一组颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物及其应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一组颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物及其应用。


背景技术：

2.颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,ia)是以颅内动脉局部瘤状突起为特征的脑血管疾病，其病因涉及到多种环境和遗传因素。颅内动脉瘤在中国人群中的患病率约为5％，在脑血管意外中，颅内动脉瘤仅次于脑梗死和高血压脑出血，位居第三，但其手术的风险性、术后的致残率、致死率远高于脑梗死和高血压脑出血，是严重威胁人民健康的常见脑血管疾病。在破裂出血之前，90％的颅内动脉瘤病人没有明显的症状和体征，只有极少数病人因动脉瘤影响到邻近神经或脑部结构而产生特殊的症状，如头痛或眶周痛、视力障碍、眼睑下垂、一侧脸麻木或面瘫等。颅内动脉瘤病程的隐匿性导致颅内动脉瘤的早期诊断存在困难，而一旦动脉瘤破裂发病，其致死率、致残率极高，给患者、家庭、社会造成沉重的压力。据国外研究显示，颅内动脉瘤的总体年破裂风险为0.95％-2％，至少80％以上的颅内动脉瘤没有破裂风险，属于稳定型颅内动脉瘤，只需定期观察即可，过度治疗引发的术中风险及并发症反而会增加患者负担。对于此类颅内动脉瘤，关键在于及早检出并进行定期监测、随访，对其破裂风险做出准确的预测。
3.目前，对颅内动脉瘤的诊断和筛选主要依赖脑血管造影(dsa)、磁共振血管造影(mra)以及ct血管造影(cta)，上述三种方法均存在费用昂贵和假阴性高的缺点，且往往需要患者住院检查。对颅内动脉瘤破裂风险的的预测，也主要借助影像学的方法，根据动脉瘤的大小、形态、位置，建立评分方法，进行判定。从动脉瘤的发生到最终破裂的过程，是组织力学与细胞内信号转导相互作用引发的一系列血管壁内部的组织生物学变化。因此，除了通过影像学的监测，还迫切需要筛选出一组特异性强、精确度高的生物标志物，用于颅内动脉瘤早期诊断、动态监测、破裂风险预测。早干预、早治疗，可减少颅内动脉瘤破裂出血给患者带来的巨大风险。
4.代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分，其通过细胞、有机体分泌出的小分子代谢物解析被研究对象的生理、病理状态及其与环境因子、基因组成等的关系，已在临床诊断、药物开发、毒理学、生理学、病理学等研究领域得到了广泛的应用。通过代谢组学的方法寻找疾病相关的代谢物是探究疾病发生机制以及实现疾病早期诊断及疾病风险预测的重要手段。但目前尚未见到有关颅内动脉瘤早期诊断及破裂风险预测的血浆代谢标志物的相关报道。
5.针对现有颅内动脉瘤诊断生物标志物及其检测方法，生物标志物类型主要为基因及其表达产物，如(tff2/znrd1/odam/dmbx1/cxcl16/cd11a等)、micro rna(mir-628-3p/mir-505-5p/mir-497-5p等)、snp标志物(arhgap32)等。上述生物标志物主要以组织(动脉组织、动脉瘤壁、颅内动脉瘤组织、动脉瘤滑膜组织)及外周血作为检测样本类型。以组织为检测样本类型的生物标志物，为有创检测，无法用于颅内动脉瘤的早期筛查、诊断。以外周
血为检测样本类型的生物标志物，需通过基因组dna提取-测序/芯片检测、rna提取-逆转录-扩增、免疫反应等完成，流程复杂，耗时长，对样本的保存要求较高。且上述检测方法大多以单一蛋白、单一基因为检测标志物，方法的特异性和精确度较低，无法满足临床更高的需求和大规模的人群精准筛查。针对现有通过质谱、芯片、高通量测序平台、试剂盒、试纸进行血清标志物—蛋白因子联合检测，以诊断颅内动脉瘤及预测颅内动脉瘤破裂潜能的方法，该方法一定程度上解决了有创性检查的不足，但是针对大分子的检测方法对样本的保存条件要求较高且流程复杂，耗时长，极易受到血清高丰度蛋白的干扰，影响检测的特异性和精确度，因此此类血清蛋白因子检测方法也有一定的局限性。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一组颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物。
7.本发明的另一目的在于提供上述颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：一组颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物，包括氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌、吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚中的一种或多种。
9.所述颅内动脉瘤相关为颅内动脉瘤早期诊断及破裂风险预测。
10.优选地，所述颅内动脉瘤早期诊断的血浆代谢标志物，包括氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌中的一种或多种；更优选地，为以上六种血浆代谢标志物的组合。
11.优选地，所述破裂风险预测的血浆代谢标志物，包括吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚中的一种或多种；更优选地，为以上六种血浆代谢标志物的组合。
12.上述颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物在颅内动脉瘤早期诊断及破裂风险预测中的应用。
13.上述颅内动脉瘤相关的血浆代谢标志物的检测试剂在制备颅内动脉瘤早期诊断产品和/或破裂风险预测产品中的应用。
14.所述产品包括试剂盒或试纸。
15.所述产品含有特异性识别血浆代谢产物的试剂。
16.所述产品中含有标准品或阳性对照。
17.一种颅内动脉瘤早期诊断试剂盒，包括氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌或其组合的特异性检测试剂。
18.一种颅内动脉瘤破裂风险预测试剂盒，包括吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚或其组合的特异性检测试剂。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.1、本发明以血浆作为检测物，此类样本的获得具有无创性，且更容易获得，可用于大规模人群筛查，利于颅内动脉瘤的早期诊断及动态监测，降低颅内动脉瘤破裂给患者带来的巨大风险。
21.2、本发明以小分子代谢物作为诊断标志物，一方面检测方法较为简单，可用于快速诊断领域。另一方面可以避免大分子的检测方法对样本的保存条件要求较高，极易受到血清、血浆高丰度蛋白干扰的缺陷，提升检测的特异性和精确度。采用一组代谢标志物联合诊断时，可有效提高检测的特异性和精准度。
22.3、与蛋白、基因相比，以代谢物作为疾病诊断标志物有一定的优越性：1)代谢物的种类远少于基因和蛋白，大约在103数量级；2)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢水平得到放大，代谢物的变化动态性更强，对生物体变化的反映更加灵敏；3)代谢物是机体变化的最终结果，更能准确反映机体的状态；4)代谢物不仅能反映机体自身的功能变化，还能反映环境对机体产生的影响。
附图说明
23.图1为实施例的方案流程图。
24.图2为实施例中破裂型颅内动脉瘤患者组、无症状未破裂型颅内动脉瘤患者组与健康人群组的主成分分析(pca)结果图。
25.图3为实施例中建立的正交偏最小二乘判别分析opls-da得分图；其中，a为健康人群组vs无症状未破裂型颅内动脉瘤患者组建立的opls-da得分图，b为无症状未破裂型颅内动脉瘤患者组vs破裂型颅内动脉瘤患者组建立的opls-da得分图。
26.图4为实施例中建立的opls-da模型的置换检验图；其中，a为健康人群组vs无症状未破裂型颅内动脉瘤患者组建立的opls-da模型的置换检验图，b为无症状未破裂型颅内动脉瘤患者组vs破裂型颅内动脉瘤患者组建立的opls-da模型的置换检验图。
27.图5为实施例中工作特征曲线(roc)分析结果图；其中，a为氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌六种代谢标志物联合使用对颅内动脉瘤患者早期诊断的受试者工作特征曲线(roc)分析结果图，b为吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚六种代谢标志物联合使用对颅内动脉瘤患者破裂风险预测的受试者工作特征曲线(roc)分析结果图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1：破裂型颅内动脉瘤患者、无症状未破裂型颅内动脉瘤患者及健康人之间血浆差异代谢物的筛选及表征
30.一、实验仪器和试剂
31.数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquidchromatography，uplc)(ex-ionlcad)、四级杆飞行时间质谱(quadrupole-time of flight)(tripletof 6600,ab sciex)和串联质谱(tandem mass spectrometry，ms/ms)(qtrap
⑧
)。色谱柱采用waters acquityuplc hss t3 c18 1.8μm，2.1mm*100mm。
32.色谱纯级别甲醇、乙腈购自merck公司，色谱纯级别甲酸购自aladdin公司。
33.二、实验方法
34.1、样本获得
35.本研究通过南方医科大学珠江医院伦理委员会审批(伦理意见书编号—2021-ky-038-02)，所有纳入的人群已填写知情同意书。以影像学检查结果及临床表现和诊断为依据，收集2020年以来在南方医科大学珠江医院收治入院的颅内动脉瘤患者44例。从南方医科大学珠江医院健康体检中心收集健康志愿者27例作为正常对照组。所有颅内动脉瘤患者及健康志愿者均无其他代谢性疾病。颅内动脉瘤患者分为破裂型颅内动脉瘤患者(ruptured intracranial aneurysms,rias)16例及无症状未破裂型颅内动脉瘤患者(asymptomatic unruptured intracranial aneurysms,asymptomatic-uias)28例。
36.所有血样采集于患者/健康人清晨空腹状态下，每个研究对象采集静脉血5ml置于edta抗凝采血管中，采集后于4℃条件下3000rpm离心10min，吸取上清(血浆)，分装后立即于-80℃冰箱内冷冻保存。
37.2、实验设计
38.颅内动脉瘤早期诊断模型构建：从28例无症状未破裂型颅内动脉瘤患者及27例健康志愿者的血浆代谢物中寻找差异代谢物，用于构建颅内动脉瘤早期诊断模型。
39.颅内动脉瘤破裂风险预测模型构建：从16例破裂型颅内动脉瘤患者及28例无症状未破裂型颅内动脉瘤患者的血浆代谢物中寻找差异代谢物，用于构建颅内动脉瘤破裂风险预测模型。
40.3、样本制备
41.血浆样本71份(包括28例无症状未破裂型颅内动脉瘤患者、16例破裂型颅内动脉瘤患者、27例健康志愿者)从-80℃冰箱中取出后置于冰上解冻(后续操作都要求在冰上进行)，涡旋混匀10s后取50ul样本加入到对应编号的1.5ml离心管中，加入300ul纯甲醇内标提取液，涡旋3min混匀，12000rpm离心10min(4℃)，取上清液200ul到另一个对应编号的1.5ml离心管中，静置于-20℃冰箱中30min，12000rpm离心3min(4℃)，取150ul上清液于对应进样瓶内衬管中，用于上机分析。
42.质控样本(quality control，qc)：从所有血浆样本(包括28例无症状未破裂型颅内动脉瘤患者、16例破裂型颅内动脉瘤患者、27例健康志愿者，共计71份)中分别吸取5ul混合于一个1.5ml离心管中，涡旋混匀，按照上述同样方法进行qc样本前处理后得到。
43.4、样本中代谢物的检测方法
44.4.1非靶向检测采集条件
45.数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)(exionlc ad)和四级杆飞行时间质谱(quadrupole-time of flight)(tripletof 6600，ab sciex)。液相色谱条件主要包括：色谱柱：acquity hss t3(2.1
×
100mm，1.8um)；流动相a：0.1％甲酸/水；流动相b：0.1％甲酸/乙睛；柱温：40℃；流速：0.40ml/min；进样量：5ul。
46.4.2广泛靶向检测采集条件
47.数据采集仪器系统主要包括超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，uplc)(exionlc ad)和串联质谱(tandem mass spectrometry，ms/ms)()。
curve，受试者工作特征曲线，简称roc曲线)评估。使用r语言包proc分别绘制颅内动脉瘤早期诊断模型、颅内动脉瘤破裂风险预测模型的roc曲线并计算相应的roc曲线与横坐标之间的面积即曲线下面积(area under curve，auc)。使用t检验对代谢标志物进行显著性分析。分别提取代谢标志物在各组中的样本，运用r语言中的t检验程序对这两组数据进行分析并计算p-value。图1是以上实验的方案流程图。
63.三、实验结果
64.通过主成分分析(pca)和构建opls-da模型(如图2、3、4)可以看出，破裂型颅内动脉瘤患者、无症状未破裂型颅内动脉瘤患者、健康人群均能明显分开，各自聚集，表明此三类人群的的代谢谱具有明显差异。
65.以vip＞1.0，并结合p＜0.05，fold change＞1.5来寻找差异性表达代谢物。进一步使用最小绝对收缩与选择算子算法(lasso)和随机森林(rf)选择差异代谢物。再将两种算法筛选到的差异代谢物通过取交集的方式得到最佳生物标志物。在无症状未破裂型颅内动脉瘤组与健康人群组的差异代谢物中筛选得到6个代谢标志物，分别为：氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌(表1)。与健康人群组相比，氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、多巴醌在无症状未破裂型颅内动脉瘤组血浆中显著上调，曲二糖、d-松二糖在无症状未破裂型颅内动脉瘤组血浆中显著下调，可以作为颅内动脉瘤早期诊断的代谢标志物。在破裂型颅内动脉瘤组与无症状未破裂型颅内动脉瘤组的差异代谢物中筛选得到6个显著差异代谢标志物，分别为：吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚(表2)。与无症状未破裂型颅内动脉瘤组相比，n-棕榈酰甘氨酸在破裂型颅内动脉瘤组血浆中显著上调，吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚在破裂型颅内动脉瘤组血浆中显著下调，可以作为颅内动脉瘤破裂风险预测的代谢标志物。
66.表1
[0067][0068]
表2
[0069][0070]
进一步通过绘制roc曲线检验上述代谢标志物对颅内动脉瘤早期诊断及破裂风险预测的准确率。结果见图5：氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌联合用于颅内动脉瘤早期诊断，roc曲线下面积(auc)为0.925(0.852-0.998)；吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚联合用于颅内动脉瘤破裂风险预测，roc曲线下面积(auc)为0.967(0.912-1.000)。上述两组代谢标志物分别用于颅内动脉瘤早期诊断及破裂风险预测，总体auc均达0.9以上，诊断准确率较好。
[0071]
综上可见，氧化型谷胱氨肽、还原型谷胱甘肽、甲基β-d-吡喃半乳糖苷、曲二糖、d-松二糖、多巴醌可联合用于颅内动脉瘤早期诊断；吲哚乙醛、5,6-二甲基苯并咪唑、n-棕榈酰甘氨酸、尿嘧啶、吲哚-3-乙酸、1-乙酰吲哚可联合用于颅内动脉瘤破裂风险预测，诊断准确性较高；可以将其开发成颅内动脉瘤早期诊断及颅内动脉瘤破裂风险预测的检测试剂盒，用于颅内动脉瘤的早期筛查诊断及颅内动脉瘤破裂风险精准预测，降低颅内动脉瘤给患者带来的巨大风险。
[0072]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。