一种脂肪间充质干细胞保存液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞保存液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.间充质干细胞(msc，mesenchymalstemcells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，在骨髓、脐血、脂肪中具有发现，是多能干细胞，因其具有多向分化潜能受到人们的关注。mscs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞。
3.脂肪间充质干细胞(adipose-derived stemcells，adscs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，可以分化成骨细胞、软骨细胞脂肪细胞等。脂肪间充质干细胞具有诸多优势，如来源广泛，易于分离获取，不涉及伦理问题等，近年来成为临床研究应用的热点。
4.直接自体分离的脂肪间充质干细胞由于数量的有限，远远不能满足临床应用需求，需要对分离得到的脂肪间充质干细胞进行体外扩增，脂肪间充质干细胞的体外培养周期较长，往往需要3-4周的培养时间才能得到足够数量的细胞，对于培养得到的细胞有时会面临需要短时间保存的情况。现有的保存方法是在添加冻存保护剂的情况下在液氮中保存，采用液氮保存细胞对操作过程和冻存设备要求较高，并且会对细胞造成损伤，影响细胞活性。对于需要短时间临时保存的细胞增加了保存成本。
5.因此，有必要研究一种保存液，在保证细胞活性的情况下实现细胞在常温下的保存，为脂肪间充质干细胞的临时保存提供保障。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞保存液，能够实现在4℃条件下脂肪间充质干细胞的保存，保存后的脂肪间充质干细胞活性不受影响。
7.本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞保存液的制备方法。
8.本发明的目的之三在于提供一种上述脂肪间充质干细胞保存液的应用。
9.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
10.一种脂肪间充质干细胞保存液，包括以下成分：基础培养基、海藻糖、云芝糖肽、羟乙基淀粉、马粟树籽提取物、腺苷、l-谷氨酰胺。
11.优先地，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
12.优先地，各成分在培养基中的终浓度为：海藻糖15-20μg/ml、云芝糖肽9-13μg/ml、羟乙基淀粉1-5mg/ml、马粟树籽提取物3-7μg/ml、腺苷10-15μg/ml、l-谷氨酰胺8-14μg/ml。
13.优先地，各成分在培养基中的终浓度为：海藻糖17μg/ml、云芝糖肽10μg/ml、羟乙基淀粉3mg/ml、马粟树籽提取物5μg/ml、腺苷12μg/ml、l-谷氨酰胺12μg/ml。
14.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
15.上述脂肪间充质干细胞保存液的制备方法，包括以下过程：向基础培养基中加入海藻糖、云芝糖肽、马粟树籽提取物、羟乙基淀粉、腺苷、l-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，过滤除菌，在4-6℃下保存，即得。
16.优先地，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
17.本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
18.一种脂肪间充质干细胞保存液的应用，将脂肪间充质干细胞重悬在保存液中，在4℃条件下保存。
19.优先地，保存液中脂肪间充质干细胞的密度为2-5
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106个/ml。
20.相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞保存液，实现了在4℃保存脂肪间充质干细胞，在保存72h后脂肪间充质干细胞的存活率在90％以上，充分满足临床的保存需求，本发明的保存液降低了对脂肪间充质干细胞保存条件的要求，对于需要短途运输的脂肪间充质干细胞可以采用本发明的保存液，降低保存运输的成本。
21.本发明还提供一种脂肪间充质干细胞保存液的制备方法，过程简便，易于操作。本发明还提供了上述保存液的具体应用，将其用于脂肪间充质干细胞的保存中，细胞活性基本不受影响。
附图说明
22.图1为本发明实施例1至实施例3，对比例1至对比例5的保存液用于脂肪间充质干细胞的保存时，随着保存时间的变化细胞的存活率。
具体实施方式
23.下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
24.实施例1
25.一种脂肪间充质干细胞保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：海藻糖、云芝糖肽、羟乙基淀粉、马粟树籽提取物、腺苷、l-谷氨酰胺，各成分在培养基中的终浓度为：海藻糖17μg/ml、云芝糖肽10μg/ml、羟乙基淀粉3mg/ml、马粟树籽提取物5μg/ml、腺苷12μg/ml、l-谷氨酰胺12μg/ml。
26.一种脂肪间充质干细胞保存液的制备方法，包括以下过程：向dmem/f12培养基中加入海藻糖、云芝糖肽、马粟树籽提取物、羟乙基淀粉、腺苷、l-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下保存，即得。
27.实施例2
28.一种脂肪间充质干细胞保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：海藻糖、云芝糖肽、羟乙基淀粉、马粟树籽提取物、腺苷、l-谷氨酰胺，各成分在培养基中的终浓度为：各成分在培养基中的终浓度为：海藻糖15μg/ml、云芝糖肽9μg/ml、羟乙基淀粉1mg/ml、马粟树籽提取物3μg/ml、腺苷10μg/ml、l-谷氨酰胺8μg/ml。
29.一种脂肪间充质干细胞保存液的制备方法，包括以下过程：向dmem/f12培养基中加入海藻糖、云芝糖肽、马粟树籽提取物、羟乙基淀粉、腺苷、l-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在6℃下保存，即得。
30.实施例3
31.一种脂肪间充质干细胞保存液，由dmem/f12培养基和添加在培养基中的以下成分组成：海藻糖、云芝糖肽、羟乙基淀粉、马粟树籽提取物、腺苷、l-谷氨酰胺，各成分在培养基中的终浓度为：各成分在培养基中的终浓度为：海藻糖20μg/ml、云芝糖肽13μg/ml、羟乙基淀粉5mg/ml、马粟树籽提取物7μg/ml、腺苷15μg/ml、l-谷氨酰胺14μg/ml。
32.一种脂肪间充质干细胞保存液的制备方法，包括以下过程：向dmem/f12培养基中加入海藻糖、云芝糖肽、马粟树籽提取物、羟乙基淀粉、腺苷、l-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在4℃下保存，即得。
33.对比例1
34.对比例1提供一种脂肪间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去云芝糖肽、马粟树籽提取物，其余均和实施例1相同。
35.对比例2
36.对比例2提供一种脂肪间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去云芝糖肽，其余均和实施例1相同。
37.对比例3
38.对比例3提供一种脂肪间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去马粟树籽提取物，其余均和实施例1相同。
39.对比例4
40.对比例4提供一种脂肪间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去马粟树籽提取物，将云芝糖肽的用量调整为15μg/ml，其余均和实施例1相同。
41.对比例5
42.对比例5提供一种脂肪间充质干细胞保存液，和实施例1的区别为：省去云芝糖肽，将马粟树籽提取物的用量调整为15μg/ml，其余均和实施例1相同。
43.试验例
44.取脂肪组织加入等体积的pbs洗涤，离心后收集上次脂肪组织，重复清洗三次，向上述脂肪组织中加入0.25％的i型胶原酶，消化30min，完成后离心，加入含10％fbs的dmem/f12培养基重悬细胞，接种至t75培养瓶中在37℃，5％co2的培养箱中培养，待细胞汇合度至80％后加入0.25％胰酶消化，进行传代培养，取传代培养得到的第3代脂肪间充质干细胞进行保存实验。
45.将上述培养得到的脂肪间充质干细胞采用实施例1至实施例3，对比例1至对比例5的保存液重悬，分装在冻存管中，每管1ml，细胞密度为3
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106个/ml，在4℃的条件下保存，每隔24h取样，采用台盼蓝染色法检测细胞的存活率，用全自动细胞计数仪countstar检测细胞成团率，细胞存活率结果如图1所示，细胞成团率结果如表1所示。
46.表1
[0047][0048]
由表1可以看出随着保存时间的延长，细胞的成团率增加，其中实施例1至实施例3中细胞成团率低于对比例1至对比例5。对比例1至5中分别省去云芝糖肽、马粟树籽提取物中的一种或者多种，无论是否调整剩余成分的用量，细胞的成团率均高于实施例1，说明本发明的保存液可以降低脂肪间充质干细胞在保存过程中的成团率，延长细胞的保存时间。
[0049]
由图1可以看出随着保存时间的延长，细胞的存活率呈现下降趋势，但是不同的保存液中的细胞存活率的下降程度不同。实施例1至实施例3保存液中的细胞在4℃保存72h后细胞的存活率均在90％以上，在保存96h后细胞的存活率在84％以上，充分满足临床的使用需求。对比例1中省去了云芝糖肽、马粟树籽提取物，细胞在保存72h后细胞存活率仅为67.49％，下降显著。对比例2和对比例3中分别省去了云芝糖肽、马粟树籽提取物，细胞在保存72h后细胞存活率分别为81.58％，78.28％，在保存96h后细胞存活率仅为71.61％，67.05％，远远不及实施例1。对比例4和对比例5中分别在省去云芝糖肽、马粟树籽提取物后，增加了剩余成分的用量，细胞在保存72h后的存活率分别为75.44％，78.92％，在保存96h后细胞存活率仅为64.64％，66.45％，不能满足临床上对细胞活性的要求。
[0050]
取实施例1中保存72h后的细胞，恢复至室温后离心去除保存液，将细胞采用含10％fbs的dmem/f12培养基重悬，细胞密度为1
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104/ml，接种至12孔板中，每孔1ml，连续培养7天，统计培养得到的细胞数量，同时以未经保存的第3代脂肪间充质干细胞作为对照组，结果如表2所示。
[0051]
表2
[0052]
组别细胞数量(
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104个)实施例134.95对照组36.79
[0053]
由表2可以看出实施例1中经保存后的脂肪间充质干细胞的增殖活性和未经保存的细胞相差不大，由此可知本发明的保存液可以实现脂肪间充质干细胞在4℃的保存一定时间，在保存过程中细胞存活率和细胞增殖活性基本不受影响，适合用于脂肪间充质干细胞的短时间保存。
[0054]
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所
要求保护的范围。