检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条、检测卡、试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医学工程技术领域 ，尤其是涉及一种检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条、试纸条的制备方法，及应用其的检测卡和试剂盒。


背景技术：

2.人类腺病毒 (hadv) 是无包膜的双链 dna 病毒，分为七个物种 (a-g)。迄今为止，根据基因组序列已经识别了大约 100种类型。
3.腺病毒的衣壳为二十面体结构，由240个六邻体（hexon)、12个五邻体（penton)以及12根纤维蛋白（fiber)构成，除此之外还有其他一些小蛋白，如vi、viii、ix、iiia和iva2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区（knob）。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。
4.hadv 是具有多种组织趋向性的高度传染性病原体，根据感染类型可引起多种疾病，如急性呼吸道疾病 (ard)、胃肠炎、膀胱炎、角膜结膜炎、心脏炎、脑膜脑炎。hadv 感染的易感人群包括婴儿、免疫功能低下的患者。
5.腺病毒经过工程改造，可通过删除某些基因组序列，使其安全，高效地用作疫苗，基因和癌症治疗载体，以供人类使用。最初，人类腺病毒，特别是人腺病毒5（had5）被广泛开发为基因传递载体。在新型冠状病毒爆发后，国内外立即启动了基于腺病毒载体的疫苗研发，其中国内基于人ad5和ad35的新冠疫苗已经上市或处于临床前阶段（一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗）。由于这些腺病毒在人群中广泛传播，因此，在接受had5和had35相关治疗时，快速筛查这些类型的预先存在的中和抗体水平非常重要。目前已上市的检测腺病毒中和抗体检测试剂盒都是elisa方法，操作复杂、耗时长而且不分型，容易造成假阳性。研究发现人体产生的had5中和抗体绝大部分识别hexon和fiber结构域，三聚体形式的fiberknob可用于区分人血清型腺病毒为ad2、ad3、ad5、 ad6、ad37、ad4 或 ad41的中和抗体水平(一种分型检测腺病毒中和抗体的方法以及用于分型检测腺病毒中和抗体的试剂盒)。利用hexon和fiber检测had5中和抗体是非常理想的抗原，但目前还缺乏had5中和抗体的快速评价方法和检测试剂盒。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条、检测卡及试剂盒，以解决现有的检测操作复杂、耗时长，容易造成假阳性的问题；本发明的目的之二在于提供一种检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条的制备方法，以提高检测的灵敏度和特异性。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条，包括pvc底板，及设置于pvc底板上方依次排列的样品垫、荧光垫、层析膜及吸水垫；所述的层析膜是由一条检测线和一条质控线组成的固相硝酸纤维素膜，所述的检测线上包被有鼠抗人igg抗体，所述的质控线上包被有羊抗兔igg抗体，所述的荧光垫上包被有量子点标记的兔igg和量子点标记的抗原；所述的量子点标记的抗原为量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒中的任意一种或两种。
8.其中，所述的人5型腺病毒fiber knob蛋白包括seq id no.1氨基酸序列和seq id no.2核酸序列。
9.优选的，将量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒和量子点标记的兔igg均匀喷涂于荧光垫基材上后形成荧光垫，所述的荧光垫基材为玻璃纤维；喷量为4～6μl/cm，喷的条数为1-5条。
10.优选的，所述的层析膜粘结在pvc底板上，所述的吸水垫一侧粘贴在层析膜一侧，粘贴重叠部分为1～2mm，吸水垫的另一侧粘结在pvc底板上；所述的荧光垫粘贴在层析膜的另一侧，粘贴重叠部分为1～2mm，荧光垫的另一侧粘结在pvc底板上；所述的样品垫一侧粘贴荧光垫上，粘贴重叠部分为1～2mm，样品垫的另一侧粘结在pvc底板上。
11.本发明还公开了一种检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条的制备方法，包括以下过程：a. 制备荧光垫分别制备量子点标记的兔igg和量子点标记的抗原；然后再混合喷涂于荧光垫基材上得到荧光垫；所述的量子点标记的抗原为量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒中的任意一种或两种。
12.b. 制备层析膜将鼠抗人igg和羊抗兔igg分别稀释后，利用划膜仪划线到硝酸纤维素膜上，形成具有检测线和质控线的层析膜。
13.c. 制备试纸将样品垫、荧光垫、层析膜、吸水垫依次粘贴于pvc底板上得到所述试纸条。
14.进一步的，量子点标记的方法包括以下步骤：s1.量子点活化和耦联取量子点悬液，分散于反应缓冲液中，混匀；加入偶联剂edc，室温混匀孵育20～40分钟，10000～15000rpm离心，去上清后，将量子点分散在反应缓冲液中，超声分散均匀。
15.s2.标记反应将人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg，各自分散在反应缓冲液中，将活化的量子点迅速加入反应，混匀，室温孵育20～40分钟。
16.s3.后处理在8000～10000rpm离心5～10分钟，去除游离的蛋白；加入封闭液，超声分散，室温封闭1.5～2h，然后再在8000～10000rpm离心5～15分钟，去上清后，用量子点保存液重悬量子点。
17.其中，人5型腺病毒完整灭活病毒的制备方法为：采用293细胞扩增复制缺陷型的ad5病毒，通过cscl密度梯度离心方法分离得到完整病毒，然后放置于56℃中灭活1小时。
18.其中，所述的人5型腺病毒fiber knob蛋白采用体外表达，可形成三聚体，体外表达在大肠杆菌中表达，表达后，通过镍柱亲和纯化。
19.优选的，设置量子点的激发波长为365-450 nm，发射波长为620nm，量子点微球的粒径为80-200nm，且表面具有羧基官能团；在标记反应步骤中，将量子点微球上的羧基与所述人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg连接。
20.优选的，人5型腺病毒fiber knob蛋白与量子点微球的质量比例为（1～1.5）：10；人5型腺病毒完整灭活病毒与量子点微球的质量比例为（1～1.5）：10。
21.其中，所述的步骤s2中，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液，反应缓冲液ph为6.0-7.5。
22.其中，将量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒和量子点标记的兔igg按照体积比为（0.1-5μl）：（0.1-5μl）：（1-3μl），进行混合，再用量子点保存液稀释至25 ul，均匀喷涂于荧光垫基材上得到荧光垫。
23.进一步的，所述的量子点保存液包括以下质量分数的组分：海藻糖5～40%，牛血清白蛋白0.5～1.5%，牛莎pc-300抑菌剂0.02～0.1%，余量tris-hcl缓冲液，所述的tris-hcl缓冲液的浓度为20mm～200mm，量子点保存液的ph为7.2～8.3。
24.优选的，首先将荧光垫基材采用预处理液进行预处理，然后再进行喷涂；所述的预处理液包括以下质量分数的组分：海藻糖1～3%，牛血清白蛋白0.5～1.5%，余量tris-hcl缓冲液，所述的tris-hcl缓冲液的浓度为20mm～200mm，预处理液的ph为7.2～8.3。
25.优选的，过程b中，所述的层析膜上鼠抗人igg抗体采用包被液稀释，包被浓度为0.5-2.0 mg/ml；羊抗兔igg抗体采用包被液稀释，包被浓度为0.5-2.0 mg/ml，稀释后分别吸入划膜仪，将其划到硝酸纤维素膜上。
26.其中，所述的包被液为含有质量分数为1～3%蔗糖的磷酸盐缓冲液。
27.其中，过程c中将样品垫基材采用样品垫预处理液进行预处理后得到样品垫；所述的样品垫预处理液包括以下质量分数的组分：pvp40 0.2～1%，酪蛋白钠 0.5～1.5%，表面活性剂s9 0.1～1%，余量tris-hcl缓冲液，所述的tris-hcl缓冲液的浓度为50mm～250mm，样品垫预处理液的ph为7.2～8.3。
28.本发明还公开了一种检测人5型腺病毒中和抗体的检测卡，包括外壳及包装在外壳内部的上述的检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条，所述的外壳上设有加样孔和观察窗，所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的观察窗用于观测检测线和质控线。
29.本发明还公开了一种检测人5型腺病毒中和抗体的试剂盒，包括上述的检测人5型腺病毒中和抗体的检测卡，设置半抑制稀释度nt50＜1000为中和抗体阴性样本，nt50≥1000为中和抗体阳性样本。
30.由于采用了上述方案，本发明具有以下有益效果：1、本发明可用于快速评价人群中5型腺病毒中和抗体水平，为腺病毒载体治疗方法等提供指导。
31.2、本发明在荧光垫上包被有量子点标记的兔igg和量子点标记的抗原，量子点是一种电子能力在三个维度上都是量子化的半导体材料。由于量子点的量子限域效应，使其具有激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄而对称，颜色可调，稳定性高，荧光寿命长、受外界
干扰小等优越的荧光特性。此外，量子点还具有抗化学降解、生物相容性好等特性。由于其具有的诸多优异荧光性能而使其成为有机荧光材料的理想替代品。量子点免疫层析技术利用量子点荧光探针做为标记物，除具备免疫层析技术所具有的操作简便（浸入液体即可）、快速（所有反应能在15分钟内完成）、试剂稳定、成品易于保存（试剂效期可达两年或更长时间）等优点外，量子点本身的光学特性和稳定性大大扩展了标记范围和多检测指标标记同时应用的可行性，并显著提高检测的灵敏度。
32.3、人5型腺病毒fiber knob蛋白采用体外表达，可形成三聚体，三聚体形式的fiberknob可用于区分人血清型腺病毒为ad2、ad3、ad5、 ad6、ad37、ad4 或 ad41的中和抗体水平，从而使本发明制得的试纸条能客观反应总的中和抗体水平。
33.4、本发明试剂盒的灵敏度为98.86%，特异性为96.07%，与微量中和试验结果总符合率为97.36%，有效提高了灵敏度和特异性。
附图说明
34.图1是本发明试纸条的结构示意图。
35.图2是本发明检测卡的结构示意图主要组件符号说明：1：样品垫，2：荧光垫，3：检测线，4：质控线，5：层析膜，6：吸水垫，7：pvc底板，8：外壳，9：加样孔，10：观察窗。
具体实施方式
36.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
37.实施例一如图1所示，本实施例公开了检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条。
38.检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条包括pvc底板7，及设置于pvc底板7上方依次排列的样品垫1、荧光垫2、层析膜5及吸水垫6。
39.层析膜5是由一条检测线3和一条质控线4组成的固相硝酸纤维素膜。检测线3上包被有鼠抗人igg抗体。质控线4上包被有羊抗兔igg抗体。荧光垫2上包被有量子点标记的兔igg和量子点标记的抗原。量子点标记的抗原为量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒中的任意一种或两种。
40.人5型腺病毒fiber knob蛋白包括seq id no.1氨基酸序列和seq id no.2核酸序列，详见序列表。
41.后文中将：人5型腺病毒fiber knob蛋白简写为：人ad5 fiberknob蛋白，人5型腺病毒完整灭活病毒简写为：人ad5完整灭活病毒。各层包被的物质如下表1所示。
42.表1 荧光垫和层析膜包被物质
从表1中可以看出，荧光垫上可以单独包被量子点标记的人ad5 fiberknob蛋白（实施例
①
）和量子点标记的人ad5完整灭活病毒（实施例
②
），也可以二者混合包被（实施例
③
）。实验证明实施例
③
得到的试纸条阳性检出率高于实施例
①
和实施例
②
，也就是说混合包被能够提高检出率，效果更佳。
43.在较佳的实施例
③
中，将量子点标记的人ad5 fiberknob蛋白、量子点标记的人ad5完整灭活病毒和量子点标记的兔igg均匀喷涂于荧光垫基材上后形成荧光垫2，荧光垫基材选用玻璃纤维，喷量为4～6μl/cm，喷的条数为1-5条。
44.如图1所示，本实施例中试纸条组装步骤如下：（1）选取一pvc底板7，长度为78.5mm，宽度4mm。将层析膜5粘结在pvc底板7上，层析膜5位于pvc底板7中间位置。
45.（2）将吸水垫6的左侧粘贴在层析膜5的右侧，粘贴重叠部分为1～2mm，吸水垫6的右侧粘结在pvc底板7上。
46.（3）将荧光垫2的右侧粘贴在层析膜5的左侧，粘贴重叠部分为1～2mm，荧光垫2的左侧粘结在pvc底板7上。
47.（4）将样品垫1右侧粘贴荧光垫2的左侧上，粘贴重叠部分为1～2mm，样品垫1的左侧粘结在pvc底板7上。
48.实施例二如图2所示，本实施例公开了检测人5型腺病毒中和抗体的检测卡。
49.检测人5型腺病毒中和抗体的检测卡，包括外壳8及实施例一中的检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条。检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条包装于外壳8内。
50.外壳8可以选用塑料外壳，外壳8上设有加样孔9和观察窗10，塑料外壳8在观察窗处为透明或者直接开口，以用于观测检测线3和质控线4。加样孔9位于样品垫1的上方，便于加样至样品垫1上。
51.为了便于保存，将检测卡整体装入铝箔袋中，加入0.5g干燥剂，加热封口。
52.检测卡的使用方法为：将检测卡从铝箔袋取出后，平放在桌面上，取10ul待检样品（血清、血浆或全血）与70ul样品稀释液混匀，然后滴加到加样孔中，平放静置15分钟，放入检测仪读取t/c值。
53.实施例三本实施例公开了检测人5型腺病毒中和抗体的试剂盒，包括检测人5型腺病毒中和
抗体的检测卡，试剂盒内设置中和抗体阴性样本和中和抗体阳性样本。
54.中和抗体检测试剂盒最低检测限设定与病毒微量中和试验半抑制稀释度相关，即检测试剂盒最低检测限可以是病毒微量中和试验半抑制稀释度为500、1000、1500、2000等，病毒微量中和试验半抑制稀释度超过1000为高中和抗体滴度，会影响治疗效果。本发明中将半抑制稀释度nt50＜1000为中和抗体阴性样本，nt50≥1000为中和抗体阳性样本。
55.为了便于本发明的检测效果，进行以下实验：用人5型腺病毒微量中和试验测试190份人血浆样本的中和抗体水平，病毒微量中和检测为采用中和抗体阻断重组人5型腺病毒感染hek293细胞的方法，nt50为半抑制稀释滴度，量子点检测试剂为本发明的试剂盒，t为检测线，c为质控线。得到下表2。
56.表2人血浆样本had5中和抗体检测结果根据表2计算灵敏度、特异性和总符合率，计算过程如下：（1）灵敏度=b/(b d)*100%=98.86%（2）特异性=c/(a c) *100%=96.07%（3）总符合率=(b c)/(a b c d)*100%=97.36%通过上述实验可以确定本发明检测试剂盒的cut-off值为t/c=0.141时，试剂盒的灵敏度为98.86%，特异性为96.07%，与微量中和试验结果总符合率为97.36%，检测效果较佳。
57.实施例四本实施例公开了检测人5型腺病毒中和抗体的试纸条的制备方法，过程详述如下。
58.1、制备荧光垫：分别制备量子点标记的兔igg和量子点标记的抗原。然后再混合喷涂于荧光垫基材上得到荧光垫。本实施例中量子点标记的抗原为量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白和量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒。
59.（1）该过程首先制备两种抗原，两种抗原的制备过程如下。
60.①
.人5型腺病毒完整灭活病毒的制备方法为：采用trex-293细胞扩增ad5病毒，通过cscl密度梯度离心方法分离得到完整病毒，然后放置于56℃中灭活1小时。
61.②
.人5型腺病毒fiber knob蛋白采用体外表达，可形成三聚体，体外表达在大肠杆菌中表达，表达后，通过镍柱亲和纯化，制备步骤如下。
62.i)4000rpm离心10分钟收集已表达菌体。
63.ii)将得到的菌体用20 mlpbs液重悬，4000rpm离心10min，收集菌体后再次洗涤。
64.iii)离心，pbs洗涤2次后，用50ml破碎液重悬，利用细胞破碎仪破碎，10000rpm离心30分钟收集上清液。
65.iv)将上清液加入平衡良好的镍柱中（镍柱平衡3倍的柱体积的ddh2o 和 3 倍的柱体积的平衡缓冲液，与镍填料充分混匀，室温孵育1小时。
66.v)转移至重力柱。
67.vi)分别用10倍柱体积的20mm、40mm、100mm咪唑浓度洗涤。
68.vii)用含有200mm咪唑的洗脱液洗脱蛋白。
69.viii)用3倍柱体积的500mm咪唑溶液洗涤，再用3倍柱体积的ddh2o洗涤和3倍柱体积的20%乙醇，最后将镍柱浸泡在乙醇中。
70.ix)将步骤vii洗脱下来的蛋白用10kda大小的超滤管浓缩，检测蛋白的浓度。
71.x)分别取5ug蛋白进行sds-page或nativepage。
72.（2）将兔igg和两种抗原进行量子点标记，步骤如下详述。
73.①
.量子点活化和耦联取量子点悬液100μl，分散于200μl反应缓冲液中，混匀；加入偶联剂edc（20mg/ml）6μl，室温混匀孵育30分钟，12000rpm离心10分钟，去上清后，将量子点分散在100ul反应缓冲液中，超声分散均匀。
74.②
.标记反应将人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg各100μg，各自分散在200μl反应缓冲液中，将活化的量子点迅速加入反应，混匀，室温孵育30分钟。反应缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph为6.0-7.5。
75.设置量子点的激发波长为365-450 nm，发射波长为620nm，量子点微球的粒径为80-200nm，且表面具有羧基官能团。本发明中，荧光免疫层析专用量子点微球的粒径为100nm
±
20nm。在标记反应步骤中，将量子点微球上的羧基与人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述人5型腺病毒fiber knob蛋白、人5型腺病毒完整灭活病毒或兔igg连接。
76.人5型腺病毒fiber knob蛋白与量子点微球的质量比例为（1～1.5）：10，如可以是1:10、1.1:10、1.2:10、1.3:10、1.4:10或1.5:10等。例如，相对于50μg的量子点微球，人5型腺病毒fiber knob蛋白的使用量为50～75μg。
77.人5型腺病毒完整灭活病毒与量子点微球的质量比例为（1～1.5）：10。如可以是1:10、1.1:10、1.2:10、1.3:10、1.4:10或1.5:10等。例如，相对于50μg的量子点微球，所述人ad5 完整灭活病毒蛋白的使用量为50～75μg。
78.③
.后处理在8000rpm离心5分钟，去除游离的蛋白。加入200μl封闭液，超声分散，室温封闭2h，然后再在8000rpm离心10分钟，去上清后，用100μl量子点保存液重悬量子点。
79.量子点保存液包括以下质量分数的组分：海藻糖5～40%，牛血清白蛋白（bsa）0.5～1.5%，牛莎pc-300抑菌剂0.02～0.1%，余量tris-hcl缓冲液， tris-hcl缓冲液的浓度为20mm～200mm。量子点保存液的ph为7.2～8.3。如下表3所示。
80.表3 量子点保存液组分
组分海藻糖bsa牛莎pc-300抑菌剂tris-hcl缓冲液（20mm～200mm）实施例
①
5%1.5%0.02�.48%实施例
②
20%1%0.04x.6%实施例
③
35%0.8%0.1d.1%
（3）混合喷涂将量子点标记的人5型腺病毒fiber knob蛋白、量子点标记的人5型腺病毒完整灭活病毒和量子点标记的兔igg按照体积比为1.5μl：1.5μl：2μl，进行混合，再用量子点保存
液稀释至25μl，均匀喷涂于荧光垫基材上得到荧光垫。将荧光垫放置于37℃烘干16-18小时，备用。
81.荧光垫基材采用预处理液进行预处理，然后再进行喷涂。预处理液包括以下质量分数的组分：海藻糖1～3%，牛血清白蛋白0.5～1.5%，余量tris-hcl缓冲液，所述的tris-hcl缓冲液的浓度为20mm～200mm，预处理液的ph为7.2～8.3。如下表4所示。
82.表4 荧光垫基材的预处理液组分组分海藻糖bsatris-hcl缓冲液（20mm～200mm）实施例
①
1%1.5�.5%实施例
②
2%1�%实施例
③
3%0.5�.5%2.制备层析膜将鼠抗人igg和羊抗兔igg分别稀释后，利用划膜仪划线到硝酸纤维素膜上，形成具有检测线和质控线的层析膜。
83.稀释时采用包被液稀释，包被液为含有质量分数为1～3%蔗糖的磷酸盐缓冲液，ph7.2。鼠抗人igg包被浓度为0.5-2.0 mg/ml，优选为1.5mg/ml。羊抗兔igg的包被浓度为0.5-2.0 mg/ml，优选为1.5mg/ml。稀释后分别吸入划膜仪，设置喷量为1μl/cm，将其划到硝酸纤维素膜上。
84.3. 制备试纸制备样品垫：样品垫基材采用样品垫预处理液进行预处理后得到样品垫。样品垫预处理液包括以下质量分数的组分：pvp40 0.2～1%，酪蛋白钠 0.5～1.5%，表面活性剂s9 0.1～1%，余量tris-hcl缓冲液，所述的tris-hcl缓冲液的浓度为50mm～250mm，样品垫预处理液的ph为7.2～8.3。如下表5所示。
85.表5 样品垫预处理液组分
组分pvp40酪蛋白钠表面活性剂s9tris-hcl缓冲液（50mm～250mm）实施例
①
0.5%1%0.6�.9%实施例
②
1%0.5%0.8�.7%实施例
③
0.8%1.5%1�.7%
将样品垫、荧光垫、层析膜、吸水垫依次粘贴于pvc底板上得到本发明实施例一的试纸条。将样品垫、荧光垫、层析膜、吸水垫依次粘贴在pvc底板上，样品垫叠在荧光垫上，重叠1.5mm；荧光垫叠在层析膜上，重叠1.5mm；吸水垫叠在层析膜上，重叠1.5mm。
86.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。