一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法与流程

一种抗手足口病毒
γ
蛋白液体制剂的制备方法
技术领域
1.本技术涉及生物医药技术领域，更具体地说，它涉及一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法。


背景技术：

2.手足口病（hfmd)是一种由肠道病毒引发的急性发热性疾病，在全世界5岁以下的儿童中很常见，特征是在手掌，足掌和口腔内出现水疱疹，并有可能出现中枢神经系统并发症，个别重症患儿如果病情发展迅速可导致死亡。引起hfmd的主要病原体为肠道病毒71型（ev71）和柯萨奇病毒a16型(cva16）。ev71引发的hfmd较为严重，它可以合并中枢神经系统并发症并有可能导致死亡，而cva16引发的hfmd通常导致的症状较轻微，并且发病率和死亡率要低得多口。
3.目前，临床上尚无特效的治疗手足口病的药物。现有疫苗也仅见对单一肠道引起的hfmd提供保护，对多型肠道病毒引发的hfmd治疗效果不明显。因此，以抗病毒治疗及对症治疗为主，寻找可靠有效的治疗手足口病的方法显得尤为重要。鸡卵黄抗体（immunoglobulinyolk，igy），又名γ蛋白，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强、不与igg发生交叉血清学反应；且性能稳定，活性保持良好等优点，正成为医药领域的新热点，具有广阔的应用前景。因此，抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的研制对手足口病的预防具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了解决相关技术中无特效的治疗手足口病的药物，本技术提供了一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，该工艺制得的γ蛋白液体制剂对肠道病毒71型和柯萨奇病毒a16型的抑制效果相似，对手足口病治疗具有重要意义。
5.本技术提供了一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，采用如下的技术方案：一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，具体包括以制备下步骤：s1：制备抗手足口病毒γ蛋白；s2：按重量百分比计，称取液体制剂制备用原料：包括抗手足口病毒γ蛋白0.1-2%、防腐剂0.1-2%、中和剂1-20%、赋形剂0.1-3%、ph调节剂0.1-2%、乳化剂0.1-2%、余量为水；s3：制备抗手足口病毒γ蛋白液体制剂：s3.1：取1/2-3/4体积的水，加入抗手足口病毒γ蛋白，第一次搅拌混合，加入中和剂和ph调节剂继续第二次搅拌混合，得均一溶液经真空脱泡后保温备用；s3.2：将防腐剂、赋形剂和乳化剂共同加入到剩余水中，第一次搅拌混合均匀后，加入步骤s3.1中的均一溶液，第二次搅拌混合即得所需的抗手足口病毒γ蛋白液体制剂。
6.通过采用上述技术方案，先制备抗手足口病毒γ蛋白，然后将其与中和剂复配，加
ph调节剂调节后，获得均一溶液；将剩余原料混合均匀后，对均一溶液进行混合包覆，制得所需的液体制剂；本技术制得的液体制剂对单一肠道病毒和多型肠道病毒引发的hfmd均有明显的治疗效果，通过将抗手足口病毒γ蛋白与中和剂共用，能够确保提高抗手足口病毒γ蛋白活性的同时，提高液体制剂的吸收利用率，增强其对手足口病毒的抑制效果。
7.优选的，所述步骤s1中制备抗手足口病毒γ蛋白，具体包括以下操作：准备抗原、佐剂配伍形成免疫疫苗、鸡接种疫苗、蛋黄分割和抗手足口病毒γ蛋白分离。
8.优选的，所述抗原包括等量的肠道病毒71型抗原和柯萨奇病毒a16型抗原。
9.优选的，所述佐剂配伍形成免疫疫苗具体指：按质量比1:1，将手足口病病毒抗原与佐剂充分乳化制得免疫疫苗。
10.通过采用上述技术方案，将手足口病病毒抗原与佐剂复配制得所需的免疫疫苗，将上述免疫疫苗用于产蛋母鸡注射，即可获得免疫鸡蛋。
11.优选的，所述佐剂由质量比1.2-1.7:4.5-6.5:0.3-0.8:1.5-3的羟基磷灰石、0.8-1.5mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合复配而得。
12.优选的，所述佐剂由以下方法制得：将羟基磷灰石、磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯按上述比重混合研磨均匀即得。
13.通过采用上述技术方案，本技术采用自制佐剂，通过控制佐剂的原料选用和配比，将羟基磷灰石、磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合复配制得抗原用佐剂，所述佐剂与抗原混合后，能够有效吸附抗原，保持抗原的生物活性，延长抗原在鸡体内的贮存时间，同时能够达到缓慢释放抗原，延长抗原的作用时间，增强免疫效果。
14.优选的，所述鸡接种疫苗的接种方案如下：共免疫3次，每次间隔3-4周，初次免疫和第二次免疫的免疫剂量为0.025mg/只；第二次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测；第三次免疫的免疫剂量为0.25mg/只，第三次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测。
15.通过采用上述技术方案，本技术的鸡接种疫苗方案中，免疫3次即可获得所需的高效价免疫鸡蛋，疫苗用量少，免疫周期短，免疫效果显著。
16.优选的，所述抗手足口病毒γ蛋白分离具体指：将经蛋黄分割获得的卵黄加7-10倍的去离子水，于32-45℃的温度下，边搅拌边调节ph值至4.8-5.5，搅拌均匀后静置收集上清液，将上清液经超滤膜过滤提纯，即得所需的抗手足口病毒γ蛋白。
17.通过采用上述技术方案，本技术采用的抗手足口病毒γ蛋白分离方法简单，操作条件温和，操作成本低，分离提纯效果好。
18.优选的，所述步骤s2中防腐剂包括质量比3-7:1-1.8的山梨酸钾和桉叶油；中和剂包括质量比1-10:1-10:1-3:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮；赋形剂为麦芽糖糊精、蔗糖糊精、蜂蜜中的至少一种；ph调节剂为质量分数10%的氢氧化钠溶液；乳化剂为卡波姆、羊毛脂、三乙醇胺中的至少一种。
19.通过采用上述技术方案，山梨酸钾和桉叶油复配用于延长液体制剂的保存期限，具有用量少，成分安全抑菌抗菌效果显著的特点；甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮复配用作中和剂，该中和剂具有强的生物活性和抗菌抗病毒功效，能够促进血液循环，其呈脂溶性，与抗手足口病毒γ蛋白共用，能够有效包裹抗手足口病毒γ蛋白，进而提高抗体活
性，同时提高液体制剂的吸收利用率，增强其对手足口病毒的抑制效果；赋形剂、ph调节剂和乳化剂的选用，能够进一步增强对抗手足口病毒γ蛋白的包覆效果，确保包覆膜的穿透性，进而在有效延长液体制剂抑制病毒活性的同时，达到缓慢有效的抑制病毒效果。
20.优选的，所述步骤s2中按重量百分比计，原料包括：抗手足口病毒γ蛋白1%、防腐剂0.5%、中和剂10%、赋形剂2%、ph调节剂1.2%、乳化剂1%、余量为水。
21.通过采用上述技术方案，优选后的液体制剂配方吸收利用率最高，病毒抑制效果最好。
22.优选的，所述步骤s3.1中搅拌混合温度均为22-40℃，搅拌混合转速均为300-500r/min，第一次搅拌混合时间为20-40min，第二次搅拌混合时间为1-2h。
23.优选的，所述步骤s3.2中搅拌混合温度均为30-50℃，第一次搅拌混合转速为300-500r/min，第一次搅拌混合时间为20-40min，第二次搅拌混合转速为10-50r/min，第二次搅拌混合时间为1-2h。
24.通过采用上述技术方案，通过控制液体制剂过程中的混合工艺参数，能够在保证液体制剂生物活性的同时，控制抗手足口病毒γ蛋白的包覆效果，缩短制备周期，降低制备成本。
25.综上所述，本技术具有以下有益效果：1、本技术提出了一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，该方法制得的液体制剂对单一肠道病毒和多型肠道病毒引发的hfmd均有明显的治疗效果，其抗病毒活性高，保存期限长。
26.2、本技术提出的制备方法操作简单，制备条件温和，通过选用药用辅料赋形剂、中和剂、乳化剂等原料对抗手足口病毒γ蛋白进行包裹，能够有效提高抗手足口病毒γ蛋白的活性，同时提高液体制剂的吸收利用率，增强其对手足口病毒的缓慢有效抑制效果。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
28.制备例1-3提供了佐剂的制备方法。
29.制备例1按质量比1.2:4.5:0.3:1.5，将羟基磷灰石、0.8mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
30.制备例2按质量比3:11:1:5，将羟基磷灰石、1.2mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
31.制备例3按质量比1.7:6.5:0.8:3，将羟基磷灰石、1.5mol/l磷酸溶液、酪蛋白酸钠和甘油二酯混合研磨均匀即得所需佐剂。
32.制备例4-6提供了抗手足口病毒γ蛋白的制备方法，以下以制备例4为例进行说明。
33.制备例4制备抗手足口病毒γ蛋白，具体包括以下操作：准备抗原、佐剂配伍形成免疫疫
苗、鸡接种疫苗、蛋黄分割和抗手足口病毒γ蛋白分离；外购肠道病毒71型抗原和柯萨奇病毒a16型抗原，将等量的肠道病毒71型抗原和柯萨奇病毒a16型抗原混合获得将手足口病病毒抗原；按质量比1:1，将手足口病病毒抗原与制备例1制备的佐剂充分乳化制得免疫疫苗，将上述免疫疫苗用于产蛋母鸡注射，鸡接种疫苗的接种方案如下，共免疫3次，每次间隔3周，初次免疫和第二次免疫的免疫剂量为0.025mg/只；第二次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测；第三次免疫的免疫剂量为0.25mg/只，第三次免疫后1周，采集鸡蛋，并做好标记，实验室检测，即可获得免疫鸡蛋；将免疫鸡蛋进行蛋黄分割，将经蛋黄分割获得的卵黄加7倍的去离子水，于32℃的温度下，边搅拌边调节ph值至4.8，搅拌均匀后静置收集上清液，将上清液经超滤膜过滤提纯，即得所需的抗手足口病毒γ蛋白。
34.制备例 5-6，同制备例4，不同之处仅在于：制备过程中的工艺参数不同，具体见表1。
35.表1：工艺参数制备例4制备例5制备例6佐剂制备例1制备例2制备例3免疫周期334去离子水倍数7810搅拌温度32℃38℃45℃ph值4.85.15.5实施例1-5提供了一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，以下以实施例1为例进行说明。
36.实施例1本技术提供了一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，采用如下的技术方案：一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法，具体包括以下步骤：s1：按上述制备例4制备抗手足口病毒γ蛋白；s2：按重量百分比计，称取液体制剂制备用原料：包括抗手足口病毒γ蛋白0.1%、防腐剂0.1%、中和剂1%、赋形剂0.1%、ph调节剂0.1%、乳化剂0.1%、余量为水；s3：制备抗手足口病毒γ蛋白液体制剂：s3.1：取1/2体积的水，加入抗手足口病毒γ蛋白，控制搅拌温度为22℃，搅拌混合转速为500r/min，第一次搅拌混合20min后，加入中和剂和ph调节剂继续第二次搅拌混合1h，得均一溶液经真空脱泡后保温备用；s3.2：将防腐剂、赋形剂和乳化剂共同加入到剩余水中，控制搅拌混合温度为30℃，第一次搅拌混合转速为500r/min，第一次搅拌混合20min后，加入步骤s3.1中的均一溶液，控制第二次搅拌混合转速为10r/min，第二次搅拌混合2h，即得所需的抗手足口病毒γ蛋白液体制剂。
37.实施例2-5，同实施例1，不同之处仅在于：制备原料选用及选用百分比不同，制备工艺参数不同，具体见表2。
38.表2：
原料选用实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5抗手足口病毒γ蛋白制备例4制备例5制备例6制备例4制备例5防腐剂3:1的山梨酸钾和桉叶油4:1的山梨酸钾和桉叶油5:1.5的山梨酸钾和桉叶油6:1的山梨酸钾和桉叶油7:1.8的山梨酸钾和桉叶油中和剂1:10:3:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮5:1:1:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮5:5:2:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮10:1:2:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮10:10:3:1的甘油、低聚木糖、黄芪多糖和枳实总黄酮赋形剂麦芽糖糊精蔗糖糊精1:1的麦芽糖糊精和蜂蜜蜂蜜1:1的蔗糖糊精和蜂蜜ph调节剂质量分数10%的氢氧化钠溶液质量分数10%的氢氧化钠溶液质量分数10%的氢氧化钠溶液质量分数10%的氢氧化钠溶液质量分数10%的氢氧化钠溶液乳化剂羊毛脂卡波姆3:1的卡波姆和三乙醇胺三乙醇胺1:1的羊毛脂和卡波姆原料用量实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5抗手足口病毒γ蛋白0.1%0.5%1%1.5%2%防腐剂0.1%1%0.5%1.5%2%中和剂1%5 %赋形剂0.1%1%2%2.5%3%ph调节剂0.1%0.5%1.2%1.5%2%乳化剂0.1%0.5%1%1.5%2%水补至100%补至100%补至100%补至100%补至100%工艺参数实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5s3.1水用量1/23/41/23/41/2s3.1中搅拌混合温度22℃26℃30℃35℃40℃s3.1中搅拌混合转速500r/min450r/min400r/min350r/min300r/mins3.1中第一次搅拌时间20min25min30min35min40mins3.1中第一次搅拌时间1h1.2h1.5h1.8h2hs3.2中搅拌混合温度50℃45℃40℃35℃30℃s3.2中第一次搅拌转速500r/min450r/min400r/min350r/min300r/mins3.2中第一次搅拌时间20min25min30min35min40mins3.2中第二次搅拌转速10r/min20r/min30r/min40r/min50r/mins3.2中第二次搅拌时间2h1.8h1.5h1.2h1h
为了验证本技术提供的一种抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的制备方法制得的液体制剂的性能，申请人设置了对比例1-7，其中：对比例1，同实施例3，不同之处仅在于：采用制备6的方法制备抗手足口病毒γ蛋白时，将本技术制备例3中的佐剂替换为完全弗氏佐剂。
39.对比例2，同实施例3，不同之处仅在于：采用制备6的方法制备抗手足口病毒γ蛋白时，将本技术制备例3中的佐剂替换为由质量比1.7:6.5:3的羟基磷灰石、磷酸溶液和甘油二酯混合研磨制得的佐剂。
40.对比例3，同实施例3，不同之处仅在于：防腐剂为山梨酸钾。
41.对比例4，同实施例3，不同之处仅在于：防腐剂为桉叶油。
42.对比例5，同实施例3，不同之处仅在于：中和剂由质量比1:1的甘油和低聚木糖复配而得。
43.对比例6，同实施例3，不同之处仅在于：中和剂由质量比2:1的黄芪多糖和枳实总
黄酮复配而得。
44.对比例7，同实施例3，不同之处仅在于：s3.2中第二次搅拌转速为400r/min。
45.分析本技术实施例1-5和对比例1-7中制得的抗手足口病毒γ蛋白液体制剂的缓释效果和抑制病毒活性：1. 实施例1-5和对比例1-7中制得的抗手足口病毒γ蛋白液体制剂在人工胃液中缓释测试称取上述液体制剂各10ml，分别分散于10ml人工胃液（胃蛋白酶10g/l，ph=1.2）中，转速150rpm/min，37℃，每隔30min吸取100ul，针孔过滤，测溶液中抗手足口病毒γ蛋白含量，采用γ蛋白定量试剂盒检测该抗手足口病毒γ蛋白液体制剂在人工胃液中释放量，结果见表3。
46.表3：由上述表3显示结果可知：本技术实施例1-5和对比例1-6中制得的液体制剂释放缓慢，且总体平稳，缓释效果好。对比例7制得的液体制剂，释放速度快，4h释放率即超过90%，缓释效果较实施例与其余对比例大大下降。
47.实施例1-5和对比例1-7中制得的抗手足口病毒γ蛋白液体制剂抗病毒活性测试。
48.在96孔板中每孔加入150μl vero细胞约2
×
105个，其中对照组1加入50μlpbs缓冲溶液，对照组2加入25μl ev71和cva16混合病毒液和25μlpbs缓冲溶液，实施例1-5和对比例1-7组分别加入25μl ev71和cva16混合病毒液和25μl对应的液体制剂（3g/l），在37℃，co2培养箱中培养，48h后观察结果如下：其中，对照组1为正常vero细胞，对照组2为被ev71和cva16混合病毒感染48h后的
vero细胞，对照组2中约54%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；实施例1-5中细胞生长良好，均免受ev71和cva16混合感染致死；对比例1中约14%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例2约9%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例3约15%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例4约16%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例5约19%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例6约15%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡；对比例7约8%细胞悬浮，变圆，聚集，死亡。
49.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。