确认蛋白质与核酸适配体结合时的关键精氨基酸残基位点的方法与流程

1.本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种鉴定蛋白质与核酸适配体关键结合位点的多维核磁共振方法。


背景技术：

2.核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的单链dna或者rna，可以与其靶标如小分子、多肽、蛋白质甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，被誉为“化学抗体”。相比于抗体，核酸适配体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，获取周期短，可以人工合成等优势，在生化分析、环境监测、基础医学、新药开发等方面具有广阔的前景。
3.识别蛋白质的核酸适配体，在蛋白质检测、结构和功能调控上具有重要的应用价值。核酸适配体与蛋白质的结合主要通过核苷酸与蛋白质中氨基酸侧链的氢键、盐桥、范德华力等非共价键相互作用。分析核酸适配体与蛋白质识别的关键氨基酸位点，从分子水平上认识蛋白质-核酸适配体相互作用，对深入了解核酸适配体识别机理具有重要意义；也是进一步优化和设计核酸适配体的重要理论依据。现有的分析核酸适配体与蛋白质结合的技术有表面等离子体共振(spr)、石英晶体微平衡(qcm)分析、等温滴定量热法(itc)、动态光散射(dls)、圆二色性(cd)和小角度x射线散射(saxs)，但这些方法局限于二者结合能力的测定，无法从分子水平进行关键结合位点的表征。
4.多维核磁共振技术可以在原子水平上获取蛋白质和核酸的信息，特别是对于核酸适配体等柔性较大的分子或蛋白质中柔性较大的片段，有显著的优势。然而，已有的研究蛋白质和核酸结合的核磁共振方法，需要采集一系列三维核磁共振谱图，进行复杂的蛋白质主链和侧链化学位移归属，在此基础上利用核磁滴定实验确认蛋白质和核酸适配体相互作用的界面，以及蛋白质二级结构和三级结构等。而且某些复杂的体系还需要结合noesy谱图(nuclear overhauser effect spectroscopy)和残余偶极耦合等(residual dipolar couplings)核磁共振方法进行。该过程步骤繁琐、耗时长，工作量大，限制了研究核酸适配体与蛋白结合位点的效率。


技术实现要素：

5.为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.确认蛋白质与核酸适配体结合时的关键精氨酸残基位点的方法，包括如下步骤：比对未突变蛋白与核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图数据和单个精氨酸位点突变为赖氨酸的突变蛋白与核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图数据；若单个精氨酸位点突变为赖氨酸的突变蛋白与核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图中有80ppm-90ppm范围内单信号消失或多信号消失，对应的精氨酸位点为关键精氨酸残基结合位点。
7.在本发明具体实施方式中，所述关键精氨基酸残基位点为r36、r40、r41、r88、r89、
r93、r95、r149的精氨酸。
8.在本发明具体实施方式中，所述单个精氨酸位点突变为赖氨酸的方法为将蛋白的每个精氨酸单独突变为赖氨酸。
9.本发明的有益效果：首次利用多维核磁共振谱图在氨基酸侧链特征信号区域的指纹谱图，结合单位点r-k突变的方式，表征核酸适配体和蛋白质结合时的关键精氨酸残基。无需对蛋白质进行三维核磁谱图指认分析，省去大量繁琐的分析过程，能够快速准确找到蛋白质与核酸适配体结合时的关键氨基酸残基。
附图说明
10.图1是突变/野生型蛋白结合核酸适配体核磁共振谱图特异性区域的交叉峰信号变化情况示意图。
11.其中，黑色实心圆圈代表交叉峰信号；黑色实线无实心圆圈代表氨基酸突变位点，该位点突变后原有交叉峰信号消失；黑色虚线无实心圆圈代表随着单点突变，非突变位点的交叉峰信号消失。
12.图2是sars-cov-2核衣壳蛋白n端截断体的序列和结构图。
13.图3是n-ntd结合a48核酸适配体前后的核磁谱图。
14.其中a是精氨酸侧链交叉峰特征信号区域，出现结合前未出现的9个交叉峰信号(黑色)。b是n-ntd蛋白(灰色)与n-ntd-a48复合物(黑色)的1h-15
n hsqc图谱的覆盖。
15.图4是n-ntd-a48复合物(黑色)和r-k突变的n-ntd-a48复合物(灰色)的1h-15
n hsqc图谱。其中r10为第10精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r14为第14精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r32为第32精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r68为第68精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r92为第92精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r107为第107精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r177为第177精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图。
16.图5是n-ntd-a48复合物(黑色)和r-k突变的n-ntd-a48复合物(灰色)的1h-15
n hsqc图谱。其中r41为第41精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r88为第88精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r89为第89精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r93为第93精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r40为第40精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r95为第95精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图。
17.图6是n-ntd-a48复合物(黑色)和r-k突变的n-ntd-a48复合物(灰色)的1h-15
n hsqc图谱。其中r36为第36精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图，r149为第149精氨酸位点突变为赖氨酸后与a48核酸适配体结合后的核磁谱图对比图。
具体实施方式
18.以下将结合实施例对本发明做进一步说明，所举实施例并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的思路和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的权利要求范围之内。
19.本发明旨在提供一种鉴定蛋白质与核酸适配体结合关键位点的多维核磁共振方法，采用本发明提供的核磁共振方法能够鉴定蛋白质与核酸适配体结合的关键精氨酸残基。
20.本发明通过单点突变结合多维核磁共振谱图的方式，采集突变蛋白质和核酸适配体结合后的多维谱图，并将此谱图与野生型蛋白质和核酸适配体结合后的谱图比较，从谱图比对中得到位点指认，以确认该突变是否为关键结合位点。
21.为了找到关键精氨酸位点，首先对比野生型蛋白结合核酸适配体前后的谱图变化，找到发生化学位移变化或新出现的信号，这些信号是结合界面上的氨基酸残基的信号。确定这些信号后，对比野生型蛋白质和单点突变型蛋白质(均结合核酸适配体后)在氨基酸侧链特异性区域的谱图。分析单点突变是否会改变结合界面上的关键氨基酸残基信号，若发生改变，说明此突变位置是蛋白质和核酸适配体结合的关键氨基酸残基，同时进行信号指认。
22.本发明方法首次利用了r-k突变结合精氨酸残基侧链nh特异性区域的方法，进行信号指认和关键精氨酸位点的定位。精氨酸与赖氨酸均为碱性氨基酸，所带电荷均为正电荷。精氨酸与赖氨酸残基侧链的
15
n原子的化学位移约为80ppm和40ppm。可以在二维1h-15
n hsqc谱图的
15
n化学位移80ppm范围内观察到精氨酸特异性侧链信号峰，而单点r-k突变则使得关键精氨酸侧链信号消失，并且在谱图的
15
n化学位移40ppm范围处出现新的赖氨酸残基信号。因此，通过r-k突变，可以在不改变蛋白表面电荷分布以及蛋白质拓扑结构的情况下，分析所突变的氨基酸残基是否为关键结合位点。同时，避免了对三维谱图的采集和指认，节约了采集时间。
23.与核酸适配体结合的蛋白质的单位点r-k突变可能在核磁共振谱图上表现出三种现象，并依此进行关键精氨酸位点的指认。
24.1)r-k单位点突变蛋白精氨酸特异性信号与野生型蛋白一致，说明该突变位点的精氨酸并非参与蛋白质和核酸适配体的结合位置。
25.2)r-k单位点突变蛋白精氨酸特异性信号之一消失，且其它信号不变，则证明该突变位点参与蛋白质和核酸适配体的结合，并可以通过消失的位置进行信号指认。
26.3)r-k单位点突变导致精氨酸残基侧链nh特异性区域上多个精氨酸残基信号发生变化，则证明该精氨酸位点不仅是参与蛋白质与核酸适配体结合的氨基酸残基，同时对识别起到关键作用。
27.实施例
28.1.制备野生蛋白
29.sars-cov-2的核衣壳蛋白n端截断体(nucleocapsid protein-n terminal domain，n-ntd)，其序列如seq id no.1所示。该蛋白截断体由180个氨基酸构成，即从n端开始的第1至180个氨基酸，序列与结构如图2所示。
30.表达纯化，选择的载体质粒为pet-28a( )，整合的序列结构为n-ntd，6
×
组氨酸标
签接在n-ntd的n端，通过色谱(nta树脂)纯化即可得到目标蛋白，将构建的载体导入到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中进行蛋白的表达。
31.(1)载体质粒的构建
32.利用质粒pet-28a( )作为载体，在质粒原带的6
×
组氨酸标签后插入烟草蚀纹病毒(tev)蛋白酶切位点，后接入n-ntd蛋白的核酸序列和终止子，得到重组载体。
33.(2)构建的载体导入到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中表达
34.利用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态后，将重组质粒热激导入大肠杆菌中，在固体培养基中培养后，挑取单克隆进行测序验证，后将正确单克隆进行放大诱导表达，表达完成后加入30％甘油，制备成甘油菌，-80℃保存待用。
35.50ml培养基中加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，然后加入甘油菌(已筛选到表达量较高的单克隆)，37℃，220rpm振摇速度下在摇床中培养过夜。
36.将过夜培养的25ml菌液接入1l的lb培养基(若表达同位素标记的蛋白，可换为相应标记的m9培养基)中，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃，220rpm条件下培养。
37.od
600
长到0.6-0.8之间时，加入终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。30℃，220rpm条件下诱导表达8h。
38.收集表达蛋白的细菌(10,000
×
g，离心5分钟)，保存在-20℃。
39.用a缓冲液(20mm三羟甲基氨基甲烷，2m氯化钠，10％甘油，ph 7.4)重悬菌体，加入1
×
的蛋白酶抑制剂，之后用高压均质仪裂菌(1000bar，2分钟)。裂解后的菌溶液在4℃，10,000
×
g离心45分钟。收集上清液，利用亲和色谱进行分离。
40.用a缓冲液平衡镍柱后，将高速离心的溶液取上清与镍柱结合3h。收集流穿液，b缓冲液(20mm三羟甲基氨基甲烷，2m氯化钠,30mm咪唑，ph 7.4)的洗脱液，c缓冲液(20mm三羟甲基氨基甲烷，2m氯化钠，300mm咪唑，ph 7.4)的洗脱液。后通过十二烷基硫酸钠变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳确认洗脱得到的蛋白分子量大小以及纯度。
41.对c缓冲液的洗脱液进行过夜透析处理(透析缓冲液：100mm磷酸氢二钠，50mm氯化钠，ph＝7.4)，得到所需野生蛋白。
42.2.准备a48核酸适配体
43.核酸适配体a48的序列:5
’‑
gctgg atgtc gctta cgaca atatt cctta ggggc accgc tacat tgaca catcc agc-3’(由公司合成)。
44.3.野生蛋白与a48核酸适配体结合前后数据采集与分析
45.进行核磁共振实验表征时所用的n-ntd野生蛋白均溶解于透析缓冲液中，野生蛋白的浓度为0.5mm，a48核酸适配体的浓度为0.6mm。进行二维核磁共振谱图的采集时在样品溶液中加入10％(v/v)的d2o。所有实验均在bruker avance 600mhz、700mhz或900mhz谱仪上采集。实验温度为298k与308k,采集的谱图用topspin 3.2进行处理,用软件cara分析。将n-ntd结合a48核酸适配体前后的核磁谱图进行叠加对比，能够直观地发现n-ntd在结合a48核酸适配体后，在
15
n的80-90ppm化学位移范围出现了结合前未出现的9个精氨酸侧链交叉峰信号。如图3所示，a)精氨酸侧链交叉峰特征信号区域，出现结合前未出现的9个交叉峰信号(黑色)。b)n-ntd蛋白(灰色)与n-ntd-a48复合物(黑色)的1h-15
n hsqc图谱的覆盖。
46.根据野生型n-ntd与a48核酸适配体结合前后的核磁共振谱图的对比结果，两者在结合后出现了9个结合前没有的精氨酸侧链交叉峰。
47.4.单精氨酸位点突变为赖氨酸的突变体蛋白与a48核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图数据
48.将n-ntd蛋白内包含的15个精氨酸位点分别突变为赖氨酸，得到15个突变体蛋白(r10k n-ntd；r14k n-ntd；r32k n-ntd；r36k n-ntd；r40k n-ntd；r41k n-ntd；r68k n-ntd；r88k n-ntd；r89k n-ntd；r92k n-ntd；r93k n-ntd；r95k n-ntd；r107k n-ntd；r149k n-ntd；r177k n-ntd)，其中数字表示突变的氨基酸位点序号，具体位置如图2b中标灰的精氨酸位置。
49.突变体蛋白编码序列利用pet-28a( )作为载体，在大肠杆菌e.coli bl21(de3)中进行诱导表达。突变体蛋白表达和纯化步骤同野生型n-ntd蛋白。
50.r-k突变体蛋白与a48核酸适配体结合后的数据采集与分析：
51.进行核磁共振实验表征条件与参数同步骤2。
52.在二维1h-15
n hsqc谱图中，
15
n的化学位移为80ppm处可以观察到精氨酸侧链的信号。
53.通过单点突变并与核酸适配体滴定进行对比完成侧链归属。
54.将精氨酸突变为赖氨酸后侧链信号会移动到40ppm范围处，而精氨酸和赖氨酸均为碱性氨基酸，对核酸适配体和蛋白质的结合影响较小。
55.5.对比野生型蛋白与a48核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图数据和单点突变蛋白与a48核酸适配体结合后的二维核磁共振谱图数据
56.两张图对比消失的唯一信号或多信号消失，即判定为突变的氨基酸。
57.15个突变的n-ntd结合a48核酸适配体后的谱图，与野生型n-ntd与a48核酸适配体结合后的谱图相比，出现了以下三种结果。
58.1)有7个精氨酸在突变后侧链区域信号没有任何变化(r10；r14；r32；r68；r92；r107，r177)，表明这7个氨基酸不是野生型n-ntd与a48核酸适配体的结合位点(图4)。
59.2)有6个精氨酸在突变后出现了对应单信号的消失(r40；r41；r88；r89；r93；r95)，表明这6个精氨酸参与结合核酸适配体，为关键氨基酸残基(图5)。
60.3)有2个精氨酸在突变后出现多信号的消失(r36；r149)，表明这2个精氨酸不仅是蛋白质与核酸适配体结合的关键氨基酸残基，同时也使得蛋白质结合核酸适配体的方式发生了变化。
61.其中r36位点在突变后，对应的突变蛋白与a48结合时，出现了多个氨基酸信号峰的变化，由此可推出r36为关键精氨酸位点。但也由于多个氨基酸信号峰的变化，r36位点在野生型n-ntd与a48复合物的核磁谱图中无法进行确定性指认(图6)。
62.因此，通过该方法可以鉴定野生型n-ntd与a48核酸适配体结合的赖氨酸残基关键位点，结合位点为r36、r40、r41、r88、r89、r93、r95、r149。
[0063][0064]
上式为精氨酸的侧链。n
ε
为氮原子，co为氢原子，在hsqc谱图中显示信号。
[0065]
如图4所示，n-ntd-a48复合物和r-k突变的n-ntd-a48复合物的1h-15
n hsqc图谱的
覆盖，显示了代表arg侧链的区域。子图左上角的标签表示突变的位置。野生型n-ntd和突变型n-ntd都与a48结合。分配值显示在子图中。
[0066]
本发明的有益效果：首次利用多维核磁共振谱图在氨基酸侧链特征信号区域的指纹谱图，结合单位点r-k突变的方式，表征核酸适配体和蛋白质结合时的关键氨基酸残基。采用本发明的方法无需对蛋白质进行三维核磁谱图指认分析，省去大量繁琐的分析过程，快速准确找到蛋白质和核酸适配体的关键氨基酸残基。