制作用。值得注意的是，以前的报道主要集中在i类药物(erastin)，而ii类药物(rsl3)对gbm细胞的影响尚未在转录组水平上描述。此外，铁死亡和替莫唑胺耐药相关的生物标志物仍未发现。


技术实现要素：

5.本发明利用铁死亡诱导剂rsl3在体外(细胞系)和体内(皮下瘤和原位移植瘤动物模型)施用，然后对野生型或突变型idh1的胶质母细胞瘤细胞进行rna测序，并进行转录组分析。通过对rna测序和公共tcga胶质瘤数据库的数据分析，确定与铁死亡相关的生物标志物，能够用于预测胶质瘤的预后和替莫唑胺耐药。通过数据分析，发现rsl3可以抑制胶质母细胞瘤细胞的生长，抑制细胞周期相关基因的表达。rsl3还通过下调上皮-间充质转化的关键基因，有效地降低了胶质母细胞瘤细胞的侵袭性。此外，rsl3联合替莫唑胺对胶质母细胞瘤细胞生长具有更强的抑制作用，为胶质母细胞瘤的治疗提供了一种有前景的治疗策略。
6.因此，在本研究中，通过体外和体内模型以及转录组学分析，描述了rsl3对胶质母细胞瘤细胞的抑制作用。
7.铁死亡诱导剂rsl3在制备用于抑制胶质母细胞瘤的药物中的应用。
8.在根据本发明的一个实施方案中，铁死亡诱导剂rsl3作为替莫唑胺的辅助成分、或联合使用的复合成分。
9.本发明还提供了一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物，包含配合施用的第一药剂和第二药剂，所述第一药剂的活性成分为铁死亡诱导剂rsl3，所述第二药剂的活性成分为替莫唑胺。
10.在根据本发明的一个实施方案中，第一药剂中铁死亡诱导剂rsl3的有效量为20mg/kg。
11.在根据本发明的一个实施方案中，以7天为一个疗程计，所述第一药剂与第二药剂的施用比为4：7。优选地，在施用时，第一药剂隔日施用，第二药剂连续施用一周后暂停。
12.在根据本发明的一个实施方案中，所述第一药剂和第二药剂的剂型各自独立的选自片剂、胶囊或注射剂中的任一种。本发明的上述技术方案的有益效果如下：
13.本发明发现rsl3可以抑制胶质母细胞瘤细胞的生长，抑制细胞周期相关基因的表达。rsl3还通过下调参与上皮-间充质转化的关键基因，有效地降低了胶质母细胞瘤细胞的侵袭性。此外，rsl3联合替莫唑胺对胶质母细胞瘤细胞生长具有更强的抑制作用，为胶质母细胞瘤的治疗提供了一种有前景的治疗策略。虽然与野生型相比，替莫唑胺对idh1突变型胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力的抑制效果更好，但rsl3和替莫唑胺的联合同样削弱了idh1野生状态下胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力。本发明为胶质母细胞瘤提供了更加有效的治疗方案，并且在替莫唑胺抗性的情况下也提供了能够显著抑制胶质母细胞瘤的解决方案。
附图说明
14.图1为胶质母细胞生长的具有代表性的图像和统计图；
15.图2为rsl3对胶质母细胞活性和迁移能力的抑制作用的相关检测图谱；其中，a)为胶质母细胞瘤细胞的伤痕愈合试验，结果显示rsl3药物处理组的胶质瘤细胞愈合能力减弱；b)为transwell侵袭试验的代表性图像和统计图，结果显示与对照组相比，rsl3给药组的肿瘤细胞侵袭能力显著降低；c)为经dmso或rsl3处理的胶质母细胞瘤细胞中emt相关蛋白的蛋白免疫印迹，显示n-cad,vim等emt相关蛋白的表达明显下降；d)为用dmso、rsl3和喜树碱处理的胶质母细胞中cleaved caspase 3的表达图谱，其结果证明了rsl3所诱导的细胞死亡不同于其他类型的细胞死亡模式。
16.图3为展示rsl3和tmz对胶质母细胞瘤细胞侵袭的影响的相关图谱；其中，a)为检测单独的tmz处理和rsl3与tmz联合处理的胶质母细胞瘤细胞时tmz的半数致死率ic50图谱；b)为transwell侵袭试验分析统计图；c)为不同处理处理方式下胶质母细胞瘤细胞的透射电镜的代表性图像，比例尺＝1μm(上)和0.1μm(下)。
17.图4为展示rsl3和tmz对胶质母细胞生长的抑制作用的相关图谱；其中，a)为dmso、rsl3、tmz以及rsl3 tmz联合处理胶质母细胞小鼠皮下瘤生长的代表性图像和统计图；b)为不同治疗方法下皮下肿瘤的代表性免疫组化结果图；c)为不同治疗方法下胶质母细胞透射电镜的代表性图像，比例尺＝1μm(左)和0.1μm(右)；d)为不同治疗方法下胶质母细胞原位移植瘤生长的代表性生物发光图像和信号强度统计图。
18.图5为展示rsl3对胶质母细胞瘤细胞活性和迁移能力的抑制作用的相关图谱；其中，a)为dmso或rsl3处理idh1野生型(idh1wt)和突变型idh1(idh1mu)胶质母细胞瘤细胞后的细胞活性检测；b)为使用dmso、rsl3、tmz以及rsl3 tmz组合处理idh1wt和idh1mu胶质母细胞瘤细胞的transwell侵袭实验分析的代表性图像和统计图，比例尺＝200μm。
19.图6为idh1-mu和wt对rsl3和替莫唑胺联合治疗的结果对比图谱，其中，a为胶质母细胞瘤细胞对rsl3的ic50结果图；b为基于转录组进行rna测序的结果图谱；c为kegg数据库分析结果图谱；d为rsl3下调基因富集的基因集与侵袭和上皮-间充质转化emt的关联性分析图谱；e为rsl3上调的基因与侵袭和emt的关联性分析图谱。
具体实施方式
20.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
21.实施例1细胞系和培养条件
22.293t、ln18、ln229细胞系购自atcc(manassas,va,usa)。gbm1细胞为自主建立的人类原代胶质母细胞瘤细胞系。构建idh1突变体和野生型胶质母细胞瘤细胞在dmem(gibco)培养基中培养；所有培养基中添加10％胎牛血清(gibco)和1％青霉素/链霉素。所有细胞均置于37℃、5％co2的湿化培养箱中培养。用rsl3(1μm,selleck，#s8155)或喜树碱(1μm,cst，#13637)处理细胞，观察细胞的铁死亡和凋亡情况如图2中d)所示。使用mycoalert plus(lonza)定期检测所有细胞的支原体污染，在实验中使用的细胞支原体阴性。
23.实施例2 idh1突变型和野生型胶质母细胞瘤细胞的建立
24.构建idh1突变型和野生型胶质母细胞瘤细胞，将表达idh1野生型或突变型的慢病毒包装在转染psik-idh1-flag(addgene#66802)或psik-idh1-r132h-flag(addgene#66803)导入包装质粒的293t细胞中。经潮霉素和dox筛选后，收集细胞，蛋白免疫印迹(wb)检测野生型idh1和r132h突变型idh1。
25.实施例3细胞增殖分析
26.按照制造商的说明，采用cck8检测(hy-k0301,mce)评估细胞增殖/生长。即在96孔板中以2000-10000个细胞/100ml的密度接种细胞。24h后用rsl3和/或替莫唑胺处理细胞24小时、48小时和72小时。在指定的时间点加入cck8染料溶液，37℃孵育3-4h，在450nm处检测吸光度。
27.结果如图1所示，其中，ln18和ln229细胞系在对照组及仅添加等量溶剂dmso组中
细胞显示正常增殖；但在药物处理组即rsl3给药组中显示随时间延长，药物rsl3对细胞增殖产生抑制，并逐步对细胞进行杀伤。可见，与对照组相比，rsl3药物处理组的细胞增殖明显被抑制。
28.实施例4蛋白免疫印迹检测
29.蛋白免疫印迹检测western blot检测蛋白表达水平。细胞在100mm培养皿中生长至80％左右，用冰裂解缓冲液(50mm hepes ph 7.4,150mm nacl,5％甘油，ripa，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂)裂解细胞。提取的蛋白和裂解液混合物与4
×
sds样品缓冲液(180mm hepes ph 7.4,40％甘油，4％sds,4％-巯基乙醇，0.04％溴酚蓝)混合，在95℃加热5分钟。接下来，将这些样品加到4％-15％mini-tgx预制凝胶(bio-rad)中进行电泳，用预染色蛋白标记(benchmark,invitrogen)。然后将蛋白转移到0.2μm trans-turbo mini pvdf膜(bio-rad)中。用5％bsa在含0.1％tween-20的tris缓冲盐水中封闭膜1小时，在4℃与一抗孵育过夜。然后用辣根过氧化物酶(hrp)偶联的二抗在室温下孵育膜1小时。amersham imager 600(ge healthcare life sciences)检测化学发光信号。采用imagej软件对蛋白条带强度进行测量和定量。蛋白印迹检测中使用的一抗为:idh1(d2h1)rabbit mab(cst，#8137)；antibody twist1(e7e2g)rabbit mab(cst，#69366)；anti-n-cadherin(d4r1h)xp rabbit mab(cst#13116)；anti-vimentin(d21h3)xp rabbit mab(cst，#5741)；anti snail(c15d3)rabbit mab(cst，#3879)；anti-slug(c19g7)rabbit mab(cst，#9585)；anti-β-actin(8h10d10)mouse mab(cst，#3700)；anti idh1-r132h(人)单抗(mbl，#d299-3)，铁蛋白重链抗体anti-ferritin heavy chain antibody(abcam，#ab183781)；铁蛋白轻链抗体anti-ferritin light chain antibody(abcam,#ab69090)；gpx4 rabbit pab(zhengneng,chengdu,china,#384461)；gpx4 rabbit pab(abclonal，中国武汉，#13309)。结果如图2中c)所示，emt相关标记蛋白如n-cad,vim，slug等均有明显表达差异。
30.实施例5免疫组织化学
31.小鼠肿瘤组织石蜡包埋后切4μm薄片做免疫组化染色。切片首先脱蜡和水化，然后在3％的过氧化氢中孵育30分钟，使内源性过氧化物酶失活。抗原修复采用微波法，用高压锅在缓冲液中煮沸2分钟。然后在室温下用1％牛血清白蛋白孵育30分钟，阻断非特异性抗原结合。一抗4℃孵育过夜后，用辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗37℃孵育30分钟。用缓冲二氨基联苯胺(dab)溶液染色。最后用苏木精染核，用中性树脂封片。判读结果以染色阳性细胞百分率表示，以0～3分(0：未染色；1：≤25％；2：26％～50％；3：≥50％)。
32.结果如图4中b)所示，免疫组化染色结果显示tmz和rsl3双药联合组，小鼠肿瘤组织ki67的增殖率染色明显低于安慰剂对照组和tmz或rsl3单药治疗组。
33.实施例6体外伤痕愈合
34.接种ln18、ln229细胞于培养皿中，用移液管尖刮伤细胞。用1μm rsl3(selleck，#s815503)及dmso作对照分别处理细胞。培养皿置于莱卡af-6000lx活细胞工作站培养箱中培养。通过定点定时拍照测量，计算从初始时间到选定时间点细胞迁移覆盖的距离来确定细胞的迁移率。
35.结果如图2中a)所示，与对照组相比，rsl3药物处理组的细胞愈合能力显著降低。
36.实施例7侵袭检测
37.用美国康宁公司购买的transwell小室培养(直径12mm，孔径8.0膜)来研究侵袭
性。在处理24小时后，用pbs清洗细胞培养室两次，用4％甲醛固定10分钟，用结晶紫(碧云天，#c0121)对固定细胞染色15分钟。之后在pbs中再次洗涤，并用棉签擦去小室上层残留结晶紫。使用倒置光学显微镜(olympus ix71,olympus,tokyo,japan)在12个随机视野中统计迁移到小室下表面的细胞数量。
38.结果如图2中b和图3所示，rsl3处理组细胞的侵袭能力明显降低。
39.实施例8 rsl3和tmz联合作用降低了胶质母细胞瘤细胞的活力和迁移能力
40.有报道称，铁死亡促进了胶质母细胞瘤细胞对化疗药物替莫唑胺敏感性，通过对tmz半数致死率ic50的测量，rsl3可以抑制胶质母细胞瘤细胞对tmz敏感(如图3中a所示)。transwell侵袭实验显示，rsl3能诱导胶质母细胞瘤的侵袭(如图2中d所示)。rsl3和tmz联合使用比单独使用rsl3或tmz更能抑制gbm细胞的侵袭(如图3中b所示)。为了准确检测铁死亡，通过进行透射电镜检查，发现tmz治疗没有损伤线粒体，但rsl3可引起线粒体破坏，这是铁死亡的典型效果，然而，rsl3和tmz的结合显著破坏了线粒体和其他细胞器(图3中c)，证实了tmz处理可增强rsl3诱导的铁死亡的作用，rsl3和tmz联合作用降低了胶质母细胞瘤细胞的活力和迁移能力。
41.实施例9 rsl3和tmz联合作用可有效抑制胶质母细胞瘤细胞的生长
42.为了检测rsl3和tmz单独或联合作用的体内效应，将胶质母细胞接种到小鼠皮下。值得注意的是，单独使用tmz或rsl3可以适度抑制肿瘤的生长，但两种药物联合使用对肿瘤的生长抑制效果更强(如图4中a所示)。肿瘤灶免疫组化染色显示，与rsl3和tmz同时处理的肿瘤中ki67阳性细胞明显减少(如图4中b所示)。在经rsl3或rls3 tmz处理的gbm样品中，gpx4水平也显著下降(图4中b)。透射电镜数据进一步表明，rsl3和tmz联合处理后，gbm细胞线粒体受到严重损害(图4中c)。进一步原位移植胶质母细胞瘤细胞到小鼠的大脑中，待成瘤后，对荷瘤小鼠分组给予不同药物组合治疗,结果显示，两种药物联合治疗对肿瘤生长的抑制作用比单独药物治疗更明显，肿瘤体积明显缩小(如图4中d所示)。由此可见，rsl3与tmz联合对gbm具有较强的抗肿瘤作用。
43.实施例10 idh1-mu和wt对rsl3和替莫唑胺联合治疗均敏感
44.临床上，idh1 r132h突变体(idh1
mu
)的胶质母细胞瘤的预后优于idh1野生型(idh1
wt
)。为了研究idh1状态对rsl3反应的潜在影响，构建了idh1
wt
野生和idh1
mu
突变的胶质母细胞瘤细胞(图5中a)。ic50测量结果显示，与idh1
wt
相比，idh1
mu
的胶质母细胞瘤细胞对rsl3更敏感(图5中a)。分别对idh1
wt
和idh1
mu
的细胞进行侵袭实验验证也发现rsl3和替莫唑胺联合使用能对idh1
wt
这一类药师反应不敏感的细胞产生十分有效的侵袭抑制效果(图5中b)。idh1
wt
和idh1
mu
细胞转录组rna测序发现idh1
wt
的大部分变化基因也与idh1
mu
相同(图6中a、b)。kegg数据库分析显示，在idh1
wt
和idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞中，rsl3处理后显著下调的基因富集了tgf-β信号通路，在idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞中主要检测到hippo信号通路、dna复制和细胞周期信号通路(图6中c)。在idh1
wt
和idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞中，rsl3处理后引起上调的基因富集了类风湿性关节炎和mapk信号通路。进一步对rna测序数据，结果显示idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞比idh1
wt
胶质母细胞瘤细胞具有更丰富的基因集，idh1
wt
胶质母细胞瘤细胞中的大部分基因集覆盖了idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞(图6中a、b)。研究中发现，rsl3下调基因富集的基因集与侵袭和上皮-间充质转化emt的增加相关(图6中d)，rsl3上调的基因与侵袭和emt减少相关(图6中e)。此外，rsl3处理后上调的基因富集了铁离子转
运、活性氧和炎症反应途径，证实了尽管idh1有不同的状态，rsl3在都能在胶质母细胞瘤细胞中诱导铁死亡的发生。然后检测rsl3或/和替莫唑胺对gbm细胞侵袭的影响，发现rsl3处理对idh1状态没有差异，但替莫唑胺对idh1
mu
胶质母细胞瘤细胞的侵袭抑制明显强于idh1
wt
细胞。然而，rsl3和替莫唑胺的联合治疗比单独使用这两种药物更有效。最终说明rsl3能显著抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭性生长，替莫唑胺可增强这种抑制作用。
45.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。