一种异羟肟酸型铁载体在富集环境中抗生素抗性基因携带细菌中的应用

1.本发明涉及一种异羟肟酸型铁载体应用，具体涉及一种利用异羟肟酸型铁载体原位富集环境中抗生素抗性基因携带细菌的应用方法，属于土壤和水体修复技术领域。


背景技术：

2.抗生素抗性基因(args)在抗生素被发现前就已广泛存在于环境微生物中。近年来由于物种的迁移、进化以及抗生素的滥用，加速了args在全球环境中扩散传播，目前已成为了一种严重危害全球环境、公共卫生以及人体健康的新污染物。
3.args在环境中的主要载体是某些致病微生物，例如：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等，这些致病菌均携带着多种抗生素抗性基因。因此，人们为了去除环境中这些携带着args的致病菌开发了一系列杀菌药物，抗生素就是其中一类。但是由于抗生素的滥用，诱导携带args的细菌逐步进化成“超级细菌”，最终会导致无药可用。故又发展出了杀菌材料，如纳米银杀菌材料等。但这些杀菌材料不具有选择性，去除携带着args的致病微生物的同时也会将有益的微生物一并杀死，破坏了土壤或水体等环境介质中原有的生态平衡。因此，急需发展一种原位富集的技术，选择性的将携带args的致害微生物从环境介质中去除，既不危害其他有益微生物，也不破坏环境介质中相应生态位的平衡。
4.至今为止，国内外已经有大量研究表明微生物会对一些特定的化合物产生趋化性，也就是细菌趋向于有利的化学物质、规避有害的化学物质的本能(sampedroinmaculada,et al.pseudomonas chemotaxis,fems microbiology reviews,(39)2015,17-46)。铁载体是微生物在限铁条件下产生的一类有机小分子，它对环境中的fe
3
有着极强的螯合性，可以作为微生物获取环境中有限铁资源的公共产品。铁载体因结构差异性一般分为异羟肟酸型、儿茶酚型、羧酸盐型等三种类型。因此，大部分微生物会对特定的铁载体产生特定的化学趋向性。目前，学者们主要关注于人工合成铁载体与抗生素或重金属结合靶向杀灭某种抗生素抗性菌的研究(apurvapandey,et al.theranostic gallium siderophore ciprofloxacin conjugate with broad spectrum antibiotic potency,j.med.chem,(62)2019,9947-9960.madhuri k.pawar,et al.selective ciprofloxacin antibiotic detection by fluorescent siderophorepyoverdin,biosensors and bioelectronics,(81)2016,274-279.)，目前，还没有利用微生物产生的铁载体直接用于降低环境中args及其携带细菌的相关报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种异羟肟酸型铁载体在原位富集环境中抗生素抗性基因携带细菌方面的应用，充分利用环境中抗生素抗性基因携带细菌对特殊异羟肟酸型铁载体具有较高的化学趋向性，以此实现原位富集环境介质中抗生素抗性基因携带细菌，使用异羟肟酸型铁载体后能明显降低周围土壤或水环境中
抗生素抗性基因及其携带细菌的丰度与相对丰度，该应用方法成本低廉，操作简便，无二次污染。
6.为了实现上述技术目的，本发明提供了一种异羟肟酸型铁载体的应用，其应用于富集环中的抗生素抗性基因携带细菌；
7.所述异羟肟酸型铁载体具有以下结构：
[0008][0009]
本发明的关键是在于发现环境中抗生素抗性基因携带细菌对上述特殊结构的异羟肟酸型铁载体具有较高的选择性化学趋向性，从而可以将异羟肟酸型铁载体添加到土壤或水体等环境中以实现原位富集环境介质中抗生素抗性基因携带细菌，达到降低周围土壤或水环境中抗生素抗性基因及其携带细菌的丰度与相对丰度的目的。
[0010]
作为一个优选的方案，将包含异羟肟酸型铁载体的制剂添加在环境中原位吸附富集抗生素抗性基因携带细菌。
[0011]
作为一个优选的方案，所述制剂包含葡萄糖和fecl3·
6h2o。
[0012]
作为一个优选的方案，所述制剂中葡萄糖浓度为0.5～1g/l，fecl3·
6h2o浓度为0.00135～0.002g/l，异羟肟酸型铁载体浓度为50～100mg/l。
[0013]
作为一个优选的方案，所述环境为土壤环境或水体环境。作为一个较优选的方案，所述水体环境为黑臭水体。作为一个较优选的方案，所述土壤环境为稻田土壤或设施农业土壤。
[0014]
本发明涉及的异羟肟酸型铁载体是通过微生物产生(参见cn112725221a)，具体微生物来源：荧光假单胞菌hmp01(pseudomonas fluorescens strain hmp01)，保藏编号cctcc no:m 20191131，其16s rdna部分序列在ncbi genbank登录号：mn689650.1。
[0015]
本发明涉及的异羟肟酸型铁载体的获得方法：将荧光假单胞菌置于缺铁无机盐培养基中培养，缺铁无机盐培养基具体组成为：乙酸钠3～7g/l、磷酸二氢钾0.5～1g/l、硫酸铵0.2～0.5g/l、硝酸钠0.2～0.5g/l、氯化钙0.01～0.02g/l、硫酸镁0.01～0.02g/l培养条件为：在28～32℃温度下培养72～96h，在培养基中产生异羟肟酸型铁载体。
[0016]
本发明涉及的异羟肟酸型铁载体在使用过程中制成制剂，具体制剂组成为：0.5～
1g葡萄糖，0.00135～0.002g/l fecl3·
6h2o，50～100mg/l异羟肟酸型铁载体。
[0017]
本发明涉及的异羟肟酸型铁载体制剂用于原位富集环境中抗生素抗性基因携带细菌过程为：将异羟肟酸型铁载体制剂，采用0.22μm有机系滤头过滤灭菌，装入经酒精基础灭菌后的6号塑封袋内，用0.3mm无菌针头在塑封袋两面适当位置扎孔，后将塑封袋埋入土壤或放入水体环境中，48h后取出。
[0018]
相对于现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：
[0019]
1.本发明的异羟肟酸型铁载体由细菌代谢产生，对环境友好，易于获得，成本低廉。
[0020]
2.本发明的异羟肟酸型铁载体使用方法简便，容易实施，可用于大批量生产和实际环境的应用。
[0021]
3.本发明的异羟肟酸型铁载体对环境中的抗生素抗性基因携带细菌具有较高的选择性和较高的富集能力，且对影响环境中的有益细菌影响较少，相对于以往的修复方法具有更高的选择性，能很好地解决现有环境中args及其携带细菌带来的生态风险，且使用过程不会对环境产生二次污染，绿色环保。
附图说明
[0022]
图1为在富营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集稻田土壤中抗生素抗性基因图，(a)多黏菌素类抗生素抗性基因(mcr)、(b)四环素类抗生素抗性基因(tetx)、(c)磺胺类抗生素抗性基因(dfra14)、(d)喹诺酮类抗生素抗性基因(qnrb-q)、(e)氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)；由图可知，hds富集抗生素抗性基因的效果高于对照组。
[0023]
图2为在寡营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集稻田土壤中抗生素抗性基因图，(a)氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、(b)喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、(c)β-内酰胺类抗生素抗性基因(kpc)；由图可知，hds富集apha、oqxa的效果高于对照组。
[0024]
图3为利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集抗生素抗性基因后稻田土壤中抗生素抗性基因的丰度及相对丰度，(a)丰度、(b)相对丰度；由图可知，hds处理后稻田土壤中喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)的相对丰度下降了91.8％、67.5％。
[0025]
图4为在富营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集设施农业土壤中抗生素抗性基因图，(a)氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、(b)喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、(c)四环素类抗生素抗性基因(teta)、(d)多黏菌素类抗生素抗性基因(mcr)；由图可知，hds富集apha、oqxa、mcr的效果高于对照组，而对teta的富集效果与对照组相似。
[0026]
图5为在寡营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集设施农业土壤中抗生素抗性基因图，(a)氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、(b)喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、(c)四环素类抗生素抗性基因(teta)、(d)β-内酰胺类抗生素抗性基因(kpc)；由图可知，hds富集oqxa、teta、kpc的效果高于对照组，而对apha的富集效果与对照组相似。
[0027]
图6为利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集抗生素抗性基因后设施农业土壤中抗生素抗性基因的丰度及相对丰度，(a)丰度、(b)相对丰度；由图可知，hds处理后大棚土中喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、四环素类抗生素抗性基因(teta)的相对丰度下降了78.7％、81.3％、91％。
[0028]
图7为在富营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集黑臭水体中抗生素抗性基因图，(a)喹诺酮类抗生素抗性基因(qnrb-q)、(b)喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、(c)磺胺类抗生素抗性基因(dfra14)、(d)碳青霉烯类抗生素抗性基因(ndm)、(e)四环素类抗生素抗性基因(teta)、(f)四环素类抗生素抗性基因(tetx)；由图可知，hds富集抗生素抗性基因的效果高于对照组。
[0029]
图8为在寡营养体系中异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集黑臭水体中抗生素抗性基因图，(a)喹诺酮类抗生素抗性基因(qnrb-q)、(b)喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、(c)碳青霉烯类抗生素抗性基因(ndm)；由图可知，hds富集抗生素抗性基因的效果高于对照组。
[0030]
图9为利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集抗生素抗性基因后黑臭水体中抗生素抗性基因的丰度及相对丰度，(a)丰度、(b)相对丰度；由图可知，hds处理后水中喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、碳青霉烯类抗生素抗性基因(ndm)以及β-内酰胺类抗生素抗性基因(kpc)的相对丰度下降了58.6％、81.3％、92.4％。
[0031]
图10为细菌对hds趋化性图，(a)假单胞菌属(pseudomonas)、(b)寡养单胞菌属(stenotrophomanas)、(c)代尔夫特菌属(delftia)、(d)假单胞菌属(pseudomonas)、(e)假单胞菌属(pseudomonas)、(f)大肠杆菌dh5α(e.colidh5)；由图可知，纯化出的5种菌株对铁载体都有着明显的趋向性，而不含抗生素抗性基因的e.colidh5α对铁载体的趋向性弱于前面5种抗生素抗性基因携带菌。
具体实施方式
[0032]
下面结合实施例及附图进一步说明本发明的技术方案，但本发明的实施方法不限于此。
[0033]
以下具体实施例中的异羟肟酸型铁载体由以下具体方法制备得到：将荧光假单胞菌从固体的lb培养皿上挑菌加至缺铁的无机盐培养基(培养基主要成分及浓度：乙酸钠5g/l、磷酸二氢钾0.75g/l、硫酸铵0.3g/l、硝酸钠0.3g/l、氯化钙0.015g/l、硫酸镁0.015g/l)，置于30℃的恒温气浴摇床150r/min培养80h，然后将菌液在8000r/min的高速离心机中离心10min，取上清液加一定量预先活化的大孔树脂xad-2置于摇瓶中150r/min摇2h，用铬天青s染液检测上清液铁载体活性，待大孔树脂充分吸附铁载体后置于淋洗柱中，用50％的甲醇洗脱，收集淋洗液，用旋转蒸发仪将淋洗液浓缩，待浓缩至2ml时回收并用冷冻真空干燥机冻干，收集得到的异羟肟酸型铁载体粉末。
[0034]
实施例1
[0035]
利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集稻田土壤中抗生素抗性基因携带菌：
[0036]
实验所用的土壤均为实地采集，其中共检测到了喹诺酮类抗生素抗性基因(qnrb-q、oqxa)、氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、多黏菌素类抗生素抗性基因(mcr)、四环素类抗生素抗性基因(tetx)以及磺胺类抗生素抗性基因(dfra14)这6种抗生素抗性基因。
[0037]
第一步，准备分别装有异羟肟酸型铁载体制剂(含有50mg/l异羟肟酸型铁载体、1g/l葡萄糖、0.00135g/l fecl3·
6h2o)和无菌水空白组(含有1g/l葡萄糖、0.00135g/l fecl3·
6h2o)的6号塑封袋各两个，用直径为0.3mm无菌针头在塑封袋两面适当位置扎孔后埋入土壤中，48h后取出。
[0038]
第二步，将上一步取出的四个塑封袋中剩余的液体用无菌0.22μm水系滤头过滤，
充分截留袋内微生物，再将滤头分别放入富营养培养基(lb培养基)和寡营养培养基(培养基中有机碳浓度低于1mg/l)中进行孵育直至od
600
为1.5。
[0039]
第三步，提取不同培养基中混合细菌基因组dna，以混合细菌基因组dna为模板，用不同抗生素抗性基因引物对模板进行pcr扩增，pcr扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，后续对跑出条带的抗生素抗性基因引物通过荧光定量qpcr定量。
[0040]
第四步，根据本实验结果可知，对照组富集了qnrb-q、apha、kpc共3种抗生素抗性基因，hds富集了qnrb-q、oqxa、apha、mcr、tetx、dfra14共6种抗生素抗性基因，其中hds富集qnrb-q、apha的效果相比于对照组分别提高了290％、940％。
[0041]
实施例2
[0042]
利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集设施农业土壤中抗生素抗性基因携带菌：
[0043]
实验前期富集工作直接在设施农业土壤中进行，在该土壤中共检测到喹诺酮类抗生素抗性基因(oqxa)、氨基糖苷类抗生素抗性基因(apha)、多黏菌素类抗生素抗性基因(mcr)、四环素类抗生素抗性基因(teta)、β-内酰胺类抗生素抗性基因(kpc)这5种抗生素抗性基因。
[0044]
该实施例后续实验方法与实施例1相同。
[0045]
根据本实验结果可知，对照组富集了oqxa、apha、teta共3种抗生素抗性基因，hds富集了oqxa、apha、mcr、teta、kpc共5种抗性基因，其中hds富集oqxa、apha、teta的效果相比于对照组分别提高了103％、409％、36132％。
[0046]
实施例3
[0047]
利用异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集黑臭水体中抗生素抗性基因携带菌：
[0048]
实验前期富集工作直接在黑臭水体内进行，在该黑臭水体中共检测到喹诺酮类抗生素抗性基因(qnrb-q、oqxa)、磺胺类抗生素抗性基因(dfra14)、碳青霉烯类抗生素抗性基因(ndm)、多黏菌素类抗生素抗性基因(mcr)、四环素类抗生素抗性基因(tetx、teta)这7种抗生素抗性基因。
[0049]
准备分别装有异羟肟酸型铁载体制剂(含有50mg/l异羟肟酸型铁载体、1g/l葡萄糖、0.00135g/l fecl3·
6h2o)和无菌水空白组(含有1g/l葡萄糖、0.00135g/l fecl3·
6h2o)的6号塑封袋各两个，用直径为0.3mm无菌针头在塑封袋两面适当位置扎孔后埋入土壤中，48h后取出。
[0050]
该实施例后续实验方法与实施例1相同。
[0051]
根据本实验结果可知，对照组富集了qnrb-q、oqxa、dfra14、ndm共4种抗生素抗性基因，hds富集了qnrb-q、oqxa、dfra14、mcr、tetx、teta共6种抗性基因，且hds富集qnrb-q、oqxa、ndm、dfra14的效果相比于对照组分别提高了1074.5％、2370％、482.5％、333％。
[0052]
实施例4
[0053]
将异羟肟酸型铁载体(hds)原位富集的抗生素抗性基因携带细菌纯化鉴定并检验其对hds的趋向性：
[0054]
实验一共纯化出了5种菌株，提取这些菌株的细菌基因组dna，以菌株的基因组dna为模板，以通用引物27f和1492r扩增该菌株的16srdna基因。pcr扩增后的16s rdna产物送上海生物工程有限公司测序。这5种菌株的基本信息如表1。
[0055]
菌株对铁载体的趋化性实验方法主要为：
[0056]
第一步，将纯菌株接入lb培养基置于恒温振荡器中，在150r/min、30℃下振荡孵育4h。取1ml菌液于无菌的1.5ml ep管中，在12000r/min下离心1min，弃掉上清液，接着用pbs缓冲液清洗三遍，最后在pbs缓冲液中制成100μl细菌悬液(细菌数约107cfu/ml)。用0.2ml的ep管盛装100μl细菌悬液最后用封口膜将管口封住。
[0057]
第二步，将异羟肟酸型铁载体水溶液配制成25、50、75、100mg/l，以pbs缓冲液、无菌水为空白对照，将这六种溶液分别取200μl于1ml无菌注射器中。
[0058]
第三步，以长为16mm、直径为0.45mm的针头作为趋化毛细管，并与装有上述溶液的注射器连接，最后水平的将针头插入0.2ml的ep管中，并放入30℃的恒温培养箱中2h。
[0059]
第四步，将针头注射器从细菌悬浮液中取出，注射器内的液体稀释后涂布于1.5％琼脂凝固的lb培养基上。注射器中细菌的积累计算为三次重复板上获得的平均数。相对趋化性指数(rci)计算为进入试验注射器内细菌的积累值与pbs对照注射器内细菌的累计值的比值。rci为2或更大表明趋化性显著。
[0060]
第五步，根据实验结果可知，5种菌株对铁载体都有着明显的趋向性，其中假单胞菌属(pseudomonas)、代尔夫特菌属(delftia)对铁载体的趋向性比较好，而寡养单胞菌属(stenotrophomanas)对铁载体的趋向性相对较弱，但整体都呈现了明显的趋向性。但是不含抗生素抗性基因的e.colidh5α对铁载体的趋向性弱于前面5种抗生素抗性基因携带菌。
[0061]
表1为5种菌株的基本信息
[0062]