微针及其制造方法与流程

微针及其制造方法
1.本技术是对申请日为2016年4月6日、申请号为2016800192600、发明名称为“蛋白质或肽传递用的可溶性微针”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本技术要求享有于2015年4月6日提交的韩国专利申请10-2015-0048462、于2015年11月13日提交的韩国专利申请10-2015-0159966、于2015年4月6日提交的韩国专利申请10-2015-0048471、于2015年10月16日提交的韩国专利申请10-2015-0144873的优先权，通过援引将该专利申请结合在此，如同该专利申请在此被全部公开一样。
3.本发明涉及一种可溶性微针、能够将蛋白质或肽稳定地传递至皮肤的透皮给药系统以及改善了不稳定蛋白质或肽的稳定性的透皮给药系统。


背景技术：

4.近年来，为了改善皮肤状态(例如，皱纹、弹性等)，正在开发包含生长因子(epidermal growth factor(表皮生长因子，egf)、human growth hormone(人生长激素，hgh)、transforming gowth factorαandβ(转化生长因子tgf-α，-β)、fibroblast growth factor 1 and 2(成纤维细胞生长因子fgf-1，-2)、keratinocyte growth factor(角质细胞生长因子，kgf)、hepatocyte growth factor(肝细胞生长因子，hgf)、platelet derived growth factor(血小板衍生生长因子，pdgf)等)等的各种蛋白质和肽，并有包含这种蛋白质和肽的各种化妆品被开发上市。
5.例如，egf是在人体伤口自然愈合的过程中，能够促使肉芽(肉芽组织)生长，并促使血管再生的体内伤口治愈物质，能够对老化现象发挥效果，因此，最近正进行着针对含有egf成分的化妆品的开发。
6.然而，尤其是这种生长因子的生物半衰期短，且缺乏持续稳定性，因此，常有报道指出将其含入普通化妆品剂型时发生改性，从而难以发挥效果。为了改善这种不稳定蛋白质的稳定性，有时会利用微粒(microparticle)或脂质体(liposome)等的被囊化(encapsulation)方法。然而，在这种方法中，由于粒子和脂质体的体积大(几十至几百nm，或几μm以上)，仅通过皮肤涂抹，难以直接吸收至皮肤内。
7.其次，对这种用于改善皮肤状态的蛋白质而言，在大多数情况下，仅通过含量的增加，就难以提高所期望的效果。即，表皮生长因子(egf)、人生长激素等作为活性蛋白质成分中的一种，比起含量，其活性度更为重要，并且，即便是增加了含量，在没有活性度的情况下，也难以获得期望的效果。
8.另外，对皮肤有益且有用的物质而言，为了通过实际的产品发挥其功效，必须在使用产品时透过角质层并从表皮层浸透至真皮层才能够发挥效果，需要一种能够均匀地传递至整个皮肤的方法。以往有一种利用表面活性剂等提高透过性的方法，然而，其透过性的提升效果微乎其微，并且，具有软化皮肤屏障的缺点。
9.由于通过皮肤传递药物具有使用便利性，因此，以多种形态应用于各种领域中。这
种通过皮肤的药物，主要是为了通过皮肤传递至体循环体系(systemic circulation)，而除此之外，也有特应症治疗剂、美白或皱纹改善用化妆品等药物是以传递至皮肤本身的器官为目的使用的。尽管具有这种便利性以及功能性，但由于皮肤的结构，将药物通过皮肤传递存在各种困难，因此，不容易开发出能够通过皮肤的药物。皮肤的角质层由砖块(brick)结构和灰浆(mortar)结构组成，所述砖块(brick)结构是由角蛋白丰富的角质细胞所组成；所述灰浆(mortar)结构是由神经酰胺(ceramide)、脂肪酸(fatty acid)或蜡(wax)等脂质将这种角质细胞之间填充的结构。这种结构起着屏障的作用，具有物质透过性非常低的特性。只有500da以下的低分子结构成分才能够通过扩散方式传递至皮肤内，且只有脂质亲和性优秀的物质才能够通过皮肤。
10.由于这种皮肤结构上的特性，对脂质亲和性低的肽而言，为了提高其脂质亲和性，正尝试着通过引入一定长度的烷基链以提高皮肤内吸收。
11.然而，此时肽的分子量增大，从而存在着实质上难以提高皮肤内吸收的问题。
12.因此，本发明人开始着手研究能够将起到改善皮肤效果的各种的肽、蛋白质成分传递至皮肤内，并能够提升效果的方案。


技术实现要素：

13.发明所要解决的问题
14.鉴于上述情况，本发明要解决的课题是，提供一种能够将用于改善皮肤状态的多种蛋白质成分、尤其是将生长因子稳定地传递至皮肤内的蛋白质给药系统、制造该系统的方法以及利用该系统向皮肤内传递蛋白质(尤其是生长因子)的方法。
15.并且，在提升肽的脂质亲和度的同时，解决以往因分子量大而难以透过皮肤的、肽的透皮传递问题。
16.另外，提供一种能够将用于改善皮肤状态的多种肽传递至皮肤内的肽给药系统、制造该系统的方法、以及利用该系统向皮肤内传递脂质亲和度低的肽的方法。
17.解决问题的技术方案
18.为了解决上述课题，本发明提供一种含有蛋白质或肽的微针，更优选地，形成上述微针的物质在皮肤内溶解，因此，将上述微针使用于皮肤时，通过微针的溶解或崩解，能够将肽稳定地传递至皮肤。
19.本发明人对各种给药系统进行了研究，然而，如上所述地在任何一种系统中，实现在提升脂质亲和度低的肽的脂质亲和度的同时，即使分子量增加也能够稳定地透过皮肤的肽传递系统并非容易。本发明人经过多方努力，惊奇地发现通过将n-端具有烷基链的肽或肽衍生物含入皮肤内可溶性(soluble)微针中，能够将其有效地传递至皮肤内，从而完成了本发明。
20.多肽作为多个氨基酸的连接体，是指互不相同的氨基酸通过一种称作肽键的化学键被长长地连接在一起的情形，上述多肽也被简称为肽。
21.为了达成上述课题，微针在皮肤内需呈现可溶性，并且，为了形成可溶性微针，可以使用透明质酸(hyaluronic acid)、羧甲基纤维素钠(na-cmc，sodium carboxymethyl cellulose)、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)以及聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)等水溶性高分子；木糖(xylose)、蔗糖(sucrose)、
麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)等糖类；或它们的混合物。尤其是，综合考虑微针的皮肤透过强度，以及在皮肤内的溶解速度等，优选使用寡透明质酸(oligo-hyaluronic acid)、羧甲基纤维素钠(na-cmc，sodium carboxymethyl cellulose)以及糖类(saccharide)(更优选为海藻糖(trehalose))的混合物，更优选还混合有下述的甘油(glycerine)。优选地，本发明的微针除含有形成微针的上述成分之外，还可以包含增塑剂、表面活性剂、防腐剂、抗炎剂等。
22.作为上述增塑剂(plasticizer)，例如，可以单独或混合使用乙二醇(ethylene glycol)、丙二醇(propylene glycol)、二丙二醇(dipropylene glycol)、丁二醇(butylene glycol)、甘油(glycerine)等多元醇。
23.优选地，在本发明的微针中，肽的含量相对于微针制造溶液的总重量为0.01～20重量％，更优选为0.1～5重量％。
24.可在本发明中使用的肽，可以是由3～10个氨基酸组成的肽，优选地，可以是在上述氨基酸的n-端具有碳原子数为10～20的烷基的肽。利用凝胶渗透色谱法测得的上述肽的分子量可以为200～3000da。
25.优选地，上述肽可以是选自于由三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、棕榈酰三肽(palmitoyl tripeptide)、肉豆蔻酰四肽(myristoyl tetrapeptide)、己酰基四肽(caprooyl tetrapeptide)、肉豆蔻酰五肽(myristoyl pentapeptide)、棕榈酰五肽(palmitoyl pentapeptide)、肉豆蔻酰六肽(myristoyl hexapeptide)、棕榈酰六肽(palmitoyl hexapeptide)、棕榈酰七肽(palmitoyl heptapeptide)或它们的混合物所组成的组中的任意一种。
26.例如，上述棕榈酰三肽可优选为棕榈酰三肽-5(pal-lys-val-lys-oh)，肉豆蔻酰四肽可以是肉豆蔻酰四肽-12(myr-lys-ala-lys-ala-nh2)，己酰基四肽可以是己酰基四肽-3(cap-lys-gly-his-lys)，肉豆蔻酰五肽可以是肉豆蔻酰五肽-17(myr-lys-leu-ala-lys-lys-nh2)，棕榈酰五肽可以是棕榈酰五肽-4(pal-lys-thr-thr-lys-ser-oh)，肉豆蔻酰六肽可以是肉豆蔻酰六肽-16(myr-ala-asp-leu-lys-pro-thr)，棕榈酰六肽可以是棕榈酰六肽-12(pal-val-gly-val-ala-pro-gly)，棕榈酰七肽可以是棕榈酰七肽-18(pal-tyr-pro-trp-gln-arg-phe)。
27.另外，本发明提供一种肽给药用(传递用)的微针贴剂(patch)系统，该系统附着有上述微针。
28.另外，本发明提供一种含有肽或肽衍生物的微针的制造方法，该方法包括：制造包含上述肽和皮肤内可溶性物质的溶液的步骤s1；将上述溶液注入微针模具的步骤s2；以及，干燥并将微针从上述模具中分离的步骤s3。
29.优选地，上述微针可包含分子量为200～3000da的肽或肽衍生物。另外，本发明提供一种肽的皮肤透过率得以提高的肽的透皮给药方法，其特征在于，利用了本发明的微针。
30.另外，本发明提供含有大分子量肽的微针在皱纹改善中的用途。
31.根据本发明的又一个实施例，提供一种包含含有蛋白质或肽的微粒的微针，更优选地，形成微针的物质在皮肤内发生溶解，当在皮肤上使用微针时，通过微针的溶解或崩解，包含在微针内部的微粒能够迅速地扩散至皮肤内。
32.包含在内部的微粒含有形成疏水性核的高分子，因此能够将蛋白质或肽稳定地传
递至皮肤。
33.本文中所使用的“蛋白质或肽”，并非必须区分而使用，而是以包括氨基酸聚合物的广义使用。
34.众所周知，通常情况下，蛋白质是指分子量大于肽的氨基酸聚合物，而氨基酸的聚合数目为50以下时则称作肽。但在本文中，并非必须以氨基酸的聚合数目来限定并做解释。
35.本发明人对各种给药系统进行了研究，并经过多方努力，惊奇地发现通过将包含蛋白质的微粒浸渍在可溶性(soluble)微针中，能够将蛋白质或肽有效地传递至皮肤内，从而完成了本发明。将封装有蛋白质的微粒浸渍在可溶性微针中，并使用于皮肤时，通过微针能够使蛋白质无痛透过至皮肤内，并且，由于微针因皮肤内的水分发生溶解，封装有蛋白质成分的微粒能够传递至皮肤内。
36.本文中使用的“封装有蛋白质的微粒”，表示蛋白质位于微粒内部的状态，并表示蛋白质被微粒完全包围的状态。例如，封装有蛋白质的微粒的截面，可具有如本说明书的图6所示的形态，但其仅为示例。
[0037]“浸渍”表示被包含的状态，其不仅包括位于微针内部并与外部环境完全隔绝的状态，还可以包括微粒的一部分暴露在微针表面的状态。“包合”和“浸渍”在本文中能够以相同的含义使用。“浸渍在微针中”不仅可理解为完全包含在微针内部的情况，还可以理解为，以在皮肤上使用微针时，微针和微粒能够一同被传递的形式包含在微针中的所有形态的集合。
[0038]
由传递至皮肤内的微粒释放出蛋白质成分，尤其是释放出生长因子，因此，能够有效地传递至皮肤内。本文中使用的生长因子可以包含生长激素。
[0039]
为了达成上述课题，微针在皮肤内需呈现可溶性，并且，为了形成可溶性微针，可以使用透明质酸(hyaluronic acid)、羧甲基纤维素钠(na-cmc，sodium carboxymethyl cellulose)、乙烯基吡咯烷酮-醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)等水溶性高分子；木糖(xylose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)等糖类；或它们的混合物。尤其是，综合考虑微针的皮肤透过强度，以及在皮肤内的溶解速度等，优选使用寡透明质酸(oligo-hyaluronic acid)、羧甲基纤维素钠(na-cmc，sodium carboxymethyl cellulose)和糖类(saccharide)(更优选为海藻糖(trehalose))的混合物，更优选还混合有下述的甘油(glycerine)。优选地，本发明的微针除了包含含有蛋白质、尤其是含有生长因子的微粒和形成微针的上述成分之外，还可以包含增塑剂、表面活性剂、防腐剂、抗炎剂等。其中，上述增塑剂、表面活性剂、防腐剂、抗炎剂等，不仅可以使用本文中所记载的成分，而且，本领域中通常使用的所有成分均可以使用。
[0040]
在本发明中，与上述蛋白质一同形成微粒的物质，必需是在微针的制造过程中，不会引发蛋白质的结构变形，并能够稳定地包合的物质。尤其是，形成上述微粒的物质，需能够形成疏水性核，以在蛋白质无结构变形的情况下能够稳定地提供该蛋白质。
[0041]
作为形成这种微粒的物质，可以使用能够形成疏水性核的高分子，作为缓释高分子，可以单独或混合使用聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-co-乙胶酯)、聚酸酐(polyanhydride)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚醚酯、聚己内酯、甲氧基聚乙二醇-b-聚己内酯(mpeg-pcl)、聚酰胺酯、聚丁酸、聚戊酸、聚氨基甲酸酯或它们的共聚物等的生物降
解高分子；以及，聚丙烯酸酯、乙烯-醋酸乙烯聚合物、丙烯酸取代醋酸纤维素、非降解聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基咪唑、氯磺化聚烯烃(chlorosulphonate polyolefins)、聚氧化乙烯或它们的共聚物等的非生物降解高分子，但本发明并不受限于此。
[0042]
当综合考虑蛋白质、尤其是生长因子的稳定性以及在皮肤内的释放性等时，作为上述形成疏水性核的高分子，可优选使用聚丙交酯、聚乙交酯和聚(丙交酯-co-乙胶酯)中的任意一种以上与甲氧基聚乙二醇-b-聚己内酯(mpeg-pcl)的混合物。
[0043]
这种微粒在能够达成本发明目的的范围内，可以是骨架(matrix)型，也可以是膜控(reservoir)型。
[0044]
可在本发明中使用的微粒，能够通过本发明所属领域中公知的各种方法制成。例如，可以利用溶剂交换法(solvent exchange method)、溶剂蒸发法(solvent evaporation method)、膜透析法(membrane dialysis method)、喷雾干燥法(spray drying method)等制成本发明中可以使用的微粒。例如，可以利用文献journal of controlled release,70,1-20,2001以及international journal of pharmtech research,3,1242-1254,2011中记载的方法。优选可以通过普通的乳化和溶剂蒸发(emulsification and solvent evaporation)方法制成。
[0045]
优选地，本发明的微粒直径为0.01～10μm。如果粒子的大小超过10μm，则在浸渍到微针时，针的强度减弱，从而难以穿透皮肤。本发明微粒的直径，是通过激光散射(lls)方法测得，例如，利用马尔文(malvern)公司的zetasizer2000
tm
测得。
[0046]
优选地，在本发明的微粒中，蛋白质或肽的含量相对于微粒的总重量为0.01～20重量％，更优选为0.1～5重量％。另外，在本发明的微针中，这种微粒的含量相对于微针的总重量优选为0.05～10重量％，更优选为0.1～5重量％。
[0047]
可在本发明中使用的蛋白质，特别优选为生长因子(growth factor)或生长激素。上述生长因子或生长激素是参与细胞的生长、增殖和分化的蛋白质，尤其是考虑到与选择性的组织或脏器的匹配性，以及在传递过程中引发的蛋白质结构的改性等，需要准备合适的传递体或传递方法。本发明通过大量的研究结果确认，在蛋白质中，特别是生长因子(growth factor)和/或生长激素(human growth hormone)的传递过程中，将微粒使用于微针中，对生长因子及生长激素的传递有效。
[0048]
上述生长因子，可以是选自于由骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，bmp)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)、神经生长因子(nerve growth factor，ngf)、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)、胰岛素样生长因子(insulinlike growth factor，igf)、转化生长因子(trans-forming growth factor-αand-β，tgf-α，-β)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)、血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，pdgf)、胎盘生长因子(placental growth factor，plgf)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor 1 and 2，fgf-1，-2)、角质化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)及其类似物所组成的组中的任意一种以上。
[0049]
本文中使用的类似物，可包括与上述蛋白质具有80％序列同源性的情形，优选为
具有85％序列同源性的蛋白质类似物，更优选为具有90％序列同源性的蛋白质类似物。
[0050]
另外，本发明提供一种蛋白质给药用(传递用)的微针贴剂(patch)系统，该系统附着有上述微针。优选地，本发明的一个实施例中提供一种蛋白质或肽在化妆学上的透皮给药方法。
[0051]
本发明提供一种含有肽或蛋白质的微针的制造方法，该方法包括：制造包含上述肽或蛋白质以及皮肤内可溶性物质的溶液的步骤s1；将上述溶液注入微针模具的步骤s2；以及，干燥并将微针从上述模具分离的步骤s3，其中，上述步骤s1还包括将肽或蛋白质封装至微粒内的步骤，上述将肽或蛋白质封装至微粒内的步骤中，利用形成疏水性核的高分子将肽或蛋白质含入微粒内部，从而改善了蛋白质结构的不稳定性或蛋白质的聚集(aggregation)。
[0052]
另外，本发明提供一种皮肤透过量高且稳定性优秀的蛋白质的透皮给药方法，其特征在于，利用了本发明的微针。
[0053]
另外，本发明提供一种微针在皱纹改善中的用途，其中，所述微针包含含有蛋白质，优选含有生长因子或生长激素，更优选含有egf、tgf-β或hgh的微粒。
[0054]
根据本发明的一个实施例，提供一种将包含分子量为200～3000da的肽的微针贴在皮肤上，从而将肽注入皮肤的方法。
[0055]
根据本发明的一个实施例，提供包含分子量为200～3000da的肽的微针在皮肤皱纹改善中的用途。
[0056]
根据本发明的一个实施例，提供一种将包含封装有生长因子的微粒的微针贴在皮肤上，从而将上述生长因子注入皮肤的方法。
[0057]
根据本发明的一个实施例，提供包含封装有生长因子的微粒的微针在皮肤皱纹改善中的用途。
[0058]
发明效果
[0059]
根据本发明，提供一种提升了分子量大的肽的皮肤透过率的微针。
[0060]
另外，根据本发明，提供一种含有皮肤透过率得以提升的肽的透皮给药用的微针。另外，本发明还提供以利用这种微针为特征的、肽的透皮给药方法。
[0061]
根据本发明，提供一种确保了蛋白质、尤其是生长因子的稳定性、且皮肤透过量得以提升的蛋白质透皮给药用的微针。另外，本发明提供一种不会引发蛋白质结构的变形，使其能够稳定地传递至皮肤的透皮给药用的微针。
[0062]
根据本发明，提供一种在含入普通化妆材料剂型时不会发生蛋白质之间的聚集，并能够稳定地将蛋白质传递至皮肤内的蛋白质透皮传递系统。
[0063]
另外，根据本发明，提供一种以利用这种微针为特征的生长因子的透皮给药方法。
附图说明
[0064]
本说明书所附的以下附图，用于举例说明本发明的优选实施例，并与前述的发明内容一同用于更加深刻地理解本发明的技术思想，因此，不应该仅局限于附图中所公开的内容解释本发明。
[0065]
图1是表示本发明的制造微针的各种方法中一个示例的图。可通过溶液铸膜法(solution casting)制造可溶性微针，可将溶液浇注(casting)到模具(mold)中，利用真空
和/或离心分离(centrifuge)向微小的模具(mold)填充溶液后干燥而制成。作为形成微针结构体的材料(material)，可以使用普通的合成水溶性高分子和天然水溶性高分子。
[0066]
图2是用于评价本发明微针的药物释放行为的franz扩散池(franz diffusion cell)。
[0067]
图3是表示利用装有猪皮肤的franz扩散池对微针的egf释放进行评价的评价结果的图表。
[0068]
图4是表示将本发明的浸渍有egf溶液的微针(egf微针)和浸渍egf微粒的微针(egf-mp微针)长期使用于眼角皱纹后所表现出的皱纹改善程度的实验结果。
[0069]
图5是表示egf稳定性分析(sec，size exclusion chromatography，体积排阻色谱法)实施结果的图表。其中，图5a表示egf标准物质的sec数据，图5b表示由微针释放出的egf的sec数据。
[0070]
图6是示例性示出微粒形态的示意图。
[0071]
图7是表示利用装有猪皮肤的franz扩散池对微针的肽释放进行评价的评价结果的图表。
[0072]
图8是表示将本发明的浸渍有肽溶液的微针(肽微针)以及浸渍有肽的微针(肽微针)长期使用于眼角皱纹后所表现出的皱纹改善程度的实验结果。
具体实施方式
[0073]
为了有助于理解本发明，下面将举出实施例详细说明。但是，可对本发明的实施例进行各种变形，本发明的范围并非限定于下述实施例。本发明的实施例，是为了向本领域的普通技术人员更加完整地说明本发明而提供的。
[0074]
＜制造载蛋白微粒＞
[0075]
首先，将1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶于10ml的二氯甲烷(methylene chloride)中。将200mg多肽(表皮生长因子，egf)溶于2ml纯净水中的溶液缓缓地添加至plga溶液中，制造了第一次w/o乳液。向0.2％聚乙烯醇水溶液(100ml)中边搅拌边添加了第一次制造的w/o乳液。将如此制造的w/o/w双重乳液在室温中搅拌24个小时，使作为有机溶剂的二氯甲烷蒸发，制造了装有egf的微粒。利用旋转蒸发器将残留的二氯甲烷完全去除，并使水分与有机溶剂一同将蒸发，浓缩至egf含量达到总量的0.2％。利用elisa试剂盒分析的结果，egf含量为0.21％，利用粒度分析仪(particle size analyzer)分析的结果，微粒的平均大小为350nm。
[0076]
＜制造egf载微粒微针＞
[0077]
如下表1，制造了egf(以溶液形态添加)或浸渍有egf的可溶性微针。下述表1的含量以重量％表示。
[0078]
表1
[0079][0080]
具体而言，如下所述地制造了浸渍有egf的可溶性微针。将oligo-ha(寡透明质酸)、na-cmc(羧甲基纤维素钠)以及海藻糖溶解到纯净水中，并添加甘油、hco-40以及egf制造了egf溶液。将所制造的egf溶液浇注到硅胶微针模具(silicone microneedle mold)，在3000rpm下离心分离(centrifugation)10分钟，向微小模具填充了溶液。填充溶液后将其放入干燥烘箱(70℃)中干燥3个小时，最后，利用粘着膜将微针从硅胶模具(silicone mold)中分离出来。
[0081]
具体而言，如下所述地制造了浸渍有egf微粒(egf-mp)的可溶性微针。将oligo-ha(寡透明质酸)、na-cmc(羧甲基纤维素钠)以及海藻糖溶解在纯净水中，并添加甘油、hco-40以及egf微粒(egf 0.2％)制造了溶液。将所制造的溶液浇注(casting)到硅胶微针模具后，在3000rpm下离心分离10分钟，向微小模具填充了溶液。填充溶液后将其放入干燥烘箱(70℃)中干燥3个小时，利用粘着膜将微针从硅胶模具中分离出来。
[0082]
＜egf水包油剂型(oil-in-water)乳霜＞
[0083]
为了对比浸渍在微针中的egf的皮肤透过量，在比较例中，将egf浸渍在普通的水包油剂型乳霜中进行了比较。下述含量以重量％表示。
[0084]
表2
[0085][0086]
＜药物释放行为＞
[0087]
利用装有猪皮肤的franz扩散池，评价了上面制造的微针的egf释放(参照图2)。作为受体溶液(acceptor solution)，使用了含有30重量％dpg的pbs溶液。利用franz扩散池，并利用elisa试剂盒随时间测量了猪皮肤组织以及受体溶液中egf的含量。向猪皮肤涂抹egf乳霜，或贴上浸渍有egf或egf-mp的微针，对比了随时间的肽的皮肤透过量。使微针浸透到猪皮肤内发生溶解后(贴附时间：2小时、温度：32℃)，摘除了微针。并将通过微针吸收了egf的猪皮肤放入franz扩散池中，确认了egf随时间从猪皮肤释放至受体溶液的行为，将其结果示于图3。
[0088]
如图3所示，浸渍在微针中的egf和egf-mp，是通过微针直接穿透皮肤，其透过量为1μg以上，与乳霜相比，表现出了约500倍以上的皮肤透过量。
[0089]
＜皱纹改善效果＞
[0090]
将egf乳霜、浸渍有egf和egf-mp的微针每天使用于眼角皱纹处，经过12周后，通过硅胶副本(silicone replica)以及皱纹图像分析方法确认了皱纹改善情况(n＝20)，将其结果示于图4。与egf乳霜相比，浸渍有egf的微针表现出了优秀的改善效果，尤其是，浸渍有egf-mp的微针表现出了突出的皱纹改善效果。这是egf通过浸渍有egf-mp的微针(mn)有效传递至皮肤带来的效果，并且，egf以稳定的结构从传递至皮肤内的egf-mp中释放出来，从而使得皱纹改善效果突出。
[0091]
＜egf稳定性分析(sec)＞
[0092]
利用sec(体积排阻色谱法)确认了浸渍在微针中的egf被释放时，egf的结构是否有改性。
[0093]
当将egf本身浸渍在微针中并传递至皮肤时，egf结构发生聚集而导致变形，聚集峰(aggregation peak)相对增加，而将其稳定地封装到微粒并浸渍到微针时，传递至皮肤
之后也不会发生聚集，表现出其结构与标准物质类似的结果。
[0094]
由此可知，当egf等多肽或蛋白质的情况下，将其稳定地封装的微粒浸渍到微针中并传递至皮肤时，能够高效地透皮传递的同时，能够以稳定的结构被传递至皮肤。
[0095]
＜制造肽微针＞
[0096]
如下表3，制造了肽(以溶液形态添加)或浸渍有肽的可溶性微针。下述表3的含量以重量％表示。
[0097]
表3
[0098][0099]
具体而言，如下所述地制造了浸渍有肽(肉豆蔻酰四肽-6)的可溶性微针。
[0100]
将oligo-ha(寡透明质酸)、na-cmc(羧甲基纤维素钠)以及海藻糖溶解在纯净水中，并添加甘油、hco-40以及肽溶液(肽10％，dpg 90％)制造了分散有肽的溶液(dpg：二丙二醇)。将所制造的肽分散溶液浇注到硅胶微针模具后，在3000rpm下离心分离10分钟，向微小模具填充了溶液。填充溶液后将其放入干燥烘箱(70℃)中干燥3个小时，最后，利用粘着膜将微针从硅胶模具中分离了出来。
[0101]
＜肽的水包油剂型(oil-in-water)乳霜＞
[0102]
为了对比浸渍在微针中的肽的皮肤透过量，在比较例，将肽浸渍在普通的水包油剂型乳霜中进行了比较。下述含量以重量％表示。
[0103]
表4
[0104][0105]
＜药物释放行为＞
[0106]
利用装有猪皮肤的franz扩散池，对上面制造的微针所释放的肽的随时间皮肤透过量进行了比较(参照图2)。受体溶液(acceptor solution)使用了含有30重量％dpg的pbs溶液。
[0107]
即，利用franz扩散池，并利用液相色谱法随时间测量了猪皮肤组织以及受体溶液中肽的含量。
[0108]
向猪皮肤涂抹肽乳霜、或贴上浸渍有肽的微针，对比了随时间的肽的皮肤透过量。使微针浸透到猪皮肤内发生溶解后(贴附时间：2小时；温度：32℃)，摘除了微针。并将通过微针吸收了肽的猪皮肤放入franz扩散池中，确认了肽随时间从猪皮肤释放至受体溶液的行为，将其结果示于图7。
[0109]
如图7所示，含有肽的乳霜的皮肤透过量约为0.1μg，微乎其微，而浸渍在微针中的肽是通过微针直接穿透皮肤，其透过量为15μg以上，与乳霜相比，表现出了约100倍以上的皮肤透过量。
[0110]
＜皱纹改善效果＞
[0111]
将肽乳霜以及浸渍有肽的微针每天使用于眼角皱纹处，经过12周后，通过硅胶复制物(silicone replica)以及皱纹图像分析方法，确认了皱纹改善程度(n＝20)。
[0112]
与肽乳霜相比，浸渍有肽的微针表现出了5倍以上优秀的改善效果，经确认，这是因为肽通过微针有效地浸透至皮肤内，从而使皱纹改善效果突出。
[0113]
工业实用性
[0114]
本发明能够应用于改善皮肤皱纹用的化妆品、药学的用途中。
[0115]
本发明的微针能够带来优秀的减少皮肤皱纹的效果。