埃格特氏菌(Eggerthellalenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒

埃格特氏菌(eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种埃格特氏菌(eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)是一种专性厌氧革兰阳性杆菌，生长缓慢，5d内可形成肉眼可见菌落，1935年科学家埃格特首次从人类粪便中分离出该菌，最初归类在厌氧杆菌属中，1999年完成测序后细分为埃格特菌属。
3.类风湿关节炎又称类风湿(rheumatoid arthritis,ra)，是发病机制还没有完全明确的一种慢性的、对称性的、全身性的、炎症性的自身免疫性疾病，目前ra已成为危害人类健康的重要疾病之一，ra病因复杂、变化多样，现研究证明ra被认为与细菌感染密切相关，前期研究证明ra患者的肠道菌群失衡，并发现埃格特氏菌、牙龈卟啉单胞菌、拟杆菌等显著表达失衡。ra与骨关节炎(osteoarthritis,oa)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎等疾病症状有相似性，因此建立一种更加快速鉴别诊断ra的方法，对临床上确诊及治疗有积极指导意义。
4.ra自身抗体的检查是目前主要诊断检查方法一般包括：患者关节液培养、关节滑膜活检、类风湿因子检测、抗ccp抗体检测、抗核抗体，这些方法虽有利于ra的诊断和治疗，但检查操作繁琐、判断指标复杂，而利用埃格特氏菌在ra患者肠道的富集开发的埃格特氏菌检测试剂盒，便成为了一种快速有效的诊断方法。
5.前期本研究通过三代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上，且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)6例，用二代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上，且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)76例均检测出埃格特氏菌全长dna序列，而在健康人的粪便中是没有的。同时本研究在类风湿关节炎患者的关节腔的滑膜液中用16srdna测序方法也检测到eggerthella lenta dna片段，申请人认为eggerthella lenta同时存在肠道和关节滑膜液中这正是类风湿关节炎“菌-肠-关节轴”致病新机制的发现所在，突破肠壁屏障，进入血液的通路，游离到关节从而加速关节病变的发生。我们预测可以针对eggerthella lenta的特异性，采用菌群移植，口服益生菌等手段，实现对类风湿关节炎的早期治疗和预防。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一是提供一种埃格特氏菌的特异性引物；
7.本发明的再一目的是提供一种埃格特氏菌的特异性检测方法；
8.本发明的再一目的是提供用于诊断ra的检测试剂盒。
9.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
10.本发明根据埃格特氏菌的线粒体dna序列，设计一对特异性引物，该引物只对埃格
特氏菌具有扩增能力，该引物的核苷酸序列如下所示：
11.正向引物：elen-f：(5
′‑
agagtttgatcatggctcag-3
′
)；
12.反向引物：elen-r：(5
′‑
tacggctaccttgtacgactt-3
′
)。
13.根据本发明的特异性引物进行埃格特氏菌的检测方法包括如下步骤：
14.(1)目的dna的提取：从粪便或滑膜液样本中提取肠道微生物dna；
15.(2)利用所述的特异性引物对所述目标dna进行扩增，得到扩增产物；
16.(3)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
17.根据本发明的特异性引物，设计一种埃格特氏菌检测试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列为：正向引物：elen-f：(5
′‑
agagtttgatcatggctcag-3
′
)；反向引物：elen-r：(5
′‑
tacggctaccttgtacgactt-3
′
)的一对特异性引物。利用所述特异性引物进行检测埃格特氏菌从而诊断患者是否具有类风湿关节炎。
18.本发明的有益效果是：类风湿关节炎的常规检测均是采集血液样本进行检测，存在一定的局限性。本发明的创新之处是利用埃格特氏菌的检测，对疑似类风湿关节炎患者进行粪便样本的检测。前期我们对156例粪便样本进行宏基因组测序发现，埃格特氏菌在类风湿关节炎患者粪便中高表达，并且在其终端关节腔的滑膜液中也通过16s测序发现埃格特氏菌的dna片段，我们推测埃格特氏菌因为肠道微环境的失衡导致异常增加，在类风湿关节炎从临床前阶段向临床阶段的转变中发挥着重要作用。本发明的检测方法方便快捷，能在较短的时间内鉴定埃格特氏菌(eggerthella lenta)，且不需要昂贵的仪器设备；特异性好，本发明根据16s rna基因序列设计引物，高特异性与目的基因结合。本发明对于埃格特氏菌高表达的ra诊断与临床治疗具有较高的参考价值，适于推广应用。
19.为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。
附图说明
20.图1为验证引物对埃格特氏菌的扩增效果实验中pcr产物的电泳图；
21.图2为通过宏基因组二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing,mngs)用illumina(solexa测序技术)测序平台进行验证迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)与类风湿(ra)的相关性实验中粪便样本中含有e.lenta dna片段的样本数；
22.图3为通过宏基因组二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing,mngs)用illumina(solexa测序技术)测序平台对16s rdna基因测序方法进行验证迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)与类风湿(ra)的相关性实验中关节囊滑液样本中含有e.lenta dna片段的样本数；
23.图4为通过三代实时单分子测序pacbio smrt技术进行宏基因组测序方法进行验证迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)与类风湿(ra)的相关性实验中粪便样本中含有e.lenta dna片段的样本数。
具体实施方式
24.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明的具体实施方式公开了根据埃格特氏菌的线粒体dna序列设计的一对特异性引物、利用所述特异性引物对埃格特氏菌进行检测的方法、以及利用所述特异性引物能够诊断类风湿关节炎的检测试剂盒。
26.实施例1：本发明实施例的特异性引物对埃格特氏菌的扩增效果
27.1)模板dna提取：
28.随机选择并采集14名ra患者的粪便为样品以及一名健康人的粪便作为对照组，具体步骤如下：
29.(1)取约200mg粪便样品温度调节为室温；
30.(2)加入550ul65℃预热的2
×
ctab，95℃金属浴5min；
31.(3)振荡器中混匀1min，使沉淀物溶解；
32.(4)向振荡器内加入550ul的酚仿，振荡器混匀1min，12500rpm离心10min；
33.(5)取上清300ul，加入900ul溶液pc，振荡器混匀30s；
34.(6)取600ul混合液于离心柱中，12500rpm离心1min；
35.(7)弃废液，重复取混合液离心，直到离心管内液体全部滤过离心柱；
36.(8)加入450ul溶液pw，12500rpm离心1min，弃废液，重复离心两次；
37.(9)12500rpm空管离心2min，并静置离心柱2min充分挥发乙醇；
38.(10)向离心柱内加入30ul已65℃预热eb；
39.(11)室温孵育5min，12500rpm离心1min即为模板dna。
40.2)埃格特氏菌特异性引物的合成：
41.正向引物：elen-f：(5
′‑
agagtttgatcatggctcag-3
′
)；
42.反向引物：elen-r：(5
′‑
tacggctaccttgtacgactt-3
′
)。
43.3)pcr扩增反应
44.pcr体系包括如下组分：
45.试剂体积(μl)ddh2o7.5elen-f1elen-r1dmso22
×
fast taq12.5模板dna1
46.4)反应程序为：
47.96℃预变性5min；35个循环：96℃20sec、58℃20sec、72℃60sec；最后72℃延伸10min。
48.5)pcr产物的鉴定：
49.首先制备0.8％琼脂糖凝胶，然后加样后电泳35min，最后通过紫外成像仪观察照相并根据扩增产物的大小判定结果。如图1所示，图中m：marker，即样本你，其中m1-m14来自于不同类风湿关节炎粪便样本提取dna后检测，m15是健康人粪便dna作为阴性对照，图中可
以看出pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果中有大小约1400bp的明亮条带，此条带大小与迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)相符。
50.实施例2：通过宏基因组测序技术平台进行验证迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)与类风湿(ra)的相关性实验中粪便样本和滑膜液样本中含有e.lenta dna片段的样本数。
51.如图2所示，本发明实施例选取156例粪便样本：健康人粪便样本(hf)：35例(n＝35)，类风湿关节炎粪便样本(raf)：76例(n＝76)，骨关节炎粪便样本(oaf)：45例(n＝45)并进行宏基因组二代测序，结果数据统计为raf为76例，阳性率为100％，验证ra患者粪便中含有e.lenta dna片段。(以骨关节炎和健康人为对照组)
52.如图3所示，本发明实施例通过对210例关节囊滑液样本:骨关节炎滑膜液样本(oasf):112例(n＝112)，类风湿关节炎滑膜液样本(rasf)：98例(n＝98)进行16srdna v
1-v2区二代测序，数据统计结果为rasf：98例，可验证ra患者滑液含有e.lenta dna片段,阳性率为100％。(以骨关节炎为对照组)
53.如图4所示，本发明实施例通过对6例ra粪便样本通过三代实时单分子测序pacbio smrt技术进行宏基因组测序方法进行验证迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)在ra粪便样本中含有e.lenta菌，阳性率为100％。(以健康人为对照组)
54.以上对本发明的较佳实施例进行了具体说明，当然，本发明还可以采用与上述实施方式不同的形式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下所作的等同的变换或相应的改动，都应属于本发明的保护范围内。