肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷在制备抗抑郁药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及的是一种天然产物领域的技术，具体是一种肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷8-表马钱子酸及京尼平苷酸在制备抗抑郁药物中的应用。


背景技术：

2.目前针对抑郁症治疗的主流药物包括三环类药物(tcas)、单胺氧化酶抑制剂(maois)、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制(snris)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(ssris)、去甲肾上腺素和特定5-羟色胺再摄取抑制剂(nassas)。这些药物除了存在抗抑郁谱窄、起效时间慢、价格昂贵等缺点外，更需值得注意的是，长期服用这些药物会造成心脏毒性、低血压、性功能障碍、体重增加、睡眠问题和戒断综合征等副作用，严重降低患者的生活质量。因此，近年来，从中草药中寻找有效、安全的抗抑郁药物已成为国内外研究的重要方向。
3.目前人们普遍认为肉苁蓉中具有神经保护作用的成分是苯乙醇苷类化合物，如松果菊苷、毛蕊花糖苷等，忽略了其中环烯醚萜苷类成分的潜在活性。8-表马钱子酸(8-epiloganic acid)及京尼平苷酸(genipisidic acid)均为十碳骨架环烯醚萜苷，是肉苁蓉中一类主要的环烯醚萜苷类化合物，而有关肉苁蓉中8-表马钱子酸、京尼平苷酸在抗抑郁的应用研究均未见报道。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷在制备抗抑郁药物中的应用。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：
6.本发明涉及一种抗抑郁药物，由肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷类成分8-表马钱子酸或京尼平苷酸与药学上可接受的载体组成。
7.本发明涉及一种肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷类成分8-表马钱子酸或京尼平苷酸在制备用于治疗由体内皮质酮异常所引起的神经系统疾病药物中的应用，其可通过改善神经细胞线粒体膜电位水平、结构受损情况及能量代谢紊乱，从而抑制神经细胞凋亡。
8.更具体地，本发明体内试验结果显示8-表马钱子酸或京尼平苷酸均能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾试验的不动时间，且不影响其自主活动能力，可用于抗抑郁药物的制备。
9.本发明涉及一种肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷8-表马钱子酸或京尼平苷酸在制备抗抑郁药物中的应用，将8-表马钱子酸，即或京尼平苷酸，即
用于制备抗抑郁药物中。
10.所述的肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷8-表马钱子酸或京尼平苷酸可改善皮质酮异常引起的神经细胞损伤。
11.所述的改善是指：通过改善细胞线粒体膜电位水平、结构受损情况及能量代谢紊乱，从而抑制皮质酮异常引起的神经细胞凋亡。
12.所述的肉苁蓉十碳骨架环烯醚萜苷8-表马钱子酸或京尼平苷酸在体内能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾试验的不动时间，且不影响其自主活动能力，可用于抗抑郁药物的应用。
13.所述的8-表马钱子酸或京尼平苷酸，可与药学上可接受的载体混合，用于制备抗抑郁药物中。
14.所述的8-表马钱子酸或京尼平苷酸可以作为活性成分与其他天然活性成分及药学上可接受的赋形剂或辅料一起用于制备药物组合物，包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液等。
附图说明
15.图1为皮质酮对pc12细胞存活率的作用示意图；
16.图2为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对正常pc12细胞生长情况的作用示意图；
17.图3为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞存活率的作用示意图；
18.图4为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞乳酸脱氢酶释放率的作用示意图；
19.图5为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞凋亡率的作用示意图；
20.图中：a：空白组流式图；b：模型组流式图；c：8-表马钱子酸组流式图；d：京尼平苷酸组流式图；e：细胞存活率统计图；
21.图6为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体膜电位的作用示意图；
22.图中：a：空白组流式图；b：模型组流式图；c：8-表马钱子酸组流式图；d：京尼平苷酸组流式图；e：jc-1单体比例统计图；
23.图7为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体超微结构的作用示意图；
24.图8为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体功能的作用示意图；
25.图中：a：pc12细胞耗氧率随时间变化曲线图；b：基础呼吸值统计图；c：最大呼吸值统计图；d：atp产生统计图；e：备用呼吸能力统计图；
26.图9为8-表马钱子酸或京尼平苷酸对小鼠游泳不动时间、悬尾不动时间及旷场总路程的作用示意图。
具体实施方式
实施例1
27.本发明中8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用
28.1)实验细胞：低分化pc12细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
29.2)实验材料：8-表马钱子酸、京尼平苷酸(成都德思特生物技术有限公司)；rpmi-1640培养基(gibco公司)；胎牛血清(corning公司)；cck-8(proteintech公司)；dmso(solarbio公司)；annexin v-fitc/propidium iodide(pi)凋亡、乳酸脱氢酶(ldh)、线粒体膜电位(jc-1)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；seahorse xf线粒体压力测定试剂盒(agilent公司)；皮质酮(上海毕得医药科技有限公司)。
30.3)pc12细胞培养：低分化pc12细胞培养于含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi-1640培养基，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，2-3天传代一次。倒置显微镜下观察细胞生长状态。
31.4)皮质酮损伤pc12细胞模型的建立：取对数生长期的pc12细胞，以细胞数2
×
105/ml接种于96孔培养板内(100μl/孔)，常规培养24h后，随机分为空白对照组、皮质酮损伤模型组，每组设6个平行孔，皮质酮损伤模型组中皮质酮的终浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800μm，以48h为其损伤时间。药物干预完成后，吸掉孔中培养基，每孔加入cck-8溶液与1640培养基以1:10比例新鲜配制的显色液，置于培养箱孵育1.5h后置于酶标仪上450nm处检测每孔od值，并计算细胞存活率。
32.皮质酮对pc12细胞存活率的作用结果见图1(
**
p《0.01，
***
p《0.001vs空白组)。经皮质酮处理后的pc12细胞，其存活率随皮质酮浓度的增加而逐渐降低，依剂量呈线性关系。其中，400μm皮质酮处理pc12细胞48h后，细胞存活率下降至52.41
±
2.03％(p《0.001)，引起约半数的pc12细胞死亡，因此选择400μm皮质酮处理pc12细胞作用48h作为本实验的造模条件。
33.5)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对正常pc12细胞生长情况的作用：取对数生长期的pc12细胞，以细胞数2
×
105/ml接种于96孔培养板内(100μl/孔)，常规培养24h后，分别加入系列浓度(3.125、6.25、12.5、25、50、100μm)的8-表马钱子酸或京尼平苷酸。同时设置空白对照组，每组设6个平行孔。药物干预完成后，吸掉孔中培养基，每孔加入cck-8溶液与1640培养基以1:10比例新鲜配制的显色液，置于培养箱孵育1.5h后置于酶标仪上450nm处检测每孔od值，并计算细胞存活率。
34.8-表马钱子酸或京尼平苷酸对正常pc12细胞生长情况的作用结果见图2(
***
p《0.001vs空白组)。与空白组相比，8-表马钱子酸或京尼平苷酸在3.125、6.25、12.5、25、50μm浓度下对正常pc12细胞的增殖无明显影响，但当8-表马钱子酸或京尼平苷酸浓度升至100μm时，pc12细胞的生长受到明显抑制(p《0.001)，这说明8-表马钱子酸或京尼平苷酸在3.125～50μm浓度范围内对正常pc12细胞的生长无明显毒性。
35.6)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞存活率的作用：取对数生长期pc12细胞，以细胞数2
×
105/ml接种于96孔培养板内(100μl/孔)，常规培养24h后，实验分组及处理如下：
①
空白对照组：不做任何处理，正常培养48h；
②
模型组：400μm皮质酮损伤细胞48h；
③
试验组：分别加入系列浓度(3.125、6.25、12.5、25、50μm)的8-表马钱子酸或京尼
平苷酸预处理后加入400μm皮质酮损伤细胞48h。每组设置6个平行孔。药物干预完成后，吸掉孔中培养基，每孔加入cck-8溶液与1640培养基以1:10比例新鲜配制的显色液，置于培养箱孵育1.5h后置于酶标仪上450nm处检测每孔od值，并计算细胞存活率。
36.8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞的保护作用见图3。8-表马钱子酸或京尼平苷酸在12.5～50μm浓度范围内能显著改善皮质酮诱导的pc12细胞损伤(
**
p《0.01vs模型组)，可分别最大程度提高pc12细胞的存活率至68.43
±
1.51％、77.22
±
1.59％，表现出对皮质酮诱导的神经细胞损伤具有明显的保护作用。
37.7)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞乳酸脱氢酶(ldh)释放率的作用：取对数生长期的pc12细胞，以细胞数2
×
105/ml接种于96孔培养板内(100μl/孔)，常规培养24h，按6)分组及处理48h后，1000r/min离心5min，收集上清液，进行ldh活性测定，方法参照相应试剂盒说明书。
38.如图4所示，经皮质酮处理后，pc12细胞的ldh释放率明显增加(148.75
±
2.35％，
***
p《0.001vs空白组)；而给予12.5～50μm 8-表马钱子酸或京尼平苷酸作用后，pc12细胞的ldh释放率明显降低(
*
p《0.05vs模型组)，其可最大程度降低pc12细胞的ldh释放率至138.28
±
3.89％、123.48
±
1.45％，表现出其可明显地抑制皮质酮造成的神经细胞ldh的过度释放。
39.8)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞凋亡率的作用：取对数生长期pc12细胞以5
×
105个/孔接种于6孔培养板内，培养24h后，实验分组及处理如下：
①
空白对照组：不做任何处理，正常培养48h；
②
模型组：400μm皮质酮损伤细胞48h；
③
试验组：加入25μm 8-表马钱子酸或京尼平苷酸预处理后加入400μm皮质酮损伤细胞48h。每组设置复孔3个。药物干预完成后，用不含edta的胰酶消化，并用pbs洗涤细胞2次，收集相应细胞于ep管中。每管加入500μl的binding buffer悬浮细胞，加入5μlannexin v-fitc混匀后,再加入5μl碘化丙啶(pi)，经混匀、室温避光反应15min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
40.如图5所示，经皮质酮处理48h后，pc12细胞凋亡率增加，总凋亡率高达30.50
±
0.79％，明显高于空白对照组(2.97
±
1.20％，
###
p《0.001vs空白组)；经25μm 8-表马钱子酸或京尼平苷酸处理后的pc12细胞凋亡率可分别显著降低至11.18
±
1.19％、12.11
±
2.23％(
***
p《0.001vs模型组)，表明8-表马钱子酸或京尼平苷酸可降低皮质酮诱导的神经细胞凋亡。
41.9)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体膜电位(mmp)的作用：取对数生长期pc12细胞以5
×
105个/孔接种于6孔培养板内，培养24h，按8)分组及处理48h后，用不含edta的胰酶消化，用pbs洗涤细胞2次，收集相应细胞于ep管中。每管加入1ml jc-1工作液及培养液，混匀且37℃避光反应20min后，经jc-1染色缓冲液洗涤2次，用流式细胞仪检测细胞内mmp水平。
42.如图6所示，经皮质酮处理48h后，pc12细胞的mmp较空白对照组显著降低(
###
p《0.001vs空白组)；与模型组相比，25μm 8-表马钱子酸或京尼平苷酸可分别显著提高pc12细胞的mmp水平(
***
p《0.001vs模型组)，这表明8-表马钱子酸或京尼平苷酸可有效缓解皮质酮诱导的pc12细胞线粒体膜电位异常。
43.10)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体超微结构的作用：取对数生长期pc12细胞以2
×
106个/皿细胞接种于10cm培养皿中，培养24h，按8)分组及处
理48h后，以2.5％戊二醛固定12h，经脱水、环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色后用透射电镜观察pc12细胞内线粒体形态结构变化。
44.如图7所示，在空白对照组中未发现线粒体肿胀或嵴消失，线粒体处于正常形状；但经皮质酮处理的pc12细胞中很容易发现具有嵴消失的肿胀线粒体，结构松散，部分甚至呈空泡状；而经25μm 8-表马钱子酸或京尼平苷酸处理后pc12细胞的线粒体受损结构有明显改善，这表明8-表马钱子酸或京尼平苷酸可有效改善皮质酮诱导的pc12细胞线粒体结构受损情况。
45.11)8-表马钱子酸或京尼平苷酸对皮质酮损伤pc12细胞线粒体功能的作用：使用seahorse xfe96细胞能量代谢分析仪和seahorse xf线粒体压力测定试剂盒分析细胞线粒体耗氧率(ocr)。在测定之前，取对数生长期pc12细胞以6
×
103个/孔接种于96孔xf板，培养24h后，按8)分组及处理48h后，根据试剂盒说明书，制备测试化合物，包括1μm寡霉素溶液、2μm fccp溶液和0.5μm rot/aa，并实时测量ocr等线粒体能量代谢参数。
46.如图8所示，经皮质酮处理的pc12细胞表现出明显的线粒体功能障碍，导致基础呼吸值、最大呼吸值、atp产生、备用呼吸能力分别显著降低了40.39％、40.41％、49.99％、47.98％(
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p《0.001vs空白组)。而经25μm 8-表马钱子酸处理后可明显恢复pc12细胞的备用呼吸能力(
*
p《0.05vs模型组)，经25μm京尼平苷酸处理后则可明显恢复pc12细胞的基础呼吸值及atp产生(
*
p《0.05vs模型组)，这表明8-表马钱子酸或京尼平苷酸可明显改善皮质酮诱导的pc12细胞线粒体能量代谢紊乱。实施例2
47.8-表马钱子酸或京尼平苷酸体内抗抑郁作用研究：以行为绝望小鼠模型验证
48.1)实验动物：雄性icr小鼠，体重18～20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。每5只/笼群养，自由摄食饮水，12h照明，温度25
±
2℃，相对湿度55
±
10％，适应性饲养1周后进行分组，动物实验遵守国际动物实验伦理学要求。
49.2)分组与处理：将正常小鼠按体重随机分成4组，每组10只，即空白对照组、阳性药丙咪嗪(10mg/kg)组、8-表马钱子酸(30mg/kg)组、京尼平苷酸(30mg/kg)组。各组均按0.1ml/10g体重腹腔注射给予相应药物或空白溶剂，每日1次，连续7天。
50.3)旷场实验：于给药第8天进行旷场实验，小鼠给药30min后，将小鼠独立放于旷场箱中央，实验人员远离旷场装置，避免干扰，录像5min，统计小鼠5min内的行进总路程。每只小鼠测试完毕后清理旷场箱，喷洒医用酒精，擦净。
51.4)悬尾实验：于给药第9天进行悬尾实验，小鼠给药30min后，将实验鼠尾尖2～3cm处固定于悬尾装置横杆上，头部距底部约20cm，录像。悬挂时间为6min，统计后4min内实验鼠累计不动时间用于评价其对绝望环境的反映。不动的标准是实验鼠停止挣扎且保持身体垂直悬挂。
52.5)强迫游泳实验：于给药第10天进行强迫游泳实验，小鼠给药30min后，将其置于高20cm，直径10cm的有机玻璃缸中，其中放入20～22℃的水，在其后肢不能依靠装置底部以支撑身体时，进行强迫游泳实验，录像。强迫游泳时间为6min，统计后4min内实验鼠累计不动时间用于评价其对绝望环境的反映。不动标准为除为避免没入水中的主动运动外,无其他行为。
53.如图9所示，各组小鼠旷场实验行进总路程均无明显差异，表明所有试验药物均无
神经兴奋或抑制作用。与空白组相比，给予丙咪嗪(阳性药)后，小鼠的游泳及悬尾不动时间分别降低了60.60％(
***
p《0.001vs空白组)和33.45％(
*
p《0.05vs空白组)；经8-表马钱子酸处理后小鼠的游泳及悬尾不动时间分别降低了41.98％(
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p《0.01vs空白组)和26.59％(
*
p《0.05vs空白组)，经京尼平苷酸处理后小鼠的游泳及悬尾不动时间分别降低了39.74％(
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p《0.01vs空白组)和39.86％(
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p《0.01vs空白组)，表明8-表马钱子酸或京尼平苷酸均具有较好的抗抑郁效果。
54.上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。