用于治疗基于肌营养不良蛋白的肌病的靶向外显子44的核酸和包含所述核酸的重组腺相关病毒的制作方法

本申请要求于2018年8月2日提交的美国临时申请号62/882,216的优先权权益，其公开内容通过引用整体并入。

技术领域

本公开涉及用于治疗肌营养不良症的基因疗法领域。更具体地，本公开提供了核酸，包括编码基于U7的小核核糖核酸(RNA)(snRNA)(基于U7的snRNA)的核酸，以及重组腺相关病毒(rAAV)，其包含所述核酸分子以递送编码基于U7的snRNA的核酸，以诱导外显子跳跃，以用于治疗由适合DMD基因的外显子44(DMD外显子44)跳跃的突变引起的肌营养不良症，所述突变包括但不限于涉及、围绕或影响DMD外显子44的任何突变。

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背景技术

肌营养不良症(MD)是一组主要影响随意肌的遗传性退行性疾病。该组的特征在于控制运动的骨骼肌的进行性无力和退化。某些形式的MD在婴儿期或儿童期发展，而其它形式的MD直到中年或以后才可出现。病症在肌肉无力的分布和程度(某些形式的MD也影响心肌)、发病年龄、进展速度和遗传模式方面不同。

MD是一组没有可确定的治疗方法的疾病，严重影响个人、家庭和社区。代价是无法估量的。个人遭受与自尊丧失相关的情绪紧张和生活质量下降。由肢体功能丧失导致的极端身体挑战给日常生活活动带来困难。家庭动态受到经济损失和人际关系挑战的影响。受影响的兄弟姐妹感到疏远，并且配偶之间的冲突经常导致离婚，特别是在肌营养不良症的责任可以加在父母一方的身上时。寻找治愈方法的负担往往成为终生的、坚持不懈的努力，这削弱和挑战生活的方方面面。除了家庭之外，社区也承担经济负担，因为需要增加设施以适应肌营养不良症人群在特殊教育、特殊交通方面的障碍，以及治疗复发性呼吸道感染和心脏并发症的复发性住院费用。财政责任由州和联邦政府机构分担，这将责任延伸到纳税社区。

MD的一种形式是杜氏肌营养不良症(DMD)。它是肌营养不良症的最常见的严重儿童形式，每5000名新生男性中就有1人患病。DMD是由DMD基因的突变导致在骨骼肌和心肌以及胃肠道和视网膜中不存在肌营养不良蛋白(427KDa)引起的。肌营养不良蛋白不仅保护肌膜免于离心收缩，而且还锚定靠近肌膜的许多信号传导蛋白。MD的另一种形式是贝克型肌营养不良症(BMD)。与DMD一样，BMD是一种使身体的肌肉逐渐变得越来越弱和越来越小的遗传性病症。BMD影响臀部、骨盆、大腿和肩膀以及心脏的肌肉，但已知其引起的问题严重性低于DMD。

许多DMD临床病例与DMD基因的缺失突变有关。与缺失突变相比，在肌营养不良蛋白病患者的无偏样本中，DMD外显子重复占致病突变的大约5％[Dent等人,Am J Med Genet,134(3):295-298(2005)]，但是在一些突变目录中，重复的数量更高，包括由Flanigan等人的联合肌营养不良蛋白病项目(United Dystrophinopathy Project)公布的突变目录[Hum Mutat,30(12):1657-1666(2009)]，其中所述重复为11％。BMD也是由肌营养不良蛋白基因的导致蛋白质过短的变化引起的。有缺陷的肌营养不良蛋白使肌肉细胞面临在正常使用时受到损伤的风险。另外参见，2012年3月29日公布的美国专利申请公布2012/0077860；2013年3月21日公布的2013/0072541；以及2013年2月21日公布的2013/0045538。

外显子45的缺失是DMD患者中存在的最常见缺失之一，而外显子44和45的缺失通常与BMD相关[Anthony等人,JAMA Neurol 71:32–40(2014)]。因此，如果在这些DMD患者的前信使RNA(mRNA)转录物中可以绕过外显子44，这将恢复阅读框并能够产生部分功能性的BMD样肌营养不良蛋白[Aartsma-Rus等人,Nucleic Acid Ther 27(5):251–259(2017)]。事实上，似乎许多在与外显子45毗邻处具有缺失的患者自发地跳跃外显子44，尽管水平非常低。这导致肌营养不良蛋白的水平与携带其他缺失的DMD患者相比略有增加，并且很可能是与具有其他缺失的DMD患者相比在这些患者中观察到的不那么严重的疾病进展的基础[Anthony等人,同上；Pane等人,PLoS One 9:e83400(2014)；van den Bergen等人,J Neuromuscul Dis 1:91–94(2014)]。

尽管在鉴定DMD基因后进行了许多研究，但治疗选择仍然有限。因此，本领域仍然有治疗MD(包括DMD)的需求。最先进的疗法包括旨在使用突变特异性遗传方法，诸如反义寡核苷酸(AON)介导的外显子跳跃恢复缺失蛋白(肌营养不良蛋白)的那些。

技术实现要素：

本公开提供了用于新基因疗法的产品、方法和用途，所述新基因疗法用于治疗、改善肌营养不良症、延迟其进展和/或预防所述肌营养不良症，所述肌营养不良症涉及适合DMD基因的外显子44(DMD外显子44)跳跃的突变，包括但不限于涉及、围绕或影响DMD外显子44的任何突变。更具体地，本公开提供了核酸，基于U7的小核核糖核酸(RNA)(snRNA)，以及重组腺相关病毒(rAAV)，所述病毒包含所述核酸分子以递送编码基于U7的snRNA的核酸，以诱导外显子跳跃，提供肌营养不良蛋白的改变形式，以用于治疗由DMD外显子44的复制、外显子43或45的缺失或外显子45-56的缺失引起的肌营养不良症。

本公开提供了一种与编码DMD基因的外显子44的多核苷酸结合或互补的核酸分子，其中编码DMD外显子44的多核苷酸包含SEQ ID NO:1或2中列出的核苷酸序列或由其组成或编码SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。

本公开提供了一种核酸分子，其与SEQ ID NO:4、5、6、7、32、33、34或35中列出的核苷酸序列中的至少一个结合或互补。

本公开提供了一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、32、33、34或35中列出的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。本公开提供了一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、32、33、34或35中列出的核苷酸序列或由其组成。

本公开提供了一种核酸分子，其包含与SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中列出的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列或由其组成。本公开提供了一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中列出的核苷酸序列或由其组成。

本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)，其包含基因组，所述基因组含有本文公开或描述的核酸分子中的至少一种。在一些方面，本公开提供了一种rAAV，其中rAAV的基因组是自我互补基因组或单链基因组。在一些方面，rAAV是rAAV-1、rAAV-2、rAAV-3、rAAV-4、rAAV-5、rAAV-6、rAAV-7、rAAV-8、rAAV-9、rAAV-10、rAAV-11、rAAV-12、rAAV-13、rAAV-rh74或rAAV-anc80。在一些方面，本公开提供了一种rAAV，其中rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA。在一些方面，本公开提供了一种rAAV，其中rAAV还包含AAV-1衣壳、AAV-2衣壳、AAV-3衣壳、AAV-4衣壳、AAV-5衣壳、AAV-6衣壳、AAV-7衣壳、AAV-8衣壳、AAV-9衣壳、AAV-10衣壳、AAV-11衣壳、AAV-12衣壳、AAV-13衣壳、AAV-rh74衣壳，或AAV-anc80衣壳。

本公开提供了用于诱导细胞中的DMD基因的外显子44的跳跃的方法。在一些方面，所述方法包括向细胞提供本文公开或描述的核酸分子中的至少一种。在一些方面，所述方法包括向细胞提供本文公开或描述的核酸分子中的多于一种。在一些方面，所述方法包括向细胞提供包含本文公开或描述的核酸分子中的至少一种的rAAV。在一些方面，所述方法包括向细胞提供包含本文公开或描述的核酸分子中的多于一种的rAAV。

本公开提供了用于治疗、改善和/或预防具有适合DMD外显子44跳跃的任何突变的受试者的肌营养不良症的方法，其包括向受试者施用本文公开或描述的核酸分子中的至少一种。在一些方面，所述方法包括向受试者施用包含本文公开或描述的核酸分子中的至少一种的rAAV。在一些方面，所述方法包括向受试者施用包含本文公开或描述的核酸分子中的多于一种的rAAV。在一些方面，适合DMD外显子44跳跃的突变是DMD基因序列中涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变。在一些方面，突变是外显子1-43、2-43、3-43、4-43、5-43、6-43、7-43、8-43、9-43、10-43、11-43、12-43、13-43、14-43、15-43、16-43、17-43、18-43、19-43、20-43、21-43、22-43、23-43、24-43、25-43、26-43、27-43、28-43、29-43、30-43、31-43、32-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、39-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-46、45-47、45-48、45-49、45-50、45-51、45-52、45-53、45-54、45-55、45-56、45-57、45-58、45-59、45-60、45-61、45-62、45-63、45-64、45-65、45-66、45-67、45-68、45-69、45-70、45-71、45-72、45-73、45-74、45-75、45-76、45-77和45-78的缺失，和/或外显子44的重复。在一些方面，突变是DMD外显子44的重复、外显子43或45的缺失，或外显子45-56的缺失。在一些方面，施用导致受试者的肌营养不良蛋白的表达增加，包括但不限于肌营养不良蛋白的改变形式或肌营养不良蛋白的功能活性改变形式或片段的表达增加。在一些方面，施用抑制受试者的营养不良性病理的进展。在一些方面，施用改善受试者的肌肉功能。在一些方面，肌肉功能的这种改善是肌肉力量(muscle strength)的改善。在一些方面，肌肉功能的这种改善是站立和行走稳定性的改善。

本公开提供了本文公开或描述的核酸分子中的至少一种用于诱导细胞中的DMD基因的外显子44跳跃的用途。在一些方面，细胞存在于受试者体内或从具有涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变的受试者中分离。在一些方面，核酸分子提供于rAAV中。在一些方面，本文公开或描述的各种核酸分子中的多于一种或本文公开或描述的各种核酸分子的组合提供于rAAV中。

本公开提供了本文公开或描述的核酸分子中的至少一种在治疗、改善和/或预防具有涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变的受试者的肌营养不良症中的用途。本公开包括本文公开或描述的核酸分子中的至少一种在制备用于治疗、改善和/或预防具有涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变的受试者的肌营养不良症的药物中的用途。在一些方面，核酸分子提供于rAAV中。在一些方面，本文公开或描述的各种核酸分子中的多于一种或本文公开或描述的各种核酸分子的组合提供于rAAV中。在一些方面，突变是序列中涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变。在一些方面，突变是DMD外显子44的重复、外显子43或45的缺失，或外显子45-56的缺失。在一些方面，所述用途导致肌营养不良蛋白的表达增加或具有肌营养不良蛋白的功能活性的肌营养不良蛋白的改变形式的表达增加。在一些方面，所述用途抑制营养不良性病理的进展。在一些方面，所述用途改善肌肉功能。在一些方面，肌肉功能的改善是肌肉力量的改善。在一些方面，肌肉功能的改善是站立和行走稳定性的改善。

本公开的其他特征和优点将从以下附图说明和具体实施方式中变得显而易见。然而，应当理解，附图、具体实施方式和具体实例虽然指示所公开主题的实施方案，但仅通过例示的方式给出，因为在本公开的精神和范围内的各种变化和修改将由该具体实施方式而变得对本领域技术人员显而易见。

附图说明

图1A-F示出用各种病毒构建体转导Del45-56 FibroMyoD、Del45 FibroMyoD和Dup44 FibroMyoD之后人DMD外显子44的外显子跳跃。图1A示出用SD44、LESE44或SESE44构建体处理的Del45-56 FibroMyoD的RT-PCR结果[Del45-56(未处理)和Del 44-56(经处理)]。用SD44处理的Del45-56 FibroMyoD表现出外显子跳跃，如Del44-56中的强条带所示。用LESE44或SESE44处理的Del45-56 FibroMyoD表现出部分外显子跳跃，如Del45-56和Del44-56中的条带所示。图1B示出用LESE44、SESE44、SD44和BP43AS44构建体处理的Del45 FibroMyoD的RT-PCR[Del45(未处理)和Del 44-45(经处理)]。尽管所有经过处理的FibroMyoD均表现出外显子跳跃，但SD44显示出最大量的外显子跳跃。图1C示出用SD44、BP43AS44和LESE44构建体处理的Dup44 FibroMyoD的RT-PCR[Del45(未处理)和Del 44-45(经处理)]。尽管所有经过处理的FibroMyoD均表现出外显子跳跃，但SD44似乎显示出最大量的外显子跳跃。图1D示出用SD44、4X-SD44或SD44-填充序列(SD44-stuffer)构建体处理的Del45-56 FibroMyoD的RT-PCR结果[Del45-56(未处理)和Del 44-56(经处理)]。用所有构建体处理的Del45-56 FibroMyoD均显示出强外显子跳跃，如所有三个构建体中Del44-56的强条带所示，其中在用4X-SD44和SD44-填充序列构建体处理的FibroMyoD中存在最强条带。图1E示出用4X-SD44、SD44-填充序列和SD44构建体处理的Del45 FibroMyoD的RT-PCR[Del45(未处理)和Del 44-45(经处理)]。所有经过处理的FibroMyoD均在Del45 FibroMyoD中表现出强外显子44跳跃。图1E示出用SD44-填充序列、4X-SD44和SD44构建体处理的Dup44 FibroMyoD的RT-PCR[Del45(未处理)和Del 44-45(经处理)]。所有经过处理的FibroMyoD均表现出强外显子跳跃，其中SD44-填充序列和4X-SD44在这些实验中显示出最大量的外显子跳跃。

图2示出在注射三种不同的rAAV病毒载体后一个月，3月龄的hDMDdel45/mdx小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人DMD外显子44的有效跳跃。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。这些RT-PCR结果表明，在小鼠#57和#58(未处理的hDMDdel45/mdx小鼠)中不存在外显子跳跃；在小鼠#60和#61(注射了U7-SD44-填充序列(SEQ ID NO:27)的hDMDdel45/mdx小鼠)中存在有效的外显子跳跃；在小鼠#66和#72(注射了U7-SD44(SEQ ID NO:23)的hDMDdel45/mdx小鼠)中存在有效的外显子跳跃；并且在小鼠#84(注射了U7-4x-SD44(SEQ ID NO:26)的hDMDdel45/mdx小鼠)中存在有效的外显子跳跃。Black 6(Bl6)小鼠是不含人DMD基因的野生型小鼠，并且因此是人DMD的阴性对照。

图3A-E示出在注射三种不同的rAAV病毒载体后一个月，3月龄的hDMD/mdx del45小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人肌营养不良蛋白的免疫荧光表达。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。这些免疫荧光结果获自#58(未处理小鼠)；小鼠#72(注射了U7-SD44(SEQ ID NO:23)的小鼠；图3C)；小鼠#60(注射了U7-SD44-填充序列(SEQ ID NO:27)的小鼠；图3D)；以及小鼠#84(注射了U7-4x-SD44(SEQ ID NO:26)的小鼠；图3E)。Bl6是不含人DMD基因的野生型小鼠，但该免疫荧光实验中使用的抗体识别人和小鼠肌营养不良蛋白两者。处理一个月后，免疫染色表明，在用所有三种rAAV病毒载体进行病毒感染后，肌营养不良蛋白均表达，其中SD44-填充序列载体(图3D)和4X-SD44载体(图3E)似乎导致肌肉中最高水平的肌营养不良蛋白表达。图3A示出在未处理的hDMDdel45/mdx小鼠中没有肌营养不良蛋白表达。图3B示出Bl6模型中的肌营养不良蛋白表达，因为抗体与小鼠肌营养不良蛋白反应。

图4示出在注射三种不同的rAAV病毒载体后一个月，hDMD/mdx del45小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人肌营养不良蛋白的蛋白质印迹表达。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。一个月后，蛋白质印迹结果显示，在用所有三种rAAV病毒载体感染后，肌营养不良蛋白均表达，其中SD44填充序列载体似乎导致肌肉中最高水平的肌营养不良蛋白表达。这些蛋白质印迹结果获自小鼠#57和#58(未处理的hDMD/mdx del45小鼠)；小鼠#60和#61(注射了U7-SD44-填充序列(SEQ ID NO:27)的hDMD/mdx del45小鼠)；小鼠#66和#72(注射了U7-SD44(SEQ ID NO:23)的hDMD/mdx del45小鼠)以及小鼠#84(注射了U7-4x-SD44(SEQ ID NO:26)的hDMD/mdx del45小鼠)。Bl6是不含人DMD基因的野生型小鼠；然而，该蛋白质印迹中使用的抗体识别人和小鼠肌营养不良蛋白两者。使用辅肌动蛋白作为对照。

图5A-E示出在注射后三个月在hDMD/mdx del45小鼠的转导后人DMD外显子44的有效外显子跳跃、蛋白质恢复和肌力(muscle force)改善。图5A示出hDMD/mdx del45小鼠的RT-PCR结果。图5A示出在注射rAAV.U7_SD44填充序列病毒载体后三个月，3月龄的hDMDdel45/mdx小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人DMD外显子44的有效跳跃。在两只小鼠的每个胫骨前肌(TA)中进行实验(n＝6个TA肌肉)。这些RT-PCR结果表明在小鼠(未处理的hDMDdel45/mdx小鼠，n＝6个TA肌肉)中存在非常罕见的外显子跳跃；并且在小鼠(注射了rAAV.U7_SD44填充序列的hDMDdel45/mdx小鼠(n＝6个TA肌肉；SEQ ID NO:27))中存在有效的外显子跳跃。WT小鼠是不含人DMD基因，但含有小鼠DMD基因的野生型小鼠；因此，该WT小鼠是阳性对照。图5B示出在注射rAAV.U7_SD44填充序列后三个月，hDMD/mdx del45小鼠的TA肌肉中人肌营养不良蛋白的蛋白质印迹表达。在三只小鼠的每个TA中进行实验(n＝6个TA肌肉)。三个月后，蛋白质印迹结果显示，用rAAV.U7_SD44填充序列(SEQ ID NO:27)感染之后，肌营养不良蛋白表达。这些蛋白质印迹结果是从小鼠获得的，即注射的6个TA中的3个)。WT是不含人DMD基因的野生型小鼠；然而，该蛋白质印迹中使用的抗体识别人和小鼠肌营养不良蛋白两者。使用辅肌动蛋白作为对照。图5C-E示出注射rAAV.U7_SD44填充序列(SEQ ID NO:27)后三个月的肌力改善。图5C示出肌力(hang wire)的改善；图5D示出比力；并且图5E示出注射后三个月的离心收缩。

具体实施方式

本公开提供了用于治疗、改善涉及突变的肌营养不良症、延迟其进展和/或预防所述肌营养不良症的产品、方法和用途，所述突变涉及、围绕或影响DMD外显子44，包括但不限于DMD外显子44的复制、外显子43或45的缺失，或外显子45-56的缺失。已知最大的人基因DMD提供了用于产生被称为肌营养不良蛋白的蛋白质的指导。肌营养不良蛋白主要位于用于运动的肌肉(骨骼肌)和心脏肌肉(心肌)中。

更具体地，本公开提供了核酸，其包含被设计成结合DMD外显子44或DMD外显子44及其周围的内含子序列，以提供肌营养不良蛋白的改变形式，以用于治疗由涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变引起的肌营养不良症的序列。本公开提供了核酸，其包含编码和包含基于U7的小核核糖核酸(snRNA)(U7 snRNA)的核苷酸序列；以及载体，诸如重组腺相关病毒(rAAV)，其包含所述核酸以递送编码基于U7的snRNA的核酸，以诱导DMD外显子44的外显子跳跃，提供肌营养不良蛋白的改变形式，以用于治疗由涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变引起的肌营养不良症。外显子跳跃是用于纠正和恢复肌营养不良蛋白的产生的治疗方法。对于特定的基因突变，它允许身体产生更短的可用肌营养不良蛋白。虽然到目前为止外显子跳跃不能治愈DMD，但它可使DMD的影响不那么严重。

因此，本公开提供了用于治疗适合外显子44跳跃的任何突变的核酸。在一些方面，适合外显子44跳跃的这种突变是涉及、围绕或影响DMD外显子44的突变。适合外显子44跳跃的此类突变的实例包括但不限于在https colon-slash-slash-www.cureduchenne.org-slash-wp-content-slash-uploads-slash-2016-slash-11-slash-Duchenne-Population-Potentially-Amenable-to-Exon-Skipping-11.10.16.pdf上提供的那些。此类适合外显子44跳跃的突变包括但不限于外显子1-43、2-43、3-43、4-43、5-43、6-43、7-43、8-43、9-43、10-43、11-43、12-43、13-43、14-43、15-43、16-43、17-43、18-43、19-43、20-43、21-43、22-43、23-43、24-43、25-43、26-43、27-43、28-43、29-43、30-43、31-43、32-43、33-43、34-43、35-43、36-43、37-43、38-43、39-43、40-43、41-43、42-43、43、45、45-46、45-47、45-48、45-49、45-50、45-51、45-52、45-53、45-54、45-55、45-56、45-57、45-58、45-59、45-60、45-61、45-62、45-63、45-64、45-65、45-66、45-67、45-68、45-69、45-70、45-71、45-72、45-73、45-74、45-75、45-76、45-77和45-78的缺失，以及外显子44的重复。在一些方面，此类突变是DMD外显子44的重复、外显子43或45的缺失，或外显子45-56的缺失。本公开还提供了用于将本文所述的核酸递送给有需要的受试者的载体。

本公开提供了用于递送包含被设计成靶向外显子44或外显子44周围的内含子区域的反义序列或反义序列的反向互补序列的核酸(或核酸分子)的方法。本公开提供了用于递送包含靶向外显子44的反义序列的编码U7 snRNA的核酸分子(即，“靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体”)的方法。在一些方面，多核苷酸构建体插入病毒载体的基因组中以用于递送。在一些方面，用于递送靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体的载体是rAAV。

因此，本公开提供了一种用于递送U7小RNA启动子的rAAV，所述启动子将表达感兴趣的反义序列，从而介导外显子跳跃。这种方法的优点是rAAV病毒将有效地靶向受影响的肌肉，在那里它将递送外显子跳跃系统。

DMD基因是人体中已知的最大基因。其大小为240万个碱基对，包括79个外显子并且转录和共转录剪接需要16个小时以上。在一些方面，本公开涉及包含靶向DMD基因的外显子44的多核苷酸序列的核酸分子和包含此类核酸分子以诱导外显子44跳跃的载体。反义介导的外显子跳跃的基本原理是诱导靶标外显子的跳跃以恢复阅读框。DMD基因的外显子44的多核苷酸序列与其周围的内含子序列在SEQ ID NO:1中列出。大写的核苷酸表示外显子序列并且小写的核苷酸表示内含子序列。DMD基因的外显子44的多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出并由148个碱基对组成(美国专利公布2012/0059042)，并且外显子44的氨基酸序列在SEQ ID NO:3中列出。SEQ ID NO:2的第一个“G”是编码外显子43中的最终C末端氨基酸的末端核苷酸。因此，尽管“G”是SEQ ID NO:2中的第一个核苷酸，但外显子44由编码SEQ ID NO:3中的N末端“R”(精氨酸)的“CGA”开始编码。

本公开提供了一种或多种核酸(或核酸分子)，其包含被设计成靶向DMD基因的外显子44的反义核苷酸序列或由其组成。具有周围的内含子序列的DMD基因的外显子44包含SEQ ID NO:1中列出的核苷酸序列。DMD基因的外显子44包含SEQ ID NO:2中列出的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列。

在各个方面，本公开的方法还靶向在SEQ ID NO:1或2中列出的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的核苷酸序列的同种型和变体。在一些方面，变体与SEQ ID NO:1或2中列出的核苷酸序列或编码SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列的核苷酸序列包含99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％和70％的同一性。表1提供了人DMD外显子44及其周围的内含子区域的序列。

表1.人DMD外显子44–多核苷酸和氨基酸序列。

本公开包括各种核酸分子，其包含外显子44中和周围的各个区域的靶序列，包括表2中列出的有义和反义序列，以及它们在用于诱导细胞中的DMD基因的外显子44跳跃的方法中的用途。因此，本公开包括用于诱导细胞中的DMD基因的外显子44跳跃的方法和用途，其包括向细胞提供靶向外显子44的核酸分子，即“靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体”。因此，本公开提供了一种包含靶向外显子44的各个区域的反义序列和这些序列的反向互补序列的核酸分子。靶序列，即反义序列所靶向的外显子44的天然序列，包括但不限于SEQ ID NO:4中列出的序列[BP43AS44(分支点43受体位点44)靶序列]、SEQ ID NO:5[LESE44(长外显子剪接增强子44)靶序列]、SEQ ID NO:6[SESE44(短外显子剪接增强子44)靶序列]，或SEQ ID NO:7[SD44(剪接供体)靶序列]，或其变体。在一些方面，将这些靶序列插入编码U7的序列中，即SEQ ID NO:29。在一些方面，将这些反义序列插入编码U7的序列中，即SEQ ID NO:28。在一些方面，将这些序列的多个拷贝插入编码U7的序列中。本公开还提供了一种核酸分子，其包含靶向外显子44的各个区域的序列、靶序列的反向互补序列，以及在SEQ ID NO:32[BP43AS44靶序列的mRNA]、SEQ ID NO:33[LESE44靶序列的mRNA]、SEQ ID NO:34[SESE44靶序列的mRNA]或SEQ ID NO:35[SD44靶序列的mRNA]中列出的mRNA序列，或其变体。参见表2。序列中的大写字母代表外显子序列(即，外显子44中的序列)并且序列中的小写字母代表外显子44周围的内含子序列。这些序列存在于在SEQ ID NO:1或2中存在的DMD基因中。

表2.人DMD的外显子44中和邻近的靶序列以及相应的mRNA序列。

本公开包括包含反义序列(和为反义序列的反向互补序列的序列)或由其组成的核酸分子，其通过干扰剪接体导致DMD基因的外显子44跳跃而干扰DMD基因的外显子44的表达，以恢复mRNA的阅读框，导致表达截短的肌营养不良蛋白，以便治疗、改善和/或预防由DMD基因的突变和由此产生的mRNA改变形式引起的肌营养不良症。因此，如本文所用，“肌营养不良蛋白的表达增加”包括“截短的肌营养不良蛋白、肌营养不良蛋白的改变形式或肌营养不良蛋白的功能片段的表达增加”。在一些方面，本公开包括靶向外显子44及其周围的内含子序列的反义序列。在一些方面，反义序列包括在SEQ ID NO:8-11中的任一个中列出的序列，或其变体序列。在一些方面，本公开包括靶向外显子44及其周围的内含子序列的反义mRNA序列。在一些方面，这些反义序列的mRNA序列包括在SEQ ID NO:12-15中列出的序列，或其变体。参见表3。在一些方面，将这些反义序列或其反向互补序列插入编码U7的序列中，例如SEQ ID NO:28或29。在一些方面，将这些序列的多个拷贝插入编码U7的序列中。

表3.与人DMD的外显子44和周围的内含子序列结合的反义序列(靶序列的反向互补序列)和相应的mRNA序列。

本公开包括核酸，其包含处于U7启动子的控制下或插入编码U7小核RNA(U7 snRNA)的序列中的SEQ ID NO:4-15或32-35中的任一个所列出的序列中的任何一个或多个。此类编码U7 snRNA的序列在SEQ ID NO:28和29中列出并且可见表5。已发现U7 snRNA是外显子跳跃和剪接调节中的重要工具[Goyenvalle等人,Mol Ther 17(7):1234-40(2009)]。此外，在过去的二十年里，使用反义寡核苷酸(AON)进行剪接调节已被开发为许多疾病的潜在治疗方法，最著名的是杜氏肌营养不良症(DMD)。这包括临床前和临床试验[Mendell等人,Ann Neurol 74:637-47(2013)]。然而，此类AON仅显示出介导弱外显子跳跃，这是由于以下事实：它们仅微弱地穿透心脏和膈肌(即，DMD男孩中受影响最大的肌肉)并且它们不稳定，即需要DMD患者的重新注射。因此，本文描述了基于AAV的U7 snRNA基因治疗方法有助于规避AON的上述潜在递送问题。

本公开包括包含编码U7 snRNA的核苷酸序列(U7 snRNA反义序列，即SEQ ID NO:16-19、24和25，以及反向互补U7 snRNA反义序列，即SEQ ID NO:20-23、26和27)或由其组成的核酸分子，其通过干扰剪接体导致DMD基因的外显子44跳跃而干扰DMD基因的外显子44的表达，以恢复mRNA的阅读框，导致表达截短的肌营养不良蛋白，以便治疗、改善和/或预防由DMD基因的突变和由此产生的mRNA改变形式引起的肌营养不良症。参见表4。

表4.编码结合人DMD的外显子44和周围的内含子序列的U7 snRNA有义和反义序列的序列。

因此，本公开包括核酸(即，核酸分子或核酸构建体)，其包含SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个所列出的核苷酸序列中的一个或多个，或包含与SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个所列出的核苷酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列中的一个或多个。

在一些方面，本公开使用包含本文所述的核苷酸序列的U7 snRNA分子来抑制或干扰剪接。U7 snRNA通常参与组蛋白前体mRNA 3'末端加工，但在一些方面，它被转化为用于剪接调节的多功能工具或在细胞中连续表达的反义RNA[Goyenvalle等人,Science 306(5702):1796-9(2004)]。通过用源自剪接体snRNA的共有序列替代野生型U7 Sm结合位点，所得到的RNA与在剪接体snRNA中存在的七种Sm蛋白组装。结果，这种U7 Sm OPT RNA在核质中更有效地积聚并且不再介导组蛋白前体mRNA切割，尽管它仍然可以与组蛋白前体mRNA结合并充当野生型U7小核核糖核蛋白(snRNP)的竞争性抑制剂。通过用与剪接底物中的特定靶标互补的序列进一步替代与组蛋白下游元件结合的序列，可以产生能够调节特定剪接事件的U7 snRNA。使用U7衍生物的一个优点是将反义序列嵌入小核核糖核蛋白(snRNP)复合物中。此外，当嵌入基因疗法载体中时，这些小RNA可以在单次注射后在靶细胞内部永久表达，并且已经在体内研究了它们使用AAV方法的用途[Levy等人,Eur J Hum Genet 18(9):969-70(2010)；Wein等人,Hum Mutat 31(2):136-42(2010)；Wein等人,Nat Med 20(9):992-1000(2014)]。

U7-snRNA系统具有三个主要特征：U7启动子驱动以下各项的表达：(1)靶细胞中的修饰snRNA；(2)插入snRNA骨架中的反义序列，其被设计成与剪接点、分支点或剪接增强子碱基配对；(3)募集与U7snRNA复合以使其更加稳定的独特的RNA结合蛋白环的修饰序列(称为smOPT)。[Schumperli等人,Cell and Mol Life Sciences 61:2560-70(2004)]。值得注意的是，反义序列和U7小核RNA(snRNA)(U7 snRNA)已被证明在体内用于肌营养不良症的大型动物模型中是安全的[LeGuiner等人,Mol Ther 22:1923-35(2014)]。

本公开包括核酸分子，其包含与SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个所列出的核苷酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的核苷酸序列或由其组成。

因此，本公开提供了核酸，包括编码靶序列的核酸、编码反义序列和反义序列的反向互补序列的核酸、编码基于U7的小核核糖核酸(snRNA)即基于U7的snRNA的核酸、编码基于U7的snRNA的反向互补序列的核酸，以及包含所述核酸分子以递送编码基于U7的snRNA的核酸以诱导外显子跳跃以用于治疗肌营养不良症的重组腺相关病毒(rAAV)。

在一些方面，本公开包括完整构建体(在本文称为外显子44U7 snRNA多核苷酸构建体，或靶向外显子44的U7 snRNA)，其抑制或干扰DMD基因的外显子44的表达和/或其在mRNA中的掺入。因此，本公开提供了编码以下各项的核酸序列：(1)靶向外显子44的U7snRNA编码多核苷酸(例如，SEQ ID NO:16-19、24和25)，以及(2)靶向外显子44的反向互补U7 snRNA编码多核苷酸(例如，SEQ ID NO:20-23、26和27)。

因此，本公开包括包含与SEQ ID NO:1-7中列出的任何靶序列结合的核苷酸序列或由其组成的核酸、包含作为被设计成靶向外显子44及其周围的内含子序列的反义序列(在DNA水平上，靶向序列的反向互补序列)的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:8-11)或由其组成的核酸、包含作为被设计成靶向外显子44及其周围的内含子序列的反向互补序列(在RNA水平上，靶向序列的反向互补序列)的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:12-15)或由其组成的核酸、包含SEQ ID NO:4-15和32-35中列出的核苷酸序列中的至少一个或多个或由其组成的编码U7 snRNA的核酸，以及包含SEQ ID NO:16-27中列出的核苷酸序列中的至少一个或多个或由其组成的核酸。本公开预期编码这些抑制性剪接RNA的核酸负责序列特异性基因外显子跳跃。在一些方面，将本文所述的核酸或核酸分子或构建体插入载体中。

因此，本公开包括包含本文所述的核酸的载体。在一些方面，将任何这些核酸中的多于一种组合到单个载体中。因此，在一些方面，靶向外显子44的核酸或靶向外显子44的U7snRNA构建体的组合存在于单个载体中。因此，本公开包括载体，其包含SEQ ID NO:4-27和32-35中列出的核苷酸序列中的一个或多个，或与SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个所列出的核苷酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列。在一些方面，载体是病毒载体，诸如腺相关病毒(AAV)、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、马相关病毒、甲病毒、痘病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒和牛痘病毒)以递送如本文所公开的编码介导DMD外显子44跳跃的反义序列的多核苷酸。在一些方面，使用腺相关病毒(AAV)。在一些方面，使用重组腺相关病毒(rAAV)。

在一些方面，本公开的rAAV基因组包含一个或多个AAV ITR，其侧接编码例如一种或多种DMD外显子44基于U7的snRNA(即，与外显子44内或周围的基因序列结合并由U7snRNA表达的snRNA)的多核苷酸。多核苷酸可操作地连接至转录控制DNA，特别是在靶细胞中具有功能的启动子DNA。

腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长约4.7kb，包括两个145个核苷酸的倒置末端重复序列(ITR)，并且其双链DNA基因组长约2.3kb，包括两个145个核苷酸的ITR。存在多种血清型AAV。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J Virol,45:555-64(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7和AAV-8基因组分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAVrh74基因组；AAV-9基因组在Gao等人,J Virol,78:6381-8(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol Ther 13(1):67-76(2006)中提供；AAV-11基因组在Virology,330(2):375-83(2004)中提供；AAV-12的基因组在Genbank登录号DQ813647.1中提供；并且AAV-13的基因组在Genbank登录号EU285562.1中提供。在AAV ITR内含有指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列。三个AAV启动子(其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)偶联的两个rep启动子(p5和p19)导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。Rep蛋白具有多种酶特性，所述酶特性最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接及非共有翻译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学综述于Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)中。

AAV具有独特的特征，这使其作为例如在基因治疗中将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其它动物的自然感染是沉默的和无症状的。而且，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许体内靶向许多不同组织的可能性。而且，AAV转导缓慢分裂和非分裂细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上持续那些细胞的寿命。将AAV前病毒基因组作为克隆DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建是可行的。此外，因为在AAV基因组的ITR内含有指导AAV复制和基因组衣壳化的信号，所以基因组内部大约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可被外源DNA替代。为了产生AAV载体，可反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一个重要特征是它是极其稳定和健壮的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使AAV的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。

本公开的重组AAV基因组包含一个或多个AAV ITR，其侧接至少一个靶向外显子44的U7 snRNA多核苷酸构建体。特别考虑了具有包含如本文所述的靶向外显子44的反义序列中的每一个的靶向外显子44的U7 snRNA多核苷酸构建体的基因组，以及具有包含本文所述的靶向外显子44的反义序列中的两个或更多个的各个可能组合的靶向外显子44的U7 snRNA多核苷酸构建体的基因组。在一些实施方案中，包括示例性实施方案，U7 snRNA多核苷酸包括其自身的启动子。

rAAV基因组中的AAV DNA可来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13、AAV-rh74以及AAV-anc80。这些各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。在本公开的一些实施方案中，启动子DNA是肌肉特异性控制元件，包括但不限于衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，诸如衍生自myoD基因家族的那些[参见Weintraub等人,Science,251:761-766(1991)]；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi和Olson,Mol.Cell.Biol.,11:4854-4862(1991)]；衍生自人骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人,Mol.Cell.Biol.,7:4089-4099(1987)]、心脏肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件[Johnson等人,Mol.Cell.Biol.,9:3393-3399(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(MCK)元件；结蛋白启动子；衍生自骨骼快速颤搐肌钙蛋白C基因、慢速颤搐心脏肌钙蛋白C基因和慢速颤搐肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导的核因子[Semenza等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5680-5684(1991)]；类固醇诱导的元件和启动子，包括糖皮质激素应答元件(GRE)[参见Mader和White,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5603-5607(1993)]；以及其它控制元件。

本公开的DNA质粒包含本公开的rAAV基因组。将DNA质粒转移到允许用AAV的辅助病毒(例如，腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒)感染的细胞中，以将rAAV基因组装配成感染性病毒颗粒。产生rAAV颗粒的技术是本领域中的标准，其中待包装的AAV基因组、rep和cap基因以及辅助病毒功能被提供给细胞。rAAV的产生需要以下组分存在于单个细胞内(在本文中表示为包装细胞)：rAAV基因组、与rAAV基因组分开(即不在其中)的AAV rep和cap基因，以及辅助病毒功能。AAV rep基因可来自任何可衍生重组病毒的AAV血清型，并且可来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12和AAV-13、AAV-rh74以及AAV-anc80。特别考虑了同源组分的使用。假型rAAV的产生在例如WO 01/83692中公开，其通过引用整体并入本文。

在本公开的一些实施方案中，病毒基因组是单链基因组或自我互补基因组。在所述方法的一些实施方案中，rAAV的基因组缺乏AAV rep和cap DNA。

产生包装细胞的方法是创建稳定表达AAV颗粒产生的所有必需组分的细胞系。例如，包括缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因组的质粒(或多个质粒)、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及诸如新霉素抗性基因等选择性标志物整合到细胞的基因组中。已通过诸如GC加尾[Samulski等人,Proc Natl Acad Sci USA,79:2077-81(1982)]、含有限制性内切酶切割位点的合成接头的添加[Laughlin等人,Gene,23:65-73(1983)]或通过直接平末端连接[Senapathy等人,J Biol Chem 259:4661-6(1984)]的程序将AAV基因组引入细菌质粒中。然后用诸如腺病毒等辅助病毒感染包装细胞系。此方法的优点在于细胞是可选择的并且适合于大规模生产rAAV。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。

rAAV产生的一般原理综述于，例如，Carter,Current Opinions in Biotechnology,1533-539(1992)；以及Muzyczka,Curr Topics in Microbial and Immunol,158:97-129(1992))中。各种方法描述于Ratschin等人,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)；Hermonat等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251(1985)；McLaughlin等人,J.Virol.,62:1963(1988)；以及Lebkowski等人,Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)；Samulski等人,J.Virol.,63:3822-8(1989)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365和相应的美国专利号5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人,Vaccine 13:1244-50(1995)；Paul等人,Human Gene Therapy 4:609-615(1993)；Clark等人,Gene Therapy 3:1124-32(1996)；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595中。前述文献在此以全文引用的方式并入本文中，特别强调与rAAV产生有关的文献的那些部分。

因此，本公开提供产生感染性rAAV的包装细胞。在一个实施方案中，包装细胞可以是稳定转化的癌细胞，诸如HeLa细胞、293细胞和PerC.6细胞(同源293系)。在另一个实施方案中，包装细胞是不为转化的癌细胞的细胞，诸如低传代293细胞(用腺病毒E1转化的人胚肾细胞)、MRC-5细胞(人胚成纤维细胞)、WI-38细胞(人胚成纤维细胞)、Vero细胞(猴肾细胞)和FRhL-2细胞(恒河猴胚肺细胞)。

上文和下文描述的本公开的方法的细胞转导效率可以是至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的效率。

rAAV可以通过本领域标准方法纯化，诸如通过柱色谱法或氯化铯梯度。用于从辅助病毒中纯化rAAV载体的方法是本领域已知的，并且包括在例如Clark等人,Hum.Gene Ther.10(6):1031-9(1999)；Schenpp等人,Methods Mol.Med.69:427-43(2002)；美国专利号6,566,118；以及WO 98/09657中公开的方法。

在另一个实施方案中，本公开考虑了包含rAAV的组合物，所述rAAV包含本文所述的任何核酸分子或构建体。在一个方面，本公开包括包含用于递送本文所述的snRNA的rAAV的组合物。本公开的组合物包含处于药学上可接受的载剂中的rAAV。组合物还可包含其它成分，诸如稀释剂。可接受的载剂和稀释剂对受者无毒，并且优选地在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂诸如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(PEG)。

根据需要，通过将rAAV以所需量掺入带有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中来制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何附加期望成分。

在本公开的方法中待施用的rAAV的滴度将根据例如特定rAAV、施用方式、治疗目标、个体以及靶向的一种或多种细胞类型而变化，并且可通过本领域标准的方法确定。rAAV的滴度范围可为每毫升约1×10⁶、约1×10⁷、约1×10⁸、约1×10⁹、约1×10¹⁰、约1×10¹¹、约1×10¹²、约1×10¹³至约1×10¹⁴或更多DNA酶抗性颗粒(DRP)。剂量也可以病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别地1×10⁷vg、1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×10¹⁴vg)。

在一些方面，本公开提供了一种将编码在SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个中列出的snRNA的DNA递送至有需要的受试者的方法，其包括向受试者施用编码靶向外显子44的snRNA的rAAV。在一些方面，本公开提供了用于递送靶向外显子44的snRNA的AAV转导细胞。

本公开考虑了在体内或体外用rAAV转导靶细胞(例如，骨骼肌)的方法。所述方法包括向有需要的动物(包括人类)施用有效剂量或有效多次剂量的包含本公开的rAAV的组合物的步骤。如果在肌营养不良症(例如DMD)的发展之前施用所述剂量，则施用是预防性的。如果在肌营养不良症的发展之后施用所述剂量，则施用是治疗性的。在本公开的实施方案中，有效剂量是减轻(消除或降低)与正在治疗的肌营养不良症相关的至少一种症状、减缓或预防肌营养不良症(例如DMD)的进展、减缓或预防肌营养不良病症/疾病状态的进展、减少疾病的程度、导致疾病的缓解(部分或全部)，和/或延长患有所述病症或疾病的受试者的存活的剂量。

施用有效剂量的组合物可通过本领域标准的途径进行，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、鞘内、口服、经颊、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到感染和/或正在治疗的疾病状态以及一个或多个靶细胞/组织，本领域技术人员可选择和/或匹配本公开的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的一个或多个施用途径和一种或多种血清型。在一些实施方案中，施用途径是肌内。在一些实施方案中，施用途径是静脉内。

本公开还考虑了组合疗法。如本文所用的组合包括同时治疗或顺序治疗。特别考虑了本公开的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇和/或免疫抑制药物)的组合，以及与其他疗法的组合，所述其他疗法诸如国际公布WO 2013/016352中公开的那些，所述公布通过引用整体并入本文。

施用有效剂量的组合物可通过本领域标准的途径进行，包括但不限于肌内、肠胃外、静脉内、鞘内、口服、经颊、鼻、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道。考虑到感染和/或正在治疗的疾病状态以及将表达靶向外显子44的基于U7的snRNA的一个或多个靶细胞/组织，本领域技术人员可选择和/或匹配本公开的rAAV的AAV组分(特别是AAV ITR和衣壳蛋白)的一个或多个施用途径和一种或多种血清型。

具体地，本公开的rAAV的实际施用在一些方面通过使用将把rAAV载体转运到受试者的靶组织中的任何物理方法来实现。根据本公开的施用包括但不限于注射到肌肉、肝脏、脑脊髓液或血流中。简单地将rAAV重悬于磷酸盐缓冲盐水中已经证明足以提供可用于肌肉组织表达的媒介物，并且对可以与rAAV共同施用的载剂或其它组分没有已知的限制(尽管降解DNA的组合物应使用rAAV以正常方式避免)。在一些方面，对rAAV的衣壳蛋白进行修饰，使得rAAV靶向感兴趣的特定靶组织，诸如肌肉。参见，例如，WO 02/053703，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些方面，将组合物或药物组合物制备成通过透皮转运递送至肌肉的可注射制剂或局部制剂。许多用于肌内注射和透皮转运两者的制剂先前已经被开发，并且可以用于本公开的实践中。在一些方面，rAAV与任何药学上可接受的载剂或赋形剂一起使用以便于施用和处理。

在一些方面，出于肌内注射的目的，采用处于佐剂诸如芝麻油或花生油或处于丙二醇水溶液中的溶液，以及无菌水溶液。在各个方面，如果期望，对此类水溶液进行缓冲，并且用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。在一些方面，作为游离酸(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐的rAAV的溶液在适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合的水中制备。在各个方面，在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备rAAV的分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以预防微生物的生长。在这一点上，采用的无菌含水介质都可通过本领域的标准技术容易地获得。

制剂，包括适于可注射使用的药物形式，包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，以便存在易于注射的程度。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。在一些方面，载剂是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。在一些方面，通过使用诸如卵磷脂的涂层、通过在分散液的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在一些方面，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。在一些方面，通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，实现可注射组合物的延长吸收。

在一些方面，根据需要，通过将rAAV以所需量掺入具有上面列举的各种其它成分的适当溶剂中然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，各种制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分。

在一些方面，使用rAAV进行的转导也在体外进行。在一个实施方案中，例如，从受试者中取出期望的靶肌肉细胞，用rAAV转导并且重新引入受试者中。可替代地，在一些方面，使用同种或异种肌肉细胞，其中那些细胞将不在受试者中产生不适当的免疫应答。

用于将转导细胞转导和重新引入受试者的合适方法是本领域已知的。在一个实施方案中，通过将rAAV与肌肉细胞组合(例如，在适当的介质中)体外转导细胞，并且使用本领域中的常规技术诸如Southern印迹和/或PCR，或通过使用选择性标志物来筛选那些携带感兴趣的DNA的细胞。在一些方面，然后将转导的细胞配制成组合物，包括药物组合物，并且通过各种技术将组合物引入受试者中，诸如通过肌内、静脉内、皮下和/或腹膜内注射，或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中。

本公开提供了向有需要的受试者施用有效剂量(或多次剂量，基本上同时施用的或间隔给予的剂量)的编码抑制性RNA的rAAV和编码抑制性RNA(包括靶向外显子44和跳跃外显子44的snRNA)的组合的rAAV的方法。

用本发明的rAAV转导细胞导致外显子44的基于U7的snRNA的持续表达。术语“转导”用于指经由本发明的复制缺陷型rAAV将一个或多个靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体体内或体外施用/递送到受者细胞，从而导致受者细胞表达一个或多个靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体。因此，本公开提供了向受试者施用/递送表达外显子44的基于U7的snRNA的rAAV的方法。在一些方面，受试者是人类。

这些方法包括用一种或多种本公开的rAAV转导血液和血管系统、中枢神经系统和组织(包括但不限于诸如肌肉的组织、诸如肝脏和大脑的器官，以及诸如唾液腺的腺体)。在一些方面，用包含组织特异性控制元件的基因盒进行转导。例如，本公开的一个实施方案提供了转导由肌肉特异性控制元件指导的肌肉细胞和肌肉组织的方法，所述控制元件包括但不限于衍生自肌动蛋白和肌球蛋白基因家族，诸如衍生自myoD基因家族的那些[参见Weintraub等人,Science,251:761-6(1991)]；肌细胞特异性增强子结合因子MEF-2[Cserjesi等人,Mol Cell Biol 11:4854-62(1991)]；衍生自人骨骼肌动蛋白基因[Muscat等人,Mol Cell Biol,7:4089-99(1987)]、心脏肌动蛋白基因的控制元件；肌肉肌酸激酶序列元件[参见Johnson等人,Mol Cell Biol,9:3393-9(1989)]和鼠肌酸激酶增强子(mCK)元件；衍生自骨骼快速颤搐肌钙蛋白C基因、慢速颤搐心脏肌钙蛋白C基因和慢速颤搐肌钙蛋白I基因的控制元件：缺氧诱导的核因子[Semenza等人,Proc Natl Acad Sci USA,88:5680-4(1991)]；类固醇诱导的元件和启动子，包括糖皮质激素应答元件(GRE)[参见Mader等人,Proc Natl Acad Sci USA 90:5603-7(1993)]；以及其它控制元件。

因为AAV靶向每个受肌营养不良蛋白影响的器官，本公开包括将编码抑制性RNA的DNA递送至受试者的所有细胞、组织和器官。在一些方面，血液和血管系统、中枢神经系统、肌肉组织、心脏和大脑是体内DNA递送的有吸引力的靶标。本公开包括来自转导细胞的snRNA的持续表达，以影响DMD外显子44表达(例如，跳跃、敲低或抑制表达)并改变DMD蛋白的表达。在一些方面，肌肉组织被靶向以递送本公开的核酸分子和载体。肌肉组织是体内DNA递送的有吸引力的靶标，因为它不是至关重要的器官并且易于接近。在一些方面，本公开考虑了来自转导的肌纤维的一种或多种外显子44的基于U7的snRNA的持续表达。“肌肉细胞”或“肌肉组织”意指衍生自任何种类的肌肉(例如，骨骼肌和平滑肌，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织)的细胞或细胞组群。在一些方面，此类肌肉细胞是分化的或未分化的，诸如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。

在另一方面，本公开提供了一种恢复细胞中的DMD基因的开放阅读框的方法，其包括使细胞与编码靶向外显子44的U7 snRNA的rAAV接触，其中RNA由在SEQ ID NO:4-27和32-35中的任一个中的至少一个或多个中列出的核苷酸序列编码。在一些方面，外显子44的跳跃导致外显子44被排除或抑制至少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％。

因此，本公开提供了向有需要的受试者(例如，罹患肌营养不良症，诸如DMD的受试者或患者)施用有效剂量(或多次剂量，基本上同时施用的或间隔给予的剂量)的靶向外显子44的U7 snRNA多核苷酸构建体或包含编码一种或多种靶向外显子44的U7 snRNA多核苷酸构建体的基因组的rAAV的方法。

在一些方面，提供了一种治疗患者的肌营养不良症的方法。在一些方面，“治疗”包括改善、抑制或甚至预防包括杜氏肌营养不良症在内的肌营养不良症的一种或多种症状(包括但不限于肌肉消瘦、肌肉无力、骨骼肌问题、心脏功能异常、呼吸困难、言语和吞咽问题(构音障碍和吞咽困难)或认知障碍)。在一些方面，治疗方法导致肌营养不良蛋白的表达增加，或在受试者中具有生理学活性或功能活性的肌营养不良蛋白的改变形式或片段的表达增加。在特定方面，治疗方法抑制受试者的营养不良性病理的进展。在一些方面，治疗方法改善受试者的肌肉功能。在一些方面，肌肉功能的改善是肌肉力量的改善。在一些方面，肌肉功能的改善是站立和行走稳定性的改善。肌肉力量的改善通过本领域已知的技术确定，诸如最大自愿等长收缩测试(maximal voluntary isometric contraction testing，MVICT)。在一些情况下，肌肉功能的改善是站立和行走稳定性的改善。在一些方面，稳定性或肌肉力量的改善通过本领域已知的技术确定，诸如6分钟步行测试(6-minute walk test，6MWT)、100米跑步/步行测试或定时爬楼梯。

在一些实施方案中，治疗方法包括在不使用载体的情况下施用一种或多种外显子44的基于U7的snRNA多核苷酸构建体的步骤。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用rAAV的步骤，其中rAAV的基因组包含一种或多种外显子44的基于U7的snRNA多核苷酸构建体。

在另一方面，本公开提供了一种抑制与肌营养不良症诸如DMD相关的营养不良性病理的进展的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在不使用载体的情况下施用一种或多种外显子44的基于U7的snRNA多核苷酸构建体的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用rAAV的步骤，其中rAAV的基因组包含靶向外显子44的U7snRNA多核苷酸构建体。

本文引用的每个出版物、专利申请、专利和其它参考文献均以与本公开内容不矛盾的程度通过引用以其整体并入本文。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的引用仅旨在用作个别提及落入该范围内的每个单独值和每个端点的简写方法，并且每个单独值和端点并入本说明书中，如同其在本文中个别引用一样。

除非本文另外指出或以其他方式与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均以任何合适的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐述本发明并且不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应理解为将任何未要求保护的要素指示为实践本发明所必须的。

应理解，本文所描述的实例和实施方案仅是出于说明性目的，且根据其的各种修改或变化将由所属领域的技术人员想到且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求书的范围内。

实施例

本公开的另外的方面和细节将根据以下实施例而变得显而易见，所述实施例旨在是说明性而非限制性的。

实施例1

靶向外显子44的序列的设计和产生

为了测试U7snRNA系统诱导外显子44跳跃的能力，制备了六种AAV1-U7snRNA。反义序列(即，SEQ ID NO:8-27)被设计成结合“外显子限定(exon definition)”(分支点、剪接供体或受体，以及外显子剪接增强子)，以便从mRNA中排除外显子(例如，外显子44)。这种“外显子限定”可以使用在线软件Human Splicing Finder(HSF,http colon-slash-slash-www.umd.be-slash-HSF-slash-HSF.shtml)预测。发明人使用该软件设计了具有不同长度和各种结合位点的各种靶序列和各种靶向序列。序列是商业合成的(GenScript)。

下表(即，下表5)提供了DMD基因的外显子44的序列(核苷酸和氨基酸)(以及外显子44周围的内含子序列)、DMD基因上的靶序列(外显子44序列(在SEQ ID NO:1中为大写字母)和外显子44周围的内含子序列(在SEQ ID NO:1中为小写字母))、用于靶向DMD基因上的序列(外显子44和外显子44周围的内含子序列)的反义序列、用于靶向DMD基因上的序列(外显子44和外显子44周围的内含子序列)的反义序列的反向互补序列、包含用于靶向DMD基因上的序列(外显子44和外显子44周围的内含子序列)的反义序列的U7序列，以及包含用于靶向DMD基因上的序列(外显子44和外显子44周围的内含子序列)的反义序列的U7序列的反向互补序列。

对含有SEQ ID NO:16-27中列出的构建体中的每一个的质粒进行扩增、重新测序并送到美国全国儿童医院(Nationwide Children's Hospital)的病毒载体核心(Viral Vector Core，VVC)以将其插入重组腺相关病毒(rAAV)载体中(即，ITRS之间)。对于体外转导研究，构建体是使用AAV1衣壳产生的。对于体内研究，构建体被产生为如本文所述的任何AAV衣壳。

表5.本公开的序列。

实施例2

实验中使用的材料和方法

细胞系的创建

从三名患有外显子45缺失、外显子44重复或外显子45-56缺失的患者获得皮肤活检。通过使用慢病毒载体感染，以将hTERT(使细胞永生化)和MyoD(强制细胞转分化成肌管)递送至成纤维细胞，以产生表达肌营养不良蛋白的肌原性成纤维细胞(FibroMyoD)来使这些皮肤活检发育成三种细胞系。用如本文所述的各种rAAV制剂感染FibroMyoD。使用每10cm培养皿2.5e11个病毒基因组。四至八天后，收集细胞并进行RNA和蛋白质提取。

hDMD/mdx del45小鼠模型

hDMD/mdx del45小鼠模型(在本文也称为“hDMDdel45 mdx”模型或“hDMD/del45 mdx”模型)获自Melissa Spencer博士[Young等人,J.Neuromuscul.Dis.2017；4(2):139–145(2017)]。该小鼠含有DMD基因的人型式，但它在hDMD小鼠中含有人DMD基因的外显子45的缺失，从而产生框外转录本(out of frame transcript)。该小鼠还含有鼠DMD基因的终止突变。总之，这两个突变导致在该小鼠模型中没有人或鼠肌营养不良蛋白的表达。由于hDMD/mdx del45小鼠缺乏小鼠和人肌营养不良蛋白两者，因此该小鼠全身多处肌肉出现营养不良性肌肉病理。该小鼠模型在本文所述的各种实验中使用。

RNA提取

在细胞离心后对细胞沉淀物进行RNA提取。冲洗沉淀物并添加1ml TRIzol(Life Technologies)。通过吸移将细胞裂解物匀浆，然后将其在室温下孵育5min。将细胞裂解物转移到1.5ml管中并且每1ml的TRIzol添加0.2ml的氯仿。将裂解物/TRIzol/氯仿混合物手动振荡15s。然后将混合物在室温下孵育2-3min并在12,000g( 4℃)下离心15min。收集水相(即，上层)并转移到新管中。添加0.5ml异丙醇(每毫升TRIzol)并使其在室温下静置10min。然后在4℃下以12,000g离心10min后去除上清液，并用1ml的75％EtOH(每毫升TRIzol)洗涤沉淀物。离心(7,500g，4℃下5min)后，将沉淀物空气干燥，并且将RNA重悬于不含RNA酶的水中，在60℃下持续10min。

逆转录和PCR扩增

该方案是基于制造商优化方案(Maxima Reverse Transcriptase，(Thermo Fisher Scientific)。将1μg的RNA转化为cDNA。使用两种PCR引物进行扩增(即，Fw：CTCCTGACCTCTGTGCTAAG(SEQ ID NO:30)；Rv：ATCTGCTTCCTCCAACCATAAAAC(SEQ ID NO:31))。使用PCR Master Mix体系(Thermo Fisher Scientific)进行退火温度为60℃)的PCR扩增。

蛋白质提取和蛋白质印迹

使用裂解缓冲液(150mM Tris-NaCl、1％NP-40、洋地黄皂苷(Sigma)以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂(1860932，Thermo Inc.))制备小鼠肌肉裂解物。将缓冲液中的裂解物在冰上孵育一小时。然后将缓冲液中的裂解物以14000g离心20min。收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒进行蛋白质定量。然后将上清液与经典的SDS-Page缓冲液混合并在100℃下煮沸5min。使150μg的各蛋白质样品在预制的3-8％Tris-乙酸凝胶(NuPage，Life Science)上在80V(4℃)下跑样16h。将凝胶转移到硝酸纤维素膜上，在300mA下过夜。

使用针对肌营养不良蛋白的C末端的兔多克隆抗体(1:250，PA1-21011，Thermo Fisher Scientific；或1:400，15277，Abcam)。使用α-辅肌动蛋白(1:5000，A-7811，Sigma)作为上样对照。在室温下孵育1小时后，将膜洗涤(5×5min，用在TBS中的0.1％吐温，TBST)并以1:1000稀释度暴露于二抗(在室温下60min)。所有抗体均在1/2Odyssey封闭缓冲液和1/2TBST中稀释。以1:1000的稀释度使用抗小鼠IgG(H L)(680CW缀合物)和抗兔IgG(H L)(800CW缀合物)使用在TBS中的0.1％吐温进行5×5min洗涤，然后进行ddH2O浸泡。使用LI-CORNIR扫描两个同时的信号。对于肌肉切片，对各肌肉进行免疫印迹。

免疫组织化学

将冷冻肌肉切成8-10微米，将切片空气干燥，然后染色30min。将切片在PBS中再水化并与正常山羊血清(1:20)一起孵育1小时，然后仅针对小鼠切片，在室温下与抗小鼠IgG未缀合的fab片段一起孵育两小时。将一抗留下过夜：肌营养不良蛋白(1:250，PA1-21011，Thermo Fisher Scientific)。洗涤后，将切片与适当的二抗(即，Alexa Fluor 488或568缀合的)(LifeScience)一起孵育1h。将载玻片覆盖在Fluoromount plus DAPI(Vector Labs)中。使用Olympus BX61实现观察。使用DP控制器(Olympus)进行采集。

实施例3

靶向外显子44的rAAV构建体(AAV1.U7Δex44)的体外转染和表达

从三名患有外显子45缺失、外显子44重复或外显子45-56缺失的患者获得皮肤活检。通过使用慢病毒载体感染，以将hTERT(使细胞永生化)和MyoD(强制细胞转分化成肌管)递送至成纤维细胞，以产生表达肌营养不良蛋白的肌原性成纤维细胞(FibroMyoD)来使这些皮肤活检发育成三种细胞系。用四种不同的rAAV制剂感染FibroMyoD。

选择四个不同的序列[即，SEQ ID NO:4-7(参见表2)，存在于外显子44中或存在于外显子44和外显子4周围的内含子序列中]用于靶向。U7snRNA构建体被设计成包含被设计成结合靶序列的SEQ ID NO:8-11中的每一个。将U7snRNA构建体(即，SEQ ID NO:16-25)中的每一个克隆到AAV1中，以评估由那些上述FibroMyoD产生的成肌细胞中的外显子跳跃效率。

使用每10cm培养皿2.5e11个病毒基因组。四至八天后，收集细胞并进行RNA和蛋白质提取。RT-PCR实验一式三份进行以观察外显子跳跃。所有四个AAV1.U7-反义序列(即，包含SEQ ID NO:20-23中的每一个的AAV)都能够介导几乎100％的外显子44跳跃(图1A-C)。同样，三个AAV1.U7-反义序列(即，包含SEQ ID NO:23、26和27中的每一个的AAV)都能够介导几乎100％的外显子44跳跃(图1D-F)。

尽管已经通过包含BP43AS44、LESE44、SESE44和SD44的构建体证明了外显子4的有效跳跃，但将四个拷贝的SD44，即U7.SD44，克隆到单个自我互补的(sc)AAV1载体(称为“U7-4xSD44”)中。此外，由于U7.SD44介导的外显子跳跃已经非常有效，因此还创建了仅携带一个拷贝的U7.SD44和添加的填充序列(即，随机非编码DNA)的构建体。

使用每10cm培养皿2.5e11个病毒基因组。四至八天后，收集细胞并进行RNA和蛋白质提取。RT-PCR实验一式三份进行以观察外显子跳跃。使用了三个AAV1.U7-反义序列(即，包含SEQ ID NO:23、26和27中的每一个的AAV)。包含SEQ ID NO:26(4xSD44)和27(SD44-填充序列)中的每一个的AAV能够介导几乎100％的外显子44跳跃(图1D-F)。AAV1.U7-SD44(包含SEQ ID NO:23的AAV)在该实验中用作阳性对照。

实施例4

包含诱导外显子44跳跃的U7-snRNA的rAAV(AAV9.U7Δex44)的肌内递送导致肌营养不良蛋白的表达增加

以2.5e11个AAV1病毒颗粒向六只2月龄hDMD/mdx del45小鼠的各胫骨前(TA)肌肉中注射AAV1.U7-SD44(包含SEQ ID NO:23的AAV)、AAV1.U7-SD44-填充序列(包含SEQ ID NO:27的AAV)和AAV1.U7-4xSD44(包含SEQ ID NO:26的AAV)。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。病毒注射后一个月，从3月龄小鼠中提取肌肉，并通过利用RT-PCR测量人肌营养不良蛋白的表达来确定外显子跳跃效率(图2)。图2示出在注射上文列出的三种不同的rAAV病毒载体后一个月，胫骨前(TA)肌肉中人DMD外显子44的有效跳跃。这些RT-PCR结果表明，在小鼠#57和#58(未处理小鼠)中不存在外显子跳跃；在小鼠#60和#61(注射了U7-SD44-填充序列(即，包含SEQ ID NO:27的AAV)的小鼠)中存在有效的外显子跳跃；在小鼠#66和#72(注射了U7-SD44(即，包含SEQ ID NO:23的AAV)的小鼠)中存在有效的外显子跳跃；并且在小鼠#84(注射了U7-4x-SD44(即，包含SEQ ID NO:26的AAV)的小鼠)中存在有效的外显子跳跃。Black 6(Bl6)是不含人DMD基因的野生型小鼠，并且因此是人DMD的阴性对照。

通过免疫荧光确认肌营养不良蛋白的表达(图3A-E)。图3A-E示出在注射三种不同的rAAV病毒载体后一个月，2月龄的hDMD/mdx del45小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人肌营养不良蛋白的免疫荧光表达。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。

这些免疫荧光实验结果获自#58(未处理的hDMD/mdx del45小鼠；图3A)；Black 6(Bl6)对照小鼠(图3B)，即不含人DMD基因的Bl6小鼠；然而，该免疫荧光实验中使用的抗体识别人和小鼠肌营养不良蛋白两者；小鼠#72(注射了U7.SD44的小鼠；图3C)；小鼠#60(注射了U7-SD44填充序列的小鼠；图3D)；以及小鼠#84(注射了U7-4xSD44的小鼠)(图3E)。

一个月后，肌肉的免疫染色表明，在使用所有三种rAAV载体进行病毒感染后，肌营养不良蛋白均表达，其中SD44-填充序列载体(注射了U7-SD44-填充序列(即，包含SEQ ID NO:27的AAV)的小鼠，图3D)和4X-SD44载体(注射了U7-4xSD44(即，包含SEQ ID NO:26的AAV)的小鼠，图3E)似乎导致肌肉中最高水平的肌营养不良蛋白表达。

通过蛋白质印迹分析确认肌营养不良蛋白的表达(图4)。图4示出在注射三种不同的rAAV病毒载体后一个月，hDMD/mdx del45小鼠的胫骨前(TA)肌肉中人肌营养不良蛋白的蛋白质印迹表达。在两只小鼠的每个TA中进行实验(每个构建体n＝4个TA肌肉)。一个月后，蛋白质印迹结果显示，在用所有三种rAAV病毒载体感染后，肌营养不良蛋白均表达，其中SD44-填充序列载体似乎导致肌肉中最高水平的肌营养不良蛋白表达。这些蛋白质印迹结果获自小鼠#57和#58(未处理小鼠)；小鼠#60和#61(注射了U7.SD44-填充序列(即，包含SEQ ID NO:27的AAV)的小鼠)；小鼠#66和#72(注射了U7.SD44(即，包含SEQ ID NO:23的AAV)的小鼠)以及小鼠#84(注射了U7.4xSD44(即，包含SEQ ID NO:26的AAV)的小鼠)。肌营养不良蛋白通过Bl6对照表达，因为该蛋白质印迹中使用的抗体识别人和小鼠肌营养不良蛋白两者。

因此，包含U7.SD44(包含SEQ ID NO:23的AAV)、U7.4xSD44(包含SEQ ID NO:26的AAV)和U7.SD44-填充序列(包含SEQ ID NO:27的AAV)的所有三种rAAV载体中的AAV.U7snRNA-反义序列的递送通过靶向外显子44，包括靶向与外显子44相邻的内含子序列而诱导肌营养不良蛋白的表达。虽然所有构建体都介导稳健的外显子跳跃，导致肌营养不良蛋白的强表达，但在这些实验中，包含SD44-填充序列构建体和4x-SD44构建体的rAAV((图3D-E和图4)似乎比其它构建体更有效。

实施例5

包含诱导外显子44跳跃的U7-snRNA的rAAV(AAV9.U7Δex44)的系统递送导致肌营养不良蛋白的表达增加

以在3e13 vg/kg至2e14 vg/kg范围内的各种剂量向十只hDMDdel45/mdx小鼠(两月龄)的颞静脉(即，新生小鼠)或尾静脉(即，2月龄小鼠)中注射AAV9.U7-SD4-填充序列或AAV9.U7-4X-SD44(分别为SEQ ID NO:27和26，克隆到AAV9中)。在注射后1、3或6个月收集用这些病毒载体转导的小鼠。使用上文所述的方案，通过使用RT-PCR、免疫荧光以及蛋白质印迹分析测量肌营养不良蛋白的表达来确定外显子跳跃效率。

虽然已根据具体实施方案描述了本公开，但应理解，所属领域的技术人员将想到变化和修改。因此，只有在权利要求中出现的这些限定对本公开进行限定。

本申请中引用的所有文档据此以引用方式整体并入，特别注意它们所引用的内容。