用于甲状腺癌诊断、分层及预后的标志物及其应用

1.本发明是申请号为2021105062593，名称为“用于甲状腺癌诊断、分层及预后的标志物及其应用”的专利申请的分案申请。本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及用于甲状腺癌诊断、分层及预后的标志物及其应用。


背景技术：

2.甲状腺癌(tc)是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。近年来，其发病率显著上升。甲状腺癌主要分为四种病理类型，而90％以上的甲状腺恶性肿瘤为甲状腺乳头状癌(ptc)。流行病学研究表明，人群中女性甲状腺结节的触诊率约为5％，男性约为1％。其中约5～15％的结节患者会发生恶性病变，需及时行手术或其他治疗，其余良性结节则需规范化随访。此外，虽然以ptc为主的分化型甲状腺癌总体预后良好，但在确诊时出现病灶明显侵犯周围重要结构的比例为6％～13％，发生远处转移的比例为5.9％～23％，其10年生存率明显降低(26％～70％)。而相关文献报道表明，早期诊断并及时治疗，可以显著提高恶性肿瘤患者的生存率。综上，甲状腺结节的良恶判别以及甲状腺癌的早期诊断是临床面临的关键问题之一。
3.目前在临床上，甲状腺癌没有诊断标志物。超声及超声引导下的穿刺，广泛用于甲状腺结节的筛查和诊断，是术前评估结节良恶的重要手段，但其存在明显的缺点或限制，例如：操作专业性强、依赖于临床医生经验、具有创伤性、对微小结节判断的准确度下降、20～30％的结节存在细胞学结果的不确定等等。另一方面，ptc由于容易出现颈部淋巴结转移癌(30～80％)，导致局部肿瘤的复发率升高10～42％，患者死亡率亦随之上升。外科手术是ptc的主要治疗方式。手术方式包括甲状腺切除，如果存在颈部淋巴结转移癌，同时应行颈淋巴结区域性清扫，从而避免患者由颈部淋巴结转移造成的后续局部肿瘤复发。在手术前如何确定患者是否存在淋巴结转移癌，是甲状腺癌在临床面临的另一关键问题。目前临床上对确定颈部淋巴结有无转移癌的诊断并不准确：术前超声对判断颈淋巴结转移癌的特异性高，但敏感性低；术中冰冻病理也可以给临床提示，但其假阴性高，对术前被评估为颈淋巴结转移癌阴性的患者石蜡病理证实淋巴结转移癌的发生率高达30％，等待术中病理同时也不可避免地延长了手术时间。由于很多患者存在隐匿转移，加之上述技术手段的限制，在术前很难准确判断患者是否存在淋巴结转移。对ptc是否进行常规预防性颈淋巴结清扫也存在争议。因此，临床医生常需要基于临床标准及个人经验判断是否行颈部淋巴结清扫，以期待在保证治疗彻底避免局部复发的同时，又能节约治疗成本、避免过度治疗带来的副损伤。因此，寻求一种更加准确、无创的甲状腺癌诊断、分层、预后指标，对临床决策和患者本身具有重要意义。
4.糖基化是最普遍和最重要的蛋白翻译后修饰之一。糖蛋白糖基化参与癌变、癌症进展和癌症转移等很多关键的生理和病理过程。由于糖链参与癌症相关的各种过程(细胞分化、粘附、侵袭、转移、细胞信号传导等)，异常糖基化被认为是癌症的标志之一。临床上应用的多种肿瘤标志物如ca125(应用于卵巢癌、子宫内膜癌等)、ca19-9(应用于胰腺癌、食管
癌)等均受糖链修饰。美国fda于2005年批准了糖基化(岩藻糖基化)的afp试剂盒用于肝癌的临床诊断。除了癌细胞来源的糖蛋白糖基化可能发生改变之外，b淋巴细胞产生的免疫球蛋白(igs)和肝细胞合成的急性阶段蛋白的糖基化也会发生改变，表明糖基化的改变是机体对“肿瘤发生”而产生的系统性反应的结果。重要的是，这种变化在体液中可以检测到。因此，糖链是癌症患者血液循环中，与系统性失调相关的潜在的生物标志物。鉴于此，分析体液中相关糖蛋白的糖基化谱图，为无创血清肿瘤标志物的发现提供了新的途径。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供用于甲状腺癌的标志物。该标志物用于甲状腺癌诊断、分层及预后诊断具有较高的特异性、灵敏度和准确性。本发明的另一目的是提供含有该标志物的产品及其应用。
6.本发明通过对大量健康、甲状腺结节患者以及甲状腺癌患者的体液全糖组进行检测和分析，获得了能够实现特异、灵敏、准确的甲状腺结节、甲状腺癌及其颈部淋巴结转移诊断的n-糖链标志物。通过检测这些n-糖链标志物在体液中的表达，可对甲状腺肿瘤进行良恶判别、甲状腺癌早期诊断、患者分层及预后评估。
7.具体地，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供用于甲状腺结节的标志物，其包括以下n-糖链标志物中的一种或多种的组合：cfa、a2fa、a4g、a4s、a4f0s、a4l、a4e、a4f0e。上述n-糖链标志物中的任意一个的表达量在健康人体和甲状腺结节患者中均具有显著差异，且每个糖链特征在区分健康与结节时其auc值均在0.9以上，特异性和灵敏度均较高，能够较为准确地区分健康人体与甲状腺结节患者。将上述n-糖链标志物组合使用，auc值为0.9854，敏感性为93％，特异性为96％，其鉴别的准确性、特异性和灵敏度比每个糖链特征单独使用时进一步提高。
9.在上述n-糖链标志物的基础上，本发明还提供了其它甲状腺结节特征性n-糖链标志物，这些n-糖链标志物包括：ca4、a2fl、a4fe、a4f、a2lf、a4f0g、a2l、a4f0l、a2gl。
10.由此，本发明提供的用于甲状腺结节的标志物包括以下n-糖链标志物中的一种或多种的组合：ca4、a4f、a2lf、cfa、a2fa、a4g、a4f0g、a4s、a4f0s、a2l、a2fl、a4l、a4f0l、a2gl、a4e、a4fe、a4f0e。上述n-糖链标志物中的任意一个的表达量在健康人体和甲状腺结节患者中均具有显著差异，且每个糖链特征在区分健康与结节时其auc值均在0.85以上，特异性和灵敏度均较高，能够较为准确地区分健康人体与甲状腺结节患者。将上述n-糖链标志物组合使用，auc值为0.9944，敏感性为100％，特异性为94％，其鉴别的准确性、特异性和灵敏度比每个糖链特征单独使用时进一步提高。
11.在上述n-糖链标志物的基础上，本发明还提供了其它甲状腺结节特征性n-糖链标志物，这些n-糖链标志物包括：a4l0f、a2fsg、a4fgs、a4f0gs、a4fgl、a4fge。
12.由此，本发明提供的用于甲状腺结节的标志物包括以下n-糖链标志物中的一种或多种的组合：ca4、a4f、a2lf、a4l0f、cfa、a2fa、a4g、a2fsg、a4f0g、a4s、a4f0s、a4fgs、a4f0gs、a2l、a2fl、a4l、a4f0l、a2gl、a4fgl、a4e、a4fe、a4f0e、a4fge。上述n-糖链标志物中的任意一个的表达量在健康人体和甲状腺结节患者中均具有显著差异，且每个糖链特征在区分健康与结节时其auc值均在0.7以上，特异性和灵敏度均较高，能够较为准确地区分健康人体与甲状腺结节患者。将上述n-糖链标志物组合使用，auc值为0.9989，敏感性为
100％，特异性为97％，其鉴别的准确性、特异性和灵敏度比每个糖链特征单独使用时进一步提高。
13.以上所述的n-糖链标志物中，在甲状腺结节患者体内，ca4、a4f、a2lf、a4l0f、cfa、a2fa、a2fsg、a4fgs、a2l、a2fl、a2gl、a4fe和a4fge的表达量较健康人体显著下降，a4g、a4f0g、a4s、a4f0s、a4f0gs、a4l、a4f0l、a4fgl、a4e、a4f0e的表达量较健康人体显著升高。
14.本发明还提供用于甲状腺癌的标志物，其包括以下n-糖链标志物中的一种或多种的组合：cfa、a2fa、a2l、a2gl。以上4种n-糖链标志物的表达量在甲状腺恶性结节、良性结节和健康对照中呈现连续变化，各组间差异极其显著，这4种n-糖链标志物用于区分良恶性甲状腺结节的auc均在0.7以上，用于区分甲状腺癌和非癌对照所得auc均在0.8以上，能够对甲状腺结节进行良恶判别，对甲状腺癌进行诊断。
15.以上所述的n-糖链标志物中，在甲状腺癌患者体内，cfa、a2fa、a2l、a2gl表达量较健康人体和良性甲状腺结节显著下降。
16.本发明还提供用于甲状腺癌颈部淋巴结转移的标志物，其包括n-糖链标志物a2lf、a3f0l、a2f0l和a2f0gl。以上四种n-糖链标志物与甲状腺癌颈部淋巴结转移高度相关。将a2lf、a3f0l、a2f0l和a2f0gl联合使用，区分发生和未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌所得auc为0.7148；在上述甲状腺癌标志物的基础上，a2lf、a3f0l、a2f0l和a2f0gl联合使用可用于发生和未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌的区分诊断。另外，目前临床上在术前确定是否发生颈部淋巴结转移的方法是超声检查。本发明对超声检查预测是否发生颈部淋巴结转移的auc进行分析，结果显示其auc仅为0.6170，提示预测无效。本发明筛选出的上述四种糖链特征与超声联合，预测准确度较超声检查预测显著提高，auc为0.7645。
17.以上所述的n-糖链标志物中，发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者体内，a2lf的表达量较未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者显著上升(即a2lf与甲状腺癌患者发生颈部淋巴结转移呈正相关)，发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者体内，a3f0l、a2f0l和a2f0gl的表达量较未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者显著降低(即a3f0l、a2f0l和a2f0gl与甲状腺癌患者发生颈部淋巴结转移呈负相关)。
18.本发明所述的n-糖链标志物的命名方法参考如下文献：zhang z,westhrin m,bondt a,et al.serum protein n-glycosylation changes in multiple myeloma[j].biochimica et biophysica acta(bba)-general subjects,2019。具体地，除质谱直接检测到的糖链结构外，采用直接检测到的糖链结构依据其结构特点和生物相关性通过rstudio计算得到派生糖链特征(derived glycan traits)。根据直接检测到的糖链结构特征和其反映的生物合成途径计算出派生糖链特征:糖链的类型(高甘露糖型(m)、复杂型(c)和杂合型(hy)聚糖)，天线/分支数量(a)，以及其他特征，如平分型糖链(b)，半乳糖基化(g)、岩藻糖基化(f)和连接特异的唾液酰化(s)。第一组派生的糖链特征将所有直接检测到的糖链划分为高甘露糖型(m)、复杂型(c)和杂合型(hy)聚糖。然后再根据糖型中，天线/分支的数目、岩藻糖基化有无及数目、半乳糖化和唾液化等的含量，对复杂型(c)糖链进行进一步细分。糖链派生特征表明，糖链改变是由一组结构相关的糖链共同发生的。计算的主体对象由最后一个字母表示，例如，唾液酸化(s)，s前面的字母代表在什么范围内计算，如，岩藻糖基化的二天线糖链中(a2f)。因此，可将a2fs翻译为岩藻糖基化的二天线糖链中的唾液化水平。
[0019]
派生糖链特征包括：复杂型n-糖链的天线数量(antennae of complex-type glycans，ca)、岩藻糖糖基化的水平(fucosylation，f)、平分型糖链的水平(bisection，b)、末端半乳糖糖基化水平(galactosylation，g)、唾液酸化水平(sialylation，s)等。各n-糖链标志物的具体结构和计算公式如表1所示，当计算公式中涉及的糖链未被直接检测到时，在计算公式中删除该糖链即可。
[0020]
表1 n-糖链标志物特征
[0021]
[0022]
[0023][0024][0025]
注：表1中m＝甘露糖；hy＝杂合型；t＝在所有的糖型中；c＝在复杂型糖型中；f＝脱氧核糖(岩藻糖)；g＝半乳糖；s＝n-乙酰神经氨酸(唾液酸)；e＝α2,6-连接唾液酸；l＝α
2,3-连接唾液酸；h＝己糖(甘露糖或半乳糖)；n＝n-乙酰氨基己糖(n-乙酰氨基葡萄糖：glcnac)。
[0026]
本发明中，直接检测糖链结构的命名、分类及派生特征命名方式如图1所示和表2所示。
[0027]
表2直接检测到的糖链结构.
[0028]
[0029]
[0030][0031]
进一步地，本发明提供以上所述的标志物或所述标志物的检测试剂在制备用于诊断甲状腺结节、甲状腺癌或甲状腺癌颈部淋巴结转移的药物中的应用。
[0032]
本发明还提供以上所述的标志物或所述标志物的检测试剂在制备用于诊断甲状腺结节、甲状腺癌或甲状腺癌颈部淋巴结转移的试剂盒中的应用。
[0033]
进一步地，本发明还提供一种药物，其包含本发明所述的标志物或所述标志物的检测试剂。
[0034]
本发明还提供一种试剂盒，其包含本发明所述的标志物或所述标志物的检测试剂。
[0035]
以上所述的药物和试剂盒可用于甲状腺结节、甲状腺癌或甲状腺癌颈部淋巴结转移的诊断。
[0036]
本发明所述的标志物的检测试剂可为任何用于本发明所述标志物检测的试剂，例如：特征性糖链探针、质谱检测试剂、凝集素芯片等。
[0037]
本发明还提供一种甲状腺结节的诊断方法，该方法为利用本发明所述的标志物进行诊断。具体地，对待诊断患者体内的所述标志物的表达量进行检测，根据其表达量变化情况，判断是否患有甲状腺结节。
[0038]
所述判断的依据为：ca4、a4f、a2lf、a4l0f、cfa、a2fa、a2fsg、a4fgs、a2l、a2fl、
a2gl、a4fe和a4fge中的一种或多种的表达量较健康人体显著下降，或者，a4g、a4f0g、a4s、a4f0s、a4f0gs、a4l、a4f0l、a4fgl、a4e、a4f0e中的一种或多种的表达量较健康人体显著升高，则初步判断患有甲状腺结节。
[0039]
本发明还提供一种甲状腺癌的诊断方法，该方法为利用本发明所述的标志物进行诊断。具体地，对待诊断患者体内的所述标志物的表达量进行检测，根据其表达量变化情况，判断是否患有甲状腺癌。
[0040]
所述判断的依据为：cfa、a2fa、a2l、a2gl中的一种或多种的表达量较健康人体或良性甲状腺结节显著下降，则初步判断患有甲状腺癌。
[0041]
本发明还提供一种甲状腺癌颈部淋巴结转移的诊断方法，该方法为利用本发明所述的标志物进行诊断。具体地，对待诊断患者体内的所述标志物的表达量进行检测，根据其表达量变化情况，判断是否发生颈部淋巴结转移。
[0042]
所述判断的依据为：发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者体内，a2lf的表达量较未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者显著升高，发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者体内，a3f0l、a2f0l和a2f0gl的表达量较未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌患者显著降低。
[0043]
本发明的有益效果在于：本发明提供的n-糖链标志物的表达量在健康人体、甲状腺结节、甲状腺癌和甲状腺癌颈部淋巴结转移患者中存在显著差异，可用于甲状腺结节的诊断、甲状腺肿瘤的良恶判别、甲状腺癌颈部淋巴结转移的判别，具有检测便捷、耗时短、特异度、灵敏度高、准确度高的优势，符合一个临床诊断指标在实际检测过程中应满足的操作要求，可在实践中用于甲状腺癌的早期诊断、患者分层及预后评估。
附图说明
[0044]
图1为本发明的聚糖命名、分类及派生特征命名的图示说明。
[0045]
图2为本发明具体实施方式中的流程示意图。
[0046]
图3为本发明实施例2中在健康对照、良性甲状腺结节、甲状腺癌各组间的表达量呈现连续变化的4种派生糖链特征标志物的表达量差异。
[0047]
图4为本发明实施例2中4种派生糖链特征标志物区分甲状腺良恶结节的roc曲线。
[0048]
图5为本发明实施例3中4种派生糖链特征标志物区分甲状腺癌和非癌对照(良性甲状腺结节 健康对照)的roc曲线。
[0049]
图6为本发明实施例4中4种派生糖链特征标志物区分发生和未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌的roc曲线。
具体实施方式
[0050]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0051]
本发明所述的“糖组(glycome)”是指样品(如体液、细胞、组织)中表达的全部糖链或某一类特定糖蛋白上的全部糖链。
[0052]
本发明所述的样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品等。
[0053]
本发明所述的糖链可为游离糖链或从糖复合物中释放的糖链。
[0054]
游离糖链可采用本领域已知的技术获得，包括但不限于：酶法，例如可采用糖苷酶，优选糖苷酶pngase f；化学法，例如采用β消除反应，糖蛋白肼解试剂；也可采用酶法和化学法的组合来释放糖链。
[0055]
本发明所述的衍生化方法包括但不限于：甲胺化、酯化、甲基化、还原氨化、乙酰化等，可根据需要对衍生化的类型进行选择。优选酯化。
[0056]
本发明中，从体液蛋白中游离下糖链后，可采用本领域已知技术对n-糖链进行纯化和/或富集。纯化、富集方法包括但不限于：离心、过滤、萃取、吸附、毛细管电泳、色谱法等。
[0057]
在本发明的一个具体实施方式中，采用了cotton hilic spe分离小柱富集纯化n-糖链，其中采用了水来活化分离柱，采用水:乙腈＝15：85(体积比)的溶液平衡分离柱，并采用纯水洗脱糖链。
[0058]
本发明中，糖链分析和数据处理可采用本领域已知的分析方法对糖组进行测定和定量。所述方法包括但不限于：质谱法，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(maldi ms)(如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(maldi-tof-ms)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(maldi-qit-tof ms))、快原子轰击质谱(fab-ms)、电喷雾质谱(esi-ms)、多级质谱、高效液相色谱hplc、液相色谱-质谱联用法(lc-ms)、糖芯片技术、核磁共振nmr或以上方式的任合组合。优选采用分辨率高的技术进行分析，例如maldi ms等。
[0059]
本发明中，对糖链分析数据进行进一步计算和处理以获得所需的糖组相关信息。例如，可获得样品中每种糖链峰面积相对于所有峰面积和的比值，从而获得每种糖链的相对定量值，可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，确保分析的高准确性；根据检测到的每个糖链的组成特点和生物相关性，计算出派生特征，包括岩藻糖糖基化的水平(fucosylation，f)、平分型糖链的水平(bisection，b)、末端半乳糖糖基化水平(galactosylation，g)、唾液酸化水平(sialylation，s)等。这些数据可直接用于相对含量比较或定性分析，用于监控目标糖链或糖链派生特征的丰度的变化。
[0060]
糖链分析数据进行进一步计算和处理可采用各种相关的糖链分析软件、数据库、算法等对所得的数据进行分析，可用的糖链分析软件包括但不限于：massytools、progenesis maldi、lassytools、glycoworkbench、glycanmass、glycomod、glycofragment、glycosearchms等。可用的糖链分析数据库包括但不限于：ccsd、glycomedb、carbbank、eurocarbdb等。
[0061]
本发明中，糖链的检测方法优选是高通量检测方法，例如：可同时处理和检测96、192、288、384个或更多个样品，这大大减少了样品制备的时间。
[0062]
以下实施例中，对400例健康人体对照，300例良性甲状腺结节患者和400例甲状腺癌患者进行血液全糖组检测。所用样本的队列特征如表3所示。
[0063]
表3样本队列特征
[0064][0065]
以上述样本为研究对象，筛选甲状腺癌诊断、分层、监测、预后的糖链标志物并判断其临床应用价值，基本流程如图2所示，具体步骤如下：
[0066]
1、糖苷酶释放n-糖链
[0067]
用糖苷酶pngase f将n-糖链从全血清/血浆糖蛋白上游离释放。具体步骤如下：从每个样本中取5μl血清/血浆，加入10μl的2％sds，60℃孵育10分钟；然后加入10μl酶解液(含2％np-40,2.5
×
pbs和1u pngase f)，37℃孵育12-16h。
[0068]
2、n-糖链衍生化
[0069]
用已知的衍生化技术对上述游离得到的n-糖链衍生化，经过衍生化可以将α2,3和α2,6连接键的唾液酸区分。具体步骤如下：1μl上述酶解后的血清/血浆，加入20μl衍生化试剂(250mm edc和250mm hobt，溶剂为无水乙醇)，37℃孵育60分钟。
[0070]
2、n-糖链hilic-spe富集纯化
[0071]
将上述得到的衍生化的糖链用hilic-spe进行富集纯化。hilic利用棉线作为固定相，棉线自行填充在20μl的枪头，制成纯化小柱，首先，用15μl超纯水(mq)活化柱子3次；接着，用15μl的85％乙腈平衡(acn)柱子3次；再将上述衍生化糖链混合液加入柱子，上样30次，保证衍生化的n-糖链尽可能完全地被吸附在柱子上；接着用15μl的85％乙腈 1％三氟乙酸(tfa)淋洗柱子3次，再用15μl的85％乙腈淋洗柱子3次；最后，将糖链洗脱于10μl mq中。
[0072]
4、n-糖链的质谱分析
[0073]
检测前，用已知分子质量的肽段混合物标准品(bruker peptide calibration standard ii)对质谱仪器进行校正。将基质super-dhb溶于含1mm naoh的50％乙腈(水)溶液中，浓度为5mg/ml。取上述1μl纯化的n-糖链，点样于质谱靶板上，然后将1μl基质溶液加滴在样品上，室温下晾干。应用maldi-tof ms进行分析，质谱配备smartbeam 3d激光源，并在正离子反射模式(reflection positive，rp)下采集信号离子，应用flexcontrol软件进行控制，样本检测时m/z范围设置为：1000至5000。谱图采集设置为：对于质谱靶板上的每个样本点，激光在该样本点范围内完全随机采集信号，累积10k laser shots，采集一张质谱谱图，激光频率为5000hz。
[0074]
5、数据预处理和统计分析
[0075]
使用flexanalysis和massytools软件对采集到的质谱图进行预处理，并导出到
microsoft excel进行进一步分析。应用glycoworkbench的糖链解析功能辅助人工解析来解析质谱数据，糖链结构的鉴定主要基于质荷比、二级质谱碎片归属及已经发表的文献。单个糖链定量由单个糖链的峰面积/检测到的所有糖链的峰面积和得到。除了直接检测到的糖链结构外，派生糖链特征(derived glycan traits)由直接检测到的n-糖链依据其结构特点和生物相关性通过rstudio计算所得。派生糖链特征包括：复杂型n-糖链的天线数量(antennae of complex-type glycans，ca)、岩藻糖糖基化的水平(fucosylation，f)、平分型糖链的水平(bisection，b)、末端半乳糖糖基化水平(galactosylation，g)、唾液酸化水平(sialylation，s)等。ptc和健康对照之间，ptc各亚组之间的n-糖基化的差异以及n-糖基化特征与临床参数之间的关系，通过统计检验、回归分析、受试者工作特征曲线进行评价。研究队列的质谱数据质量通过样本检测过程中随机分布在靶板上的标准品以及计算所得到的多个标品每种糖链的平均值、变异系数和标准偏差来评估。
[0076]
6、结果及讨论
[0077]
质量控制标品所得top30的糖链平均cv值为3.17％，说明本发明中得到的数据可靠。
[0078]
实施例1标志物用于区分健康对照和甲状腺结节(良性结节 恶性结节)
[0079]
在甲状腺癌研究队列(包括甲状腺癌，良性甲状腺结节和健康对照，表3)中检测到了96种糖链结构，并根据这些直接检测到的糖链的结构特征和生物学合成途径计算得到91种派生糖链特征。由于派生特征汇总代表了直接检测到糖链的结构特征，并有助于解释结果和生物学效应，因此主要分析派生糖链特征。
[0080]
上述发现的91种派生糖链特征种中有23种派生糖链特征在健康对照和甲状腺结节间具有显著差异(表4)。结果显示，与健康对照相比，四天线复杂型糖链(ca4)、岩藻糖基化(cfa,a2fa，a2fa,a4f,a4l0f,a2lf)、岩藻糖基化且唾液酸化的二天线糖链上的半乳糖(a2fsg)、二天线糖链的唾液酸(a2l,a2fl)在甲状腺结节(良性结节 恶性结节)患者中显著降低；而一天线复杂型糖链(ca1)，四天线糖链中的半乳糖(a4g)、四天线糖链的唾液酸(a4s，a4f0s，a4f0gs，a4e,a4l,a4f0e,a4f0l,a4fge)在甲状腺结节(良性结节 恶性结节)患者中显著升高。根据受试者工作特征曲线(roc)测试结果，发现上述23种糖链派生特征能够分别有效区分健康对照和甲状腺结节(良性结节 恶性结节)。这些n-糖链特征可以作为甲状腺结节诊断的潜在标志物。表4列出了在健康、甲状腺良性结节、甲状腺恶性结节(甲状腺癌)间差异表达的派生糖链特征、对糖链特征的描述、派生糖链在各组中表达量的median值、各组比较的p值、应用受试者特征工作曲线(roc)区分健康和甲状腺结节所得的auc值。表5为不同糖链特征组合用于区分甲状腺结节(良性结节 恶性结节)与健康对照的效果。
[0081]
表4在甲状腺癌队列各组(甲状腺癌tc、良性结节btn、健康对照hc)间差异表达的派生糖链特征
[0082]
[0083][0084]
表5糖链特征组合区分甲状腺结节(良性结节 恶性结节)与健康对照的效果
[0085][0086]
实施例2标志物用于区分甲状腺恶性结节(甲状腺癌)和甲状腺良性结节
[0087]
在甲状腺癌研究队列(包括甲状腺癌，良性甲状腺结节和健康对照，表3)中检测到了96种糖链结构，并根据这些直接检测到的糖链的结构特征和生物学合成途径计算得到91种派生糖链特征。由于派生特征汇总代表了直接检测到糖链的结构特征，并有助于解释结果和生物学效应，因此主要分析派生糖链特征。
[0088]
上述发现的91种派生糖链特征种中有4种派生糖链特征，即cfa,a2fa,a2l,a2gl的median值在甲状腺恶性结节、良性结节和健康对照中呈现连续变化，每组间差异极其显著(t检验，p《0.0001)(表6，图3)。roc评估上述4种糖链特征区分良恶性甲状腺结节所得auc均在0.7以上(图4，表6)，证明体液糖组指标中上述4种n-糖链标志物能够有效地对甲状腺结节进行良恶判别。4种糖链特征组合应用时，区分准确度进一步提高(表6)。
[0089]
表6糖链特征及其组合区分良恶性甲状腺结节以及区分甲状腺癌与非癌对照(良性结节 健康对照)的效果
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实施例3标志物用于区分甲状腺癌和非癌对照(良性结节 健康对照)
[0092]
分析方法同实施例2，cfa,a2fa,a2l,a2gl这4种派生糖链特征的median值在甲状腺癌和非癌对照(良性结节 健康对照)间差异极其显著(t检验，p《0.0001)。roc评估上述4种糖链特征区分甲状腺癌和非癌对照所得auc均在0.8以上(图5，表6)，证明体液糖组指标cfa,a2fa,a2l,a2gl能够高准确性地区分甲状腺癌和非癌对照。4种糖链特征组合应用时，区分准确度进步一提高(表6)。
[0093]
实施例4标志物用于区分发生和未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌
[0094]
在甲状腺癌研究队列(包括甲状腺癌，良性甲状腺结节和健康对照，表3)中检测到了96种糖链结构，并根据这些直接检测到的糖链的结构特征和生物学合成途径计算得到91种派生糖链特征。由于派生特征汇总代表了直接检测到糖链的结构特征，并有助于解释结果和生物学效应，因此主要分析派生糖链特征。
[0095]
上述发现的91种派生糖链特征种中有4种派生糖链特征，即a2lf，a3f0l、a2f0l和a2f0gl与甲状腺癌颈部淋巴结转移高度相关(逻辑回归分析，p《0.01)。将a2lf，a3f0l、a2f0l和a2f0gl联合使用，区分发生和未发生颈部淋巴结转移的甲状腺癌所得auc为0.7645(图6，表7)，证明体液糖组指标a2lf，a3f0l、a2f0l和a2f0gl能够有效区发生和未发生颈部淋巴结转移。目前临床上应用超声区分甲状腺癌患者是否发生颈部淋巴结转移，对超声检测的auc进行分析，结果显示超声区分甲状腺癌患者是否发生颈部淋巴结转移的auc值为0.6170，表明预测结果无效(“auc《0.7”代表无效)，而a2lf，a3f0l、a2f0l和a2f0gl与超声联合，预测准确度进一步提高，auc为0.7645(表7)
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表7糖链区分发生和未发生颈部淋巴结转移的效果
[0097][0098]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。