一种固定生物活样品的非包埋研究方法与流程

1.本发明涉及生物样品处理技术领域，具体涉及一种固定生物活样品的非包埋研究方法。


背景技术：

2.作为一种模式生物，斑马鱼被大量用于科研、医药以及环保水处理等领域。由于斑马鱼幼鱼体长只有1-2毫米，身体基本透明，因此非常适合生物实验观察。在观察过程中需要提前对斑马鱼幼鱼麻醉以后进行固定。通常采用的固定方法有甲基纤维素包埋以及低温琼脂包埋。这些方法的主要原理是利用固体包埋或者高粘稠的溶液限制幼鱼的漂移运动以及姿态变化，方便观察。同时，琼脂或者甲基纤维素溶液还提供一个类似液体的湿润环境以尽可能保证活体幼鱼的正常生理功能。
3.为了从特定的方向观察幼鱼的器官和形态。例如从鱼的侧面观察其肝肾等器官的大小和形态以进行毒理学方面的分析。需要将经过麻醉的幼鱼在甲基纤维素的粘稠水溶液中摆放成恰当的姿态并固定。这种方法可以借助解剖针对幼鱼的位置和姿态进行调整。由于甲基纤维素溶液仍然具有一定流动性，调整过程比较方便，也比较不容易对鱼体造成损伤；但固定的稳定性较差，已经被固定的幼鱼姿态在观察过程中仍然会发生变化，给实验带来不便。
4.另外一种常用的固定方法是用特定的低温琼脂进行包埋。凝固的琼脂更接近固态，所以能够得到更稳定的固定效果。但用于固定的少量琼脂凝固速度较快。如果在琼脂凝固前幼鱼的姿态没有完全摆正，或者幼鱼的姿态在琼脂凝固过程中发生变化，都会影响最终的观察，而且琼脂凝固以后完全无法对幼鱼的姿态进行修正。
5.以上两种方法都需要用含水介质将幼鱼完全包埋起来。在显微观察以后幼鱼和包埋材料无法分离。因此进行一次观察以后的幼鱼只能被废弃，造成浪费的同时也阻碍了对同一组幼鱼进行连续观察研究的可能。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中的问题，本发明提供一种固定生物活样品的非包埋研究方法，方便快速固定包括幼鱼在内的不同小型生物活体，不会对活体样品造成伤害，提高工作效率，在显微观察以后活体样品可以回收后再利用，节约资源的同时，也有利于对同一组活体样品进行连续观察研究。
7.本发明公开一种固定生物活样品的非包埋研究方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)、将融化的水凝胶倒入软胶制成的非包埋装置模具中，待水凝胶冷却凝固以后脱模，形成水凝胶底板，凝胶底板周围凸出设有边框，所述非包埋装置模具包括底板，底板上表面设有多个l形沟槽，l形沟槽包括上部平面和连接面；
9.步骤(2)、将制成的底板转移到标准载玻片上，l形沟槽的连接面朝向操作者，然后用滴管吸取已被麻醉的生物活样品滴到l形底板表面，吸走l形底板表面多余的水分，同时
轻轻拨动样品，令其头部朝向左侧，身体与l形沟槽方向平行；
10.步骤(3)、最终生物活样品被液体表面张力固定并贴合在底板上连接面上，在观察过程中水凝胶会保持生物活样品始终处于湿润状态；
11.步骤(4)、观察完成以后吸取培养液滴到底板上，生物活样品会重新漂浮起来。此时将底板倾斜即可将观察过的生物活样品重新回收到培养皿中，如果生物活样品没有被完全倒出，可以继续用培养液将其冲洗下来。
12.优选的是，步骤(1)中，底板上表面设有的多个l形沟槽首尾连接。
13.上述任一方案中优选的是，所述底板采用软体材质制作而成。
14.上述任一方案中优选的是，所述底板为水凝胶底板。水凝胶含水量超过90％。水凝胶在凝固过程中将网状结构的固定网包裹其中，凝固以后的水凝胶与固定网牢固结合以方便操作。由于水凝胶具有一定厚度，位于水凝胶底部的固定网不会和放置在水凝胶上表面的生物样品同时聚焦，因此不会影响显微观察。
15.上述任一方案中优选的是，多个l形沟槽位于同一平面内。
16.上述任一方案中优选的是，上部平面倾斜设置，连接面向下竖直设置。
17.上述任一方案中优选的是，所述上部平面和连接面所构成的夹角角度为锐角。
18.上述任一方案中优选的是，所述上部平面由一侧向另一侧逐渐升高或逐渐降低。
19.上述任一方案中优选的是，步骤(2)中，姿态与预期不同的样品进行进一步调整的方法为；将l形底板朝向操作者的方向竖立起来，然后用手术刀刀尖插入样品与l形底板之间或者轻轻在底板上按压样品尾部，使其按照预设的方向侧卧在倾斜设置的上部平面上。
20.上述任一方案中优选的是，所述底板下部设有固定网，所述固定网周围设有边框。
21.上述任一方案中优选的是，所述固定网内分布有多个均匀分布的漏孔，漏孔为圆形或多边形设置。起到固定作用的同时，能够相对减小液体的过多积聚。
22.上述任一方案中优选的是，所述步骤(1)中非包埋装置模具采用软胶材质制作而成。如可以选用软体硅胶等材质制作。
23.上述任一方案中优选的是，所述底板厚度为0.2-5mm。
24.上述任一方案中优选的是，所述底板厚度为0.2mm。
25.上述任一方案中优选的是，所述底板厚度为3mm。
26.上述任一方案中优选的是，所述底板厚度为5mm。
27.上述任一方案中优选的是，所述边框为矩形中空框体。
28.上述任一方案中优选的是，所述上部平面的倾斜角度为3-6
°
29.上述任一方案中优选的是，所述上部平面的倾斜角度为3
°
30.上述任一方案中优选的是，所述上部平面的倾斜角度为5
°
31.上述任一方案中优选的是，所述上部平面的倾斜角度为6
°
32.上述任一方案中优选的是，当水面降低到l形沟槽边沿以下时，样品(生物或样品)会自动向一侧倾倒，侧卧在l形沟槽的上部平面上，通过目视或者放大镜检查样品姿态是否与预期一致，如果姿态与预期不同的样品进行进一步调整。
33.有益效果
34.(1)本发明提供一种固定生物活样品的非包埋装置及研究方法，用水凝胶的保湿作用，在没有可流动水的情况下维持湿润环境。水凝胶表面排布有多条平行设置的l形沟
槽，沟槽一面接近垂直，一面为小角度倾斜，生物样品可以紧贴沟槽垂直面侧躺在倾斜表面上，方便调整样品姿态和观察。
35.(2)水凝胶在凝固过程中将网状结构的固定网包裹其中，凝固以后的水凝胶与固定网牢固结合以方便操作。由于水凝胶具有一定厚度，位于水凝胶底部的固定网不会和放置在水凝胶上表面的生物样品同时聚焦，因此不会影响显微观察，同时有利于水凝胶制备的底板结构更加稳定。高透明的水凝胶不会妨碍光学以及荧光观察。
36.(3)微小生物样品如幼鱼被限制在沟槽l形底部(即连接面和上部平面内侧连接处)；沟槽底部保存的微量水分起到润滑和缓冲的作用，使得生物样品能够以沟槽方向为轴心进行有限的转动。利用工具拨动可以方便调整生物样品的姿态更方便显微观察。
37.(4)本发明提供一种固定生物活样品的非包埋装置，无需将幼鱼包埋，方便快速固定幼鱼，不会对幼鱼造成伤害，提高工作效率，在显微观察以后幼鱼可以回收后再利用，节约资源的同时，也有利于对同一组幼鱼进行连续观察研究。
38.本发明利用水的表面张力将活的生物样品固定在水凝胶表面上。由于生物样品没有被包埋起来，因此观察结束以后可以方便的回收用于后续的实验。水凝胶表面的沟槽结构使得实验者可以用尖锐的工具方便调整生物样品的姿态和位置。
附图说明
39.图1为发明提供的一种固定生物活样品的非包埋装置的结构示意图；
40.图2为本发明的一种固定生物活样品的非包埋装置的底板的结构示意图；
41.图3为图2的侧视图；
42.图4为本发明提供的一种固定生物活样品的非包埋装置的局部结构剖视图；
43.图5为本发明提供的一种固定生物活样品的非包埋装置的底板的实物照片；
44.图6为本发明实施例的斑马鱼幼鱼固定后照片和显微图片；
45.图7为本发明实施例的孔雀鱼幼鱼显微图片固定后照片；
46.图8为本发明另一优选实施例的底板结构剖视图。
47.图中：1、底板，2、固定网，3、边框，11、上部平面，12、连接面。
具体实施方式
48.实施例1
49.一种固定生物活样品的非包埋装置，如图1-图4所示，包括底板1，所述底板1下部设有固定网2，所述固定网2周围设有边框3，底板1上表面设有多个首尾连接的l形沟槽，l形沟槽深度与生物样本的厚度或者高度相当，一般在0.2-2mm范围内。多个l形沟槽位于同一平面内，l形沟槽包括上部平面11和连接面12，上部平面11倾斜设置，连接面12向下竖直设置，接近垂直设置。l形沟槽深度为0.4mm。
50.底板1采用软体材质制作而成。具体的，底板1为水凝胶底板，水凝胶含水量超过90％。水凝胶含水量越高，对样品越友好，可以有效的保证样本处于非常湿润的环境。即使进行长时间的观察，样本依然能够保持比较好的活性。由于样本没有被包埋，一轮观察结束以后只要用流水简单冲洗就可以令样本从底板1上分离并被回收。水凝胶底板1可以直接凝固在固定网2上进行固定，固定网2用于固定和承托水凝胶。
51.固定网2可以被固定在边框3上。边框3为矩形中空框体，能够储存少部分液体，可以让鱼更容易改变姿态，方便调整。调整结束以后用吸管或者吸水纸将多余的液体吸出。上部平面11和连接面12所构成的夹角角度为锐角。上部平面11由一侧向另一侧逐渐升高或逐渐降低。具体的，上部平面11的倾斜角度为5
°
左右的小角度倾斜平面。
52.控制l形沟槽的深度可以在一定程度上控制样本的姿态。当沟槽深度小于样本的高度时，样本倾向于侧躺在沟槽的倾斜面上。当沟槽深度高于样本高度时，样本倾向于正立紧贴沟槽垂直面即连接面12一侧。沟槽底部残留的水分起到一定润滑作用，允许被固定的样本在外力下做有限的移动。因此可以用手术刀尖或者其它尖锐工具对样本的姿态和位置进行微调。样本在垂直沟槽即连接面12方向上无法移动，在上部平面11方向上受到水凝胶的摩擦阻力，方便对活体生物样本进行包括显微注射在内的微操作。
53.实施例2
54.一种固定生物活样品的非包埋装置，和实施例1相似，不同的是，上部平面11的倾斜角度为5
°
。
55.实施例3
56.一种固定生物活样品的非包埋装置，和实施例1相似，不同的是，上部平面11的倾斜角度为6
°
。
57.实施例4
58.一种固定生物活样品的非包埋装置，和实施例1相似，不同的是，水凝胶底板1的厚度为5毫米。
59.实施例5
60.本发明实施例提供一种采用上述非包埋装置进行非包埋固定生物活样本的研究方法，包括以下步骤：
61.(1)将加热融化的琼脂倒入软胶制成的模具中。待琼脂冷却凝固以后脱模，形成图5所示的水凝胶底板。
62.具体的，非包埋装置模具包括底板，底板上表面设有多个首尾连接的l形沟槽，多个l形沟槽位于同一平面内，l形沟槽包括上部平面11和连接面12，上部平面11倾斜设置，连接面向下竖直设置。底板1下部设有固定网2，所述固定网2周围设有边框3，非包埋装置模具采用软胶材质制作而成。底板1厚度为0.2-5mm。边框3为矩形中空框体。上部平面11由一侧向另一侧逐渐升高或逐渐降低。上部平面11的倾斜角度为3-6
°
。
63.对于2-7日龄的斑马鱼幼鱼，底板1上沟槽的深度建议为0.4毫米，即连接面12深度为0.4毫米。为方便操作，底板1周围设计有凸起的边框3用来盛水。
64.(2)将制成的底板转移到标准载玻片上，沟槽垂直面即连接面12朝向操作者，如图1中箭头指向操作者方向。然后用滴管吸取2-7天日龄已被麻醉的斑马鱼幼鱼滴到底板表面。用滴管或者滤纸吸走多余的水分，同时用牙签轻轻拨动斑马鱼，令其头部朝向左侧，身体与沟槽方向平行。当水面降低到沟槽边沿以下时，大部分斑马鱼会自动向一侧倾倒，侧卧在沟槽倾斜设置的上部平面11上。通过目视或者放大镜检查斑马鱼姿态是否与预期一致。如果有姿态与预期不同的斑马鱼，可将底板1朝向操作者的方向竖立起来，然后用手术刀刀尖插入鱼体与底板1之间或者轻轻在底板上按压斑马鱼尾部，使其按照预设的方向侧卧在倾斜设置的上部平面11上。
65.(3)被最终固定在底板上的斑马鱼如图6所示。图6中下图为体式显微镜下被固定后的斑马鱼放大图像。在观察过程中琼脂水凝胶会保持斑马鱼始终处于湿润状态。观察完成以后用滴管吸取培养液滴到底板1上，斑马鱼就会重新漂浮起来。此时将底板1倾斜即可将观察过的斑马鱼重新回收到培养皿中。如果斑马鱼没有被完全倒出，可以继续用培养液将其冲洗下来。
66.实施例6
67.本发明实施例提供一种采用上述非包埋装置进行非包埋固定生物活样本的研究方法，和实施例5相似，不同的是，沟槽的深度增加到2毫米，沟槽即连接面12的深度增加到2毫米。因为孔雀鱼幼鱼比斑马鱼体积更大，采用相同的方法也可以用来固定孔雀鱼，如图7所示，为孔雀鱼幼鱼显微图片固定后照片。
68.实施例7
69.本发明实施例提供一种采用上述非包埋装置，和实施例1相似，不同的是，水凝胶底板1内中间包埋有固定网2，如图8所示，固定网2可以采用塑料材质或软体金属材质制作而成，能够增强水凝胶底板1的承重能力，又不会影响水凝胶底板1表面的性能。
70.以上实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。