用于在环境温度下储存的热处理食物产品的乳酸菌的制作方法

1.本发明涉及一种乳酸菌，该乳酸菌适于添加到ph为3.4至4.4的待在环境温度下储存的热处理食物产品中。


背景技术：

2.近年来，可以在非冷藏条件下(即，在环境温度下)储存、运输、处理和食用数月的发酵乳制品(诸如酸奶)已得到广泛使用。此类酸奶使消费者可以在一段时间内随身携带酸奶，而无需像可能冷藏许多饮料一样对其进行冷藏，因此此类酸奶为消费者提供了显著的便利优势。为了在环境温度下获得这种长期的保质期，已经在发酵工艺完成之后对酸奶进行了热处理，以杀死或至少抑制在发酵工艺使用的大量乳酸菌的进一步生长。活菌和起子培养物中乳酸菌的进一步生长可导致持续发酵并引起后酸化。热处理可以是例如巴氏灭菌工艺或超高温(uht)工艺。此类酸奶有时称为巴氏灭菌酸奶(post pasteurization yogurt)或常温酸奶(ambient yogurt)。
3.巴氏灭菌后酸奶产品不含或仅含少量的活性乳酸菌。然而，期望的是巴氏灭菌后酸奶产品含有乳酸菌和或益生菌，以便向消费者提供此类细菌的各种益处，例如健康和食品补充剂益处。当然，向待在环境温度下储存的巴氏灭菌后酸奶产品中添加活菌引入了技术问题，即，例如通过由于发酵引起的乳酸浓度增加而导致的ph降低，细菌将繁殖至酸奶会变质的程度。在现有技术中，这一技术挑战已经通过许多不同的方式得到了解决。例如，巴氏灭菌后酸奶产品中的细菌培养物已经以孢子的形式添加到巴氏灭菌后酸奶产品中。另外，用于添加到巴氏灭菌后酸奶产品中的细菌培养物已经以粉末、干燥、冷冻干燥、包衣或包封的培养物的形式添加。此外，用于添加到巴氏灭菌后酸奶产品中的细菌培养物已经例如通过辐射，微波处理，抗生素，温和巴氏灭菌，化学试剂(抑制剂)或ph、水活度或温度的调节被灭活。
4.wo2009/116864公开了一种含有益生菌孢子的乳制品，其中该乳制品可在非冷藏温度下储存较长一段时间。
5.wo2004/069156公开了一种含有益生菌的食物产品，其中益生菌已经通过辐射、微波处理、抗生素、温和巴氏灭菌和化学试剂(抑制剂)被灭活。
6.ep1289380b1公开了一种含有非活性乳杆菌属细菌的食物产品，例如乳制品。可通过例如温和热处理、ph调节或水活度调节而使乳杆菌属失活。
7.ep1514553b1公开了一种在人体内具有高存活率的双重包被的乳酸菌粉，其中该乳酸菌已经由蛋白质和多糖双重包被。
8.cn101323850公开了一种生产具有强耐热性的微囊化形式的瑞士乳杆菌的微囊的方法。
9.ep0555618b1公开了一种含有冻干乳酸菌的膳食产品。
10.cn102492643公开了一种鼠李糖乳杆菌菌株grx19及其在用于生产含有活乳杆菌属细菌的发酵乳制品的起子培养物中的应用。对发酵乳制品进行热处理，例如在70℃-75℃
下热处理15-20秒，而乳杆菌属菌株对该热处理具有抗性，原因是热处理后仍有一小部分细菌(例如，10exp7 cfu/ml)存活。热处理后，将热处理产品无菌地装入容器中，并在室温下储存例如30天。
11.wo2015/169928公开了一种适于制备发泡乳制品的液体乳制品组合物，其中该组合物在环境储存条件下是耐储存的，具有3.8至4.4的ph，并且包含发酵乳、至多0.12％水解乳清蛋白、至多5％脂肪和至多1％高甲酯果胶。
12.us20100009034公开了一种制备在环境温度下保持高活细胞计数的发酵乳饮料的方法，该方法包括：使用常规乳酸菌起子培养物进行乳发酵、稀释、混合和灭菌，以及在无菌条件下将鼠李糖乳杆菌atcc 53103添加到混合的乳饮料中。
13.us20100015285公开了一种制备在环境温度下保持高活细胞计数的直接酸化乳饮料的方法，该方法包括：通过将ph调节至4.0-4.5进行直接酸化以获得酸化的乳饮料，灭菌，以及在无菌条件下将鼠李糖乳杆菌atcc53103连同0.01％-0.3％促生长因子(例如，碳水化合物)添加到混合的乳饮料中。
14.wo2017/194650公开了一种生产环境储存食物产品的方法，该方法包括：提供ph为3.4至4.4的食物产品，对该食物产品进行热处理以获得热处理食物产品，以及将环境储存乳酸菌菌株中的一种或多种无菌添加到该热处理食物产品中，这些乳酸菌菌株选自由副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种及它们的突变体和变体组成的组。
15.需要进一步开发含有活性乳酸菌的改良巴氏灭菌后酸奶产品。


技术实现要素：

16.本发明涉及一种生产环境储存食物产品的方法，其中该食物产品已经通过以下步骤制备：乳酸菌起子培养物的发酵，热处理以灭活乳酸菌从而防止或基本上防止后酸化，将酒球菌属的菌株及它们的衍生突变体添加到热处理食物产品中。
17.在一个方面，本发明涉及一种生产环境储存食物产品的方法，该方法包括：提供ph为3.4至4.4的食物产品，对该食物产品进行热处理以将细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g从而获得热处理食物产品，将一种或多种环境储存乳酸菌菌株以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的总量无菌添加到该热处理食物产品中以获得环境储存食物产品，以及将该环境储存食物产品在环境温度下储存一段时间，
18.其中该环境储存乳酸菌菌株选自由下述菌株组成的组，
19.(i)其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii bulgaricus)的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且
20.(ii)其中该测试产品的该ph在该储存期期间至多降低0.8个单位，并且
21.(iii)其中该菌株选自由酒球菌属(oenococcus)的菌株及它们的突变体组成的组。
22.本发明基于一个意想不到的实验发现，即，当添加到在环境温度下储存的酸奶产
品中时，酒球菌属的细菌菌株能够在至少120天的时间内保持一定水平的活力，而不会在任何显著程度上降低ph水平。这是一个令人惊奇的发现，因为在乳基质中，乳酸菌会在可利用的碳水化合物源上生长，同时降低ph直到ph达到细菌不能存活的水平，所以通常乳基质中的乳酸菌要么处于生长且ph降低的状态，要么死亡。
23.在另一方面，本发明涉及一种包含环境储存乳酸菌菌株的环境储存食物产品，其中该产品具有3.4至4.4的ph，其中该产品含有至少1.0
×
10exp03cfu/g的该菌株，其中该环境储存食品在环境温度下储存一段时间，并且
24.其中该乳酸菌菌株选自由下述菌株组成的组，
25.(i)其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且
26.(ii)其中该测试产品的该ph在该储存期期间至多降低0.8个单位，并且
27.(iii)其中该菌株选自由酒球菌属的菌株及它们的突变体组成的组。
具体实施方式
28.生产环境储存食物产品的方法
29.本发明涉及一种生产环境储存食物产品的方法，该方法包括：提供ph为3.4至4.4的食物产品，对该食物产品进行热处理以将细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g从而获得热处理食物产品，将一种或多种环境储存乳酸菌菌株以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的总量无菌添加到该热处理食物产品中以获得环境储存食物产品，以及将该环境储存食物产品在环境温度下储存一段时间，其中该环境储存乳酸菌菌株选自由下述菌株组成的组，
30.(i)其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii bulgaricus)的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且
31.(ii)其中该测试产品的该ph在该储存期期间至多降低0.8个单位，并且
32.(iii)其中该菌株选自由酒球菌属(oenococcus)的菌株及它们的突变体组成的组。
33.在一个优选实施方案中，环境储存菌株能够在储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g，优选至少5.0
×
10exp03 cfu/g，更优选至少1.0
×
10exp04 cfu/g，更优选至少5.0
×
10exp04 cfu/g，最优选至少1.0
×
10exp05cfu/g的量的活力。
34.优选地，ph在储存期期间至多降低0.7，优选0.6，优选0.5，优选0.4，优选0.3，最优选0.2。
35.在本发明的一个优选实施方案中，当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到测试产品中时，菌株增加到至少5.0
×
10exp07 cfu/g，优选7.5
×
10exp07cfu/g，最优选1.0
×
10exp08 cfu/g的量。
36.优选地，细胞量的增加发生在将菌株添加到测试产品中的45天内，优选40天内，优
选35天内，优选30天内，优选25天内，优选20天内，最优选15天内。优选地，细胞量在将菌株添加到测试产品中的45天内，优选40天内，优选35天内，优选30天内，优选25天内，优选20天内，最优选15天内达到最大值。
37.在本发明的一个具体实施方案中，环境储存食物产品在环境温度下储存至少1天，优选至少2天，更优选至少3天，更优选至少4天，更优选至少5天，更优选至少6天，更优选至少7天，更优选至少8天，更优选至少9天，最优选至少10天的时间。
38.在本发明的一个具体实施方案中，酒球菌属菌株选自由酒类酒球菌(oenococcus oeni)菌株、北原酒球菌(oenococcus kitaharae)菌株、苹果汁酒球菌(oenococcus sicerae)菌株及它们的突变体组成的组。在本发明的一个具体实施方案中，酒球菌属菌株选自由酒类酒球菌菌株及其突变体组成的组。
39.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株选自由保藏号为dsm 33144的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33145的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33146的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33147的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 14498的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15568的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15569的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15570的酒类酒球菌菌株和保藏号为dsm 15571的酒类酒球菌菌株及它们的突变体组成的组。
40.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株选自由保藏号为dsm 33144的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33145的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33146的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33147的酒类酒球菌菌株和保藏号为dsm 14498的酒类酒球菌菌株及它们的突变体组成的组。
41.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是柠檬酸阴性菌株。术语“柠檬酸阴性”在本发明的上下文中用于表征当置于含有预先确定的量的柠檬酸的培养基中时仅能够降解至多80％的该柠檬酸的菌株。特别地，当置于含有预先确定的量的柠檬酸的培养基中时，本发明的酒球菌属菌株仅能够降解至多70％，优选至多60％，更优选至多50％，更优选至多40％，更优选至多30％，更优选至多20％，更优选至多15％，最优选至多10％的该柠檬酸。
42.柠檬酸阴性的酒球菌属菌株在wo2004/113488中有所描述，其通过引用方式包括在本文中。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的柠檬酸阴性酒球菌属菌株选自由保藏号为dsm15568的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm15569的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm15570的酒类酒球菌菌株和保藏号为dsm15571的酒类酒球菌菌株及它们的突变体组成的组。
43.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是蔗糖阳性的。
44.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是葡萄糖阳性的。
45.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是半乳糖阳性的。
46.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是果糖阳性的。
47.在本发明的一个具体实施方案中，本发明的酒球菌属菌株是乳糖缺陷型的。
48.本发明的酒球菌属菌株在各种碳水化合物源上生长的能力可使用实施例2中所述的方法进行测试。
49.在本发明的方法的一个具体实施方案中，ph为3.4至4.4的食物产品是通过以下步
骤提供的起子培养物发酵乳制品：使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质以获得该起子培养物发酵乳制品。
50.在本发明的方法的一个具体实施方案中，起子培养物发酵乳制品具有超过基于重量5.1％(w/w)的蛋白质含量。
51.在本发明的方法的一个具体实施方案中，起子培养物发酵乳制品不进行稀释。
52.下文中更详细地描述了本发明的方法，该方法涉及生产环境储存发酵乳制品的方法。
53.起子培养物可以是用于生产特定类型的发酵乳制品的任何常规乳酸菌起子培养物，包括单一菌株培养物和培养物混合物。在本发明的上述方法的一个优选实施方案中，进行发酵以获得3.0至5.0，优选3.9至4.8，更优选4.0至4.6，最优选4.1至4.4的ph。
54.优选通过将起子培养物发酵乳制品置于50℃至90℃，优选60℃至85℃，更优选65℃至82℃，最优选70℃至80℃的温度下进行热处理，以将起子培养物的细菌水平降低至不超过1.0
×
10exp02 cfu/g发酵乳。热处理优选进行10秒至180秒，优选12秒至120秒，更优选14秒至90秒，更优选16秒至60秒，更优选18秒至50秒，最优选20秒至40秒的时间。优选地，起子培养物的细菌水平降低至不超过1.0
×
10exp01 cfu/g发酵乳，更优选0cfu/g。用于环境储存食物产品的乳酸菌菌株
55.在一个方面，本发明涉及用于环境储存食物产品的乳酸菌菌株，其中该产品具有3.4至4.4的ph，其中该产品含有至少1.0
×
10exp03 cfu/g的该菌株，其中该环境储存食品在环境温度下储存一段时间，并且
56.其中该乳酸菌菌株选自由下述菌株组成的组，
57.(i)其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且
58.(ii)其中该测试产品的该ph在该储存期期间至多降低0.8个单位，并且
59.(iii)其中该菌株选自由酒球菌属的菌株及它们的突变体组成的组。
60.在本发明的菌株的一个具体实施方案中，产品是化学酸化的产品。
61.在本发明的菌株的一个具体实施方案中，产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中该产品含有不超过1
×
10exp02 cfu/g的起子培养物和至少1
×
10exp03 cfu/g的环境储存乳酸菌菌株。
62.在本发明的菌株的一个具体实施方案中，产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中已经对发酵后的发酵乳制品进行了热处理以将该起子培养物的细菌水平降低至不超过1
×
10exp02cfu/g，并且其中在热处理后，已经将根据权利要求1所述的环境储存菌株以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量无菌添加到热处理产品中。优选地，已将本发明的环境储存菌株以至少1.0
×
10exp04 cfu/g，更优选至少1.0
×
10exp05 cfu/g，更优选至少1.0
×
10exp06 cfu/g，更优选至少1.0
×
10exp07 cfu/g，并且最优选至少1.0
×
10exp08 cfu/g的量无菌添加到热处理产品中。
63.本发明的酒球菌属菌株已在上文结合本发明的方法进行了描述，其中参考了本发明的方法。
64.本发明的菌株可被配制成包含一种或多种根据本发明的菌株的组合物。因此，在一个实施方案中，本发明的菌株被配制成含有根据本发明的单一菌株的组合物。在另一个实施方案中，菌株被配制成含有两种或更多种本发明的菌株的组合物。组合物可以是冻干或冷冻颗粒的形式。
65.环境储存食物产品
66.在一个实施方案中，本发明涉及一种包含环境储存乳酸菌菌株的环境储存食物产品，其中该产品具有3.4至4.4的ph，其中该产品含有至少1.0
×
10exp03 cfu/g的该菌株，其中该环境储存食品在环境温度下储存一段时间，并且
67.其中该乳酸菌菌株选自由下述菌株组成的组，
68.(i)其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度的120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且
69.(ii)其中该测试产品的ph在该储存期期间至多降低0.8个单位，并且
70.(iii)其中该菌株选自由酒球菌属的菌株及它们的突变体组成的组。
71.在一个实施方案中，本发明涉及一种环境储存食物产品，其中该产品是化学酸化的产品。
72.在一个实施方案中，本发明涉及一种环境储存食物产品，其中该产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中该产品含有不超过1
×
10exp02 cfu/g的起子培养物和至少1
×
10exp03 cfu/g的环境储存乳酸菌菌株。
73.在一个实施方案中，本发明涉及一种环境储存食物产品，其中该产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中已经对发酵后的发酵乳制品进行了热处理以将该起子培养物的细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g，并且其中在所述热处理后，已经将根据权利要求1所述的环境储存菌株以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量无菌添加到热处理产品中。
74.在一个实施方案中，本发明涉及一种环境储存食物产品，其中酒球菌属菌株选自由酒类酒球菌、北原酒球菌、苹果汁酒球菌及它们的突变体组成的组。
75.在一个实施方案中，本发明涉及一种环境储存食物产品，其中菌株选自由保藏号为dsm 33144的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33145的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33146的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33147的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 14498的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15568的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15569的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 15570的酒类酒球菌菌株和保藏号为dsm 15571的酒类酒球菌菌株及它们的突变体组成的组。
76.在本发明的一个优选实施方案中，环境储存食物产品选自由发酵乳制品、化学酸化乳制品、水果饮料、发酵谷类制品、化学酸化谷类制品、豆乳制品及它们的任何混合物组成的组。优选地，环境储存食物产品是发酵乳制品，其中乳是哺乳动物乳。
77.发酵乳制品通常含有2.0重量％至3.5重量％水平的蛋白质。发酵乳制品也可以是具有1.0重量％至2.0重量％的蛋白质水平的低蛋白质产品。另选地，发酵乳制品可以是具有超过3.5重量％，优选超过5.1重量％的蛋白质水平的高蛋白质产品。在本发明的发酵乳
制品的一个具体实施方案中，产品是发酵乳制品和谷类制品(例如，燕麦制品)的混合物，其中该谷类制品可以是发酵谷类制品，例如发酵燕麦制品。
78.在本发明的一个具体实施方案中，环境储存食物产品是发酵谷类制品。发酵谷类制品可通过以下步骤制备：碾磨谷类生物来源材料的谷粒以产生谷物粉，然后对其进行发酵。谷物粉的发酵可以使用与本技术中别处所述的用于乳基质发酵的相同乳酸菌(起子培养物)进行。
79.在本发明的一个具体实施方案中，环境储存食物产品是水果饮料。水果饮料可进一步含有例如燕麦、大豆、杏仁、乳清和/或非发酵乳(例如，奶粉形式)。在一个具体实施方案中，本发明的水果饮料不含乳制品成分，例如乳。在本发明的水果饮料的另一个具体实施方案中，水果饮料进一步含有发酵乳制品。
80.在本发明的另一个实施方案中，本发明的环境储存食物产品是化学酸化的产品。酸化可以使用适于添加到食物产品中的任何酸化剂进行，这些酸化剂诸如乳酸、柠檬酸、果汁、果浆和水果复合物。在一个具体实施方案中，环境储存食物产品是用果汁酸化的乳。
81.在本发明的一个具体实施方案中，环境储存食物产品是化学酸化的谷类制品。化学酸化的谷类制品可通过以下步骤制备：碾磨谷类生物来源材料的谷粒以产生谷物粉，然后将其用于产生含水性悬浮液，然后将该悬浮液的ph调节至所需水平。在一个具体实施方案中，环境储存食物产品是用水果饮料酸化的谷类食物产品。
82.除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则上述要素、方面和实施方案在其所有可能变体中的任何组合均由本发明涵盖。
83.定义
84.与本发明相关的下列术语和表达具有以下含义：
85.表述“热处理”是指使用任何温度、持续任何时间段以及通过任何手段或设备进行的任何处理，其灭活起子培养物的细菌的至少一部分。就此而论，术语“灭活”是指细菌生长的任何停止、减少或抑制，例如细胞裂解。
86.表述“环境储存”是指在环境温度下进行的储存。表述“环境温度”是指周围环境的温度，例如室温。例如，环境温度可以是5℃至40℃，更特别地10℃至35℃，更特别地15℃至30℃，最特别地18℃至27℃。环境温度可以是受控的，即温度在一整天(24小时)的过程中是相同的；也可以是不受控的，即温度在一整天(24小时)的过程中是变化的。
87.表达“活力”是指细菌能够在30℃厌氧条件下温育3天的mrs琼脂平板上显示生长(形成菌落)。mrs琼脂具有以下组成(g/l)：
88.蛋白胨：10.0
89.牛肉浸膏：10.0
90.酵母提取物：5.0
91.葡萄糖：20.0
92.聚山梨醇酯80：1.0
93.柠檬酸铵：2.0
94.醋酸钠：5.0
95.硫酸镁：0.1
96.硫酸锰：0.05
97.磷酸氢二钾：2.0
98.琼脂：15.0
99.表述“环境储存乳酸菌菌株”是指当添加到发酵乳制品中时适于环境储存一段时间的乳酸菌菌株。
100.表述“起子培养物发酵乳制品”是指含有用于对乳进行发酵的起子培养物的发酵乳制品。
101.表述“热处理发酵乳制品”是指已进行热处理的发酵乳制品。
102.表述“环境储存发酵乳制品”是指适于环境储存一段时间的发酵乳制品。
103.表述“乳酸菌”指革兰氏阳性菌、微需氧菌或厌氧菌，它们使糖发酵，同时产生酸，包括作为主要产生的酸的乳酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌在“乳杆菌”目中发现，其包括乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、假明串珠菌属、片球菌属、短杆菌属、肠球菌属和丙酸杆菌属。这些乳酸菌经常单独或与其他乳酸菌组合用作食物培养物。
104.包括乳杆菌属和乳球菌属物种的细菌的乳酸菌通常以用于批量起子繁殖的冷冻或冻干培养物的形式，或者以用于直接接种到发酵容器或罐中进行乳制品(诸如发酵乳制品或奶酪)生产的所谓的“直投式发酵剂”(dvs)培养物的形式提供给乳制品行业。此类乳酸菌培养物通常被称为“起子培养物”或“起子”。
105.术语“乳”应理解为通过对任何哺乳动物诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼进行挤奶而获得的乳汁分泌物。在一个优选实施方案中，乳是牛乳。术语“乳”还包括由植物材料制成的蛋白质/脂肪溶液，例如豆奶。
106.术语“乳基质”可以是可进行根据本发明的方法的发酵的任何原料乳材料和/或加工过的乳材料。因此，有用的乳基质包括但不限于包含蛋白质的任何乳或乳类产品(诸如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或奶油)的溶液/悬浮液。显然，乳基质可以来源于任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳或复原乳粉。
107.在发酵之前，可以根据本领域已知的方法对乳基质进行均质化和巴氏灭菌。
108.本文所用的“均质化”是指充分混合以获得可溶性悬浮液或乳液。如果在发酵之前进行均质化，则可以将乳脂分解成较小的尺寸，使其不再与乳分离。这可以通过在高压下迫使乳通过小孔来实现。
109.如本文所用，“巴氏灭菌”是指对乳基质进行处理以减少或消除活生物体(诸如微生物)的存在。优选地，通过在特定时间段内保持特定的温度实现巴氏灭菌。通常通过加热达到特定的温度。可以选择温度和持续时间以便杀死或灭活某些细菌，诸如有害细菌。随后可以进行快速冷却步骤。
110.本发明的方法中的“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。
111.待在乳制品的生产过程中使用的发酵工艺是公知的，并且本领域技术人员将了解如何选择合适的工艺条件，诸如温度、氧气、微生物的量和特征以及工艺时间。显然，选择发酵条件是为了支持本发明的实现，即获得固体形式(例如，奶酪)或液体形式(例如，发酵乳制品)的乳制品。
112.在本发明的上下文中，术语“突变体”应理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学
处理，和/或选择、适应、筛选等手段从本发明的菌株衍生的菌株。优选地，突变体是功能上等效的突变体，例如，在对环境储存的适应性方面与母体菌株具有基本上相同或改进的特性的突变体。这种突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”是指通过对本发明的菌株进行任何常规使用的诱变处理而获得的菌株或者指自发产生的突变体，这些诱变处理包括用化学诱变剂诸如甲磺酸乙酯(ems)或n-甲基-n'-硝基-n-硝基胍(ntg)、uv光处理。突变体可能进行了若干次诱变处理(单次处理应当理解为一个诱变步骤，之后是筛选/选择步骤)，但是目前优选进行不超过20次、不超过10次或不超过5次处理。在目前优选的突变体中，与母体菌株相比，细菌基因组中少于1％，或少于0.1％，少于0.01％，少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸被改变(例如通过置换、插入、缺失或其组合)。
113.优选地，本发明的菌株的“突变体”具有这样的特性，即，当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii bulgaricus)的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的并且已经在75℃下热处理30秒的酸奶形式的发酵乳测试产品中时，该菌株能够在该测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，并且其中该ph在该储存期期间至多降低0.8个单位。
114.优选地，本发明的菌株的“突变体”在该菌株的一个或多个蛋白质的氨基酸序列中具有少于25个，更优选少于10个，更优选少于9个，更优选少于8个，更优选少于7个，更优选少于6个，更优选少于5个，更优选少于4个，更优选少于3个，更优选少于2个突变。就此而论，术语“突变”是指选自由取代、缺失和插入组成的组的突变。
115.在描述本发明的上下文中(尤其是在下文权利要求的上下文中)，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“a(一)”和“an(一)”和“该/所述”以及类似的指代应理解为包括单数和复数。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值都被纳入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行。除非另有要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐述本发明，而不对本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应理解为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必要的。
116.表述“发酵乳制品”是指食品或饲料产品，其中该食品或饲料产品的制备涉及用乳酸菌发酵乳基质。如本文所用，“发酵乳制品”包括但不限于产品，诸如嗜热发酵乳制品(例如，酸奶)、嗜温发酵乳制品(例如，酸奶油和酪乳)、奶酪以及发酵乳清。
117.术语“嗜热生物”在本文中是指在高于43℃的温度下生长最佳的微生物。工业上最有用的嗜热细菌包括链球菌属和乳杆菌属。术语“高温发酵”在本文中是指在高于约35℃，诸如约35℃至约45℃的温度下发酵。术语“高温发酵乳制品”是指通过嗜热起子培养物的嗜热发酵制备的发酵乳制品，并且包括诸如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用型酸奶(例如养乐多)的发酵乳制品。
118.术语“嗜温生物”在本文中是指在中等温度(15℃-40℃)下生长最佳的微生物。工业上最有用的嗜温细菌包括乳球菌属和明串珠菌属。术语“中温发酵”在本文中是指在约22
℃至约35℃的温度下发酵。术语“中温发酵乳制品”是指通过中温起子培养物的中温发酵制备的发酵乳制品，并且包括诸如酪乳、酸乳、发酵乳、斯美塔那、酸奶油、克非尔和新鲜奶酪(诸如夸克奶酪、特沃劳格奶酪(tvarog)和奶油奶酪)的发酵乳制品。
119.术语“奶酪”应理解为涵盖任何奶酪，包括硬奶酪、半硬奶酪和软奶酪，诸如以下类型的奶酪：白奶酪(cottage)、羊乳酪(feta)、切达奶酪、帕尔马奶酪、马苏里拉奶酪、埃曼塔奶酪、丹博奶酪(danbo)、高德奶酪、埃德姆奶酪(edam)、羊乳酪型奶酪、蓝纹奶酪、盐水奶酪、卡芒贝尔奶酪和布里奶酪。本领域技术人员了解如何将凝固物转化为奶酪，方法可以在文献中找到，参见例如kosikowski,f.v.和v.v.mistry，“cheese and fermented milk foods”，1997年，第3版，f.v.kosikowski，l.l.c.westport，ct。如本文所用，nacl浓度低于1.7％(w/w)的奶酪被称为“低盐奶酪”。
120.在本发明的上下文中，术语“果汁”是指天然包含在水果中的、通过在不存在热和溶剂的情况下机械压榨或浸软新鲜水果而制备的液体。“果汁”可以由来自一种类型的水果或多于一种类型的水果的混合物的果汁组成。
121.在本发明的上下文中，术语“水果饮品”是指具有0％至29％的果汁含量的饮料。
122.在本发明的上下文中，术语“花蜜(nectar)”是指具有30％至99％果汁的果汁含量的饮料。
123.在本发明的上下文中，术语“果泥”是指在不存在热和溶剂的情况下通过研磨、挤压和/或过滤成稠的液体或软的糊状物的稠度而制备的水果。“果泥”由100％的水果制成，而不是仅由水果的汁液制成。
124.在本发明的上下文中，术语“水果饮料”是指包含果汁、水果浓缩物和/或水果泥的饮料。术语“水果饮料”涵盖如本文所定义的“果汁”、“水果饮品”和“花蜜”。“水果饮料”可以是含有果肉的饮料，也可以是通过诸如离心的操作除去果肉的饮料。
125.术语“无菌添加”是指除环境储存乳酸菌之外，不引入或引入最少量的任何微生物。
126.术语“谷类制品”是指从谷物或谷类生物来源材料获得的任何产品，包括燕麦、玉米、大麦、黑麦、荞麦、小麦和大米。
127.术语“乳糖缺陷型的”在本发明的上下文中用于表征部分或完全丧失使用乳糖作为细胞生长或维持细胞活力的来源的能力的lab。这种lab能够代谢一种或若干种选自蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖的碳水化合物或另一种可发酵的碳水化合物。由于这些碳水化合物在乳中天然存在的量不足以支持乳糖缺陷型突变体的发酵，因此有必要将这些碳水化合物添加到该乳中。乳糖缺陷型和乳糖部分缺陷型lab可以表征为在含有乳糖和x-gal的培养基上的白色菌落。
128.术语“柠檬酸阴性”菌株是指在kempler mckay琼脂培养基上形成白色菌落的菌株，而柠檬酸阳性菌株在该培养基上形成深蓝色菌落，其中该kempler mckay培养基在公开“improved medium for detection of citrate-fermenting streptococcus lactis subsp.diacetylactis”，g.m.kempler和l.l.mckay，applied and environmental microbiology，1980年4月，第39卷第4期，第926-927页中有所定义。该kempler kakay培养基具有以下组成：
129.1％(重量/体积)脱脂乳
130.0.25％乳蛋白水解蛋白胨
131.0.5％右旋糖
132.1.5％琼脂
133.制备方法：
134.在10lb/in2下将培养基灭菌12分钟后，将其在45℃下进行调温。将两种溶液(一种含有10％铁氰化钾，一种含有1g柠檬酸铁和1g柠檬酸钠的40ml水溶液)汽蒸(100℃)30分钟。取每种溶液10ml添加到1l琼脂培养基中，并轻轻地旋转琼脂并倒出。将平板在30℃下避光干燥24小时。
135.表述“x.x
×
10expyy”和“x.xeyy”均指x.x
×
10
yy
，这两种表述可互换使用。
136.表述“cfu”是指菌落形成单位。
137.本发明的具体项目
138.1.一种环境储存乳酸菌菌株，其中当以1.0
×
10exp07 cfu/g的量添加到酸奶形式的发酵乳测试产品中时，所述菌株能够在所述测试产品的25℃温度下120天的储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量的活力，所述酸奶是通过在43℃的温度下用含有嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbrueckii bulgaricus)的起子培养物发酵至4.3的ph而获得的，并且已经在75℃下热处理30秒，并且其中所述ph在所述储存期期间至多降低0.8个单位，并且其中所述菌株选自由球菌属的菌株及它们的突变体组成的组。
139.2.根据权利要求1所述的菌株，其中所述菌株能够在所述储存期结束时保持至少1.0
×
10exp03 cfu/g，优选至少5.0
×
10exp03 cfu/g，更优选至少1.0
×
10exp04 cfu/g，更优选至少5.0
×
10exp04 cfu/g，最优选至少1.0
×
10exp05 cfu/g的量的活力。
140.3.根据权利要求1或2所述的菌株，其中所述ph在所述储存期期间至多降低0.7，优选0.6，优选0.5，优选0.4，优选0.3，并且最优选0.2。
141.4.根据前述权利要求中任一项所述的菌株，其中当以1.0
×
10exp07cfu/g的量添加到所述测试产品中时，所述菌株增加到至少5.0
×
10exp07cfu/g，优选7.5
×
10exp07 cfu/g，最优选1.0
×
10exp08 cfu/g的量。
142.5.根据权利要求4所述的菌株，其中细胞的量的增加发生在将所述菌株添加到所述测试产品的45天内，优选40天内，优选35天内，优选30天内，优选25天内，优选20天内，并且最优选15天内。
143.6.根据权利要求4或5所述的菌株，其中细胞的量在将所述菌株添加到所述测试产品的45天内，优选40天内，优选35天内，优选30天内，优选25天内，优选20天内，并且最优选15天内达到最大值。
144.7.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-6中任一项所述的环境储存乳酸菌菌株中的一种或多种。
145.8.一种ph为3.4至4.4的环境储存食物产品，其中所述产品含有至少1.0
×
10exp03 cfu/g的根据权利要求1所述的环境储存菌株。
146.9.根据权利要求8所述的食物产品，其中所述产品是化学酸化的产品。
147.10.根据权利要求8所述的食物产品，其中所述产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中所述产品含有不超过1
×
10exp02 cfu/g的所述起子
培养物和至少1
×
10exp03 cfu/g的根据权利要求1所述的环境储存菌株。
148.11.根据权利要求8所述的食物产品，其中所述产品是通过使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质而获得的发酵乳制品，其中已经对发酵后的所述发酵乳制品进行了热处理以将所述起子培养物的细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g，并且其中在所述热处理后，已经将根据权利要求1所述的环境储存菌株以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的量无菌添加到所述热处理产品中。
149.12.一种用于生产环境储存食物产品的方法，所述方法包括：提供ph为3.4至4.4的食物产品，对所述食物产品进行热处理以将细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g从而获得热处理食物产品，以及将根据权利要求1所述的环境储存乳酸菌菌株中的一种或多种以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的总量无菌添加到所述热处理食物产品中以获得环境储存食物产品。
150.13.一种用于生产环境储存发酵乳制品的方法，所述方法包括：使用乳酸菌起子培养物发酵乳基质以获得起子培养物发酵乳制品，对所述起子培养物发酵乳制品进行热处理以将所述起子培养物的细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g从而获得热处理发酵乳制品，以及将根据权利要求1所述的环境储存乳酸菌株中的一种或多种以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的总量无菌添加到所述热处理发酵乳制品中以获得环境储存发酵乳制品。
151.14.根据权利要求1所述的环境储存乳酸菌菌株用于以至少1.0
×
10exp03 cfu/g的总量无菌添加到热处理食物产品中的用途，其中所述热处理食物产品具有3.4至4.4的ph并且已经进行了热处理，以将起子培养物的细菌水平降低至不超过1
×
10exp02 cfu/g。
152.15.一种乳酸菌菌株，其中所述菌株选自由保藏号为dsm 33144的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33145的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33146的酒类酒球菌菌株、保藏号为dsm 33147的酒类酒球菌菌株和保藏号为dsm 14498的酒类酒球菌菌株及它们的突变体组成的组。
153.实施例
154.实施例1：测试六种酒类酒球菌菌株在巴氏灭菌后酸奶(ppy)中的环境储存适应性
155.表1：乳基质
[0156][0157]
最终巴氏灭菌后酸奶的组成
[0158]
脂肪：2.6％
[0159]
蛋白质：3.0％
[0160]
碳水化合物：11.4％
[0161]
起子培养物：商业可得的起子培养物fd-dvs yf-l904型。将起子培养物以500u/2500l乳的水平接种到乳基质中。
[0162]
环境储存菌株：测试了六种商业可得的酒类酒球菌菌株。将各菌株以1
×
10exp07 cfu/g的水平接种到巴氏灭菌后酸奶中。
[0163]
测试菌株1：dsm33146
[0164]
测试菌株2：dsm33147
[0165]
测试菌株3：dsm15570
[0166]
测试菌株4：dsm33144
[0167]
测试菌株5：dsm33145
[0168]
测试菌株6：dsm14498
[0169]
生产测试产品的步骤
[0170]
1.将干燥成分分散到乳中
[0171]
2.在10℃在温和搅拌下静置至少2小时
[0172]
3.将乳加热，直到达65℃的温度
[0173]
4.在150巴下进行均质化
[0174]
5.热处理至95℃5分钟
[0175]
6.冷却至43℃的发酵温度
[0176]
7.将乳泵入发酵罐
[0177]
8.接种yoflex培养物fd-dvs yf-l904
[0178]
9.发酵，直到ph达4.30
[0179]
10.将凝乳打碎并搅拌，直到获得光滑的结构
[0180]
11.在75℃热处理30秒
[0181]
12.在2巴下进行后处理
[0182]
13.冷却至25℃
[0183]
14.无菌灌装至100ml无菌容器中
[0184]
测试环境储存菌株的步骤
[0185]
15.接种菌株和培养物
[0186]
16.在23℃的室温下储存120天
[0187]
ph的测定
[0188]
使用温度补偿，用ph 4.01、ph 7.00和ph 9.21的标准缓冲溶液校准ph电极。样品在相同温度下测量，本例中为室温(23℃)。显示的测量值必须具有至少30秒的稳定信号，然后记录数值。将电极用去离子水冲洗，并在样品之间用软纸巾小心擦拭。
[0189]
在第 0天和第 1天测量ph，然后每月测量直到第 120天。
[0190]
细胞计数方法
[0191]
通过菌落平板计数(cfu/g)监测细胞群体，其中在调节至ph 5.4的de man、rogosa和sharpe(mrs)培养基上进行培养。在厌氧条件下将样品在30℃温育10天。在mrs培养基上，菌落是可见的小而圆的浅色菌落。
[0192]
在第 0天和第 1天分析细胞计数，然后每月测量直到第 120天。
[0193]
mrs培养基
[0194]
mrs琼脂具有以下组成(g/l)：
[0195]
蛋白胨：10.0
[0196]
牛肉浸膏：10.0
[0197]
酵母提取物：5.0
[0198]
葡萄糖：20.0
[0199]
聚山梨醇酯80：1.0
[0200]
柠檬酸铵：2.0
[0201]
醋酸钠：5.0
[0202]
硫酸镁：0.1
[0203]
硫酸锰：0.05
[0204]
磷酸氢二钾：2.0
[0205]
琼脂：15.0
[0206]
结果
[0207]
表2：ph
[0208]
测试菌株第0天第1天第30天第60天第90天第120天14.294.304.254.224.224.1924.294.304.274.244.224.2234.294.304.194.144.134.0944.294.304.304.304.294.3254.294.314.294.224.204.2064,294.304.304.234.204.20
[0209]
表3：细胞计数
[0210]
测试菌株第0天第1天第30天第60天第90天第120天16.60e067.90e062.00e081.20e084.70e075.30e0727.20e066.10e061.60e054.32e075.50e074.70e0737.80e067.90e06《1.00e042.56e075.20e076.50e0744.60e064.50e06《1.00e041.44e072.70e074.60e0751.55e071.80e072.00e082.20e081.10e081.01e0867.20e061.17e071.35e081.90e081.70e088.90e07
[0211]
如表2所示，六种测试菌株中有五种于25℃下在120天的储存期中的后酸化水平低于0.10个ph单位，而第六种测试菌株的后酸化水平低于0.20个ph单位。因此，测试的所有六种酒类酒球菌菌株均仅产生极低水平的后酸化。
[0212]
如表3所示，所有六种测试菌株储存120天后的细胞计数高于第0天接种时的细胞计数。推测其原因是测试的酒类酒球菌培养物在储存期间已具有一定水平的生长。如果是这样，则该生长至多导致非常有限的ph降低。
[0213]
实施例2：测试酒类酒球菌菌株在不同碳水化合物源上的生长
[0214]
使用来自biomerieux sa的名为“api 50chl培养基”的商业测试来测试本发明的
下列酒类酒球菌菌株在半乳糖、葡萄糖、果糖和乳糖上生长的能力：
[0215]
测试菌株2：dsm33147
[0216]
测试菌株3：dsm15570
[0217]
测试菌株5：dsm33145
[0218]
在转移至api测试条之前的测试步骤
[0219]-从培养物保藏中心(从-80℃储库)订购菌株并在gj5琼脂平板上划线接种
[0220]-将平板在30℃厌氧温育7天
[0221]-在生长后，检查平板的菌落纯度
[0222]-然后，将2ml api chl培养基移液至琼脂平板上
[0223]-用无菌刮刀将菌落从琼脂上刮下，并将浓缩的细菌悬液转移到更多的api chl培养基中
[0224]
api测试条中的测试步骤
[0225]-将这些浓缩溶液取约100μl移液至api测试的孔中
[0226]-在孔上放置石蜡油以创造屏障和厌氧环境
[0227]-将api条在25℃温育
[0228]-通过记录1天和4天后孔的颜色变化来读取结果
[0229]
表4：在各种碳水化合物上的生长
[0230][0231]
保藏和专家方案
[0232]
申请人要求，在授予专利之日前，下文所述的保藏微生物的样品仅可由专家获得。特别地，申请人要求，epc第33条中提及的保藏微生物的可及性应仅通过将样品发给请求者指定的独立专家来实现(epc第32条第1款)。
[0233]
表5：申请人科汉森公司在以下取得根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约规定的国际保藏单位资格的保藏机构进行保藏：莱布尼茨研究所dsmz-德国微生物保藏中心，德国布伦瑞克因霍芬街7b，d-38124。
[0234]
菌株保藏号保藏日期酒类酒球菌dsm 331442019.05.28酒类酒球菌dsm 331452019.05.28酒类酒球菌dsm 331462019.05.28酒类酒球菌dsm 331472019.05.28